Методика экран американский Бук на устойчивость к Бук Scale насекомых (<em&gt; Криптококк fagisuga</em&gt; Линд.)

Резюме

Бук заболевания коры инициируется путем подачи деятельность бук масштабного насекомого, которые создают грибковые точки входа в коре. Деревья, которые устойчивы к масштабной насекомого также устойчивых к болезням. Здесь мы представляем протокол мы разработали для скрининга отдельных буковые деревья для бук масштабного сопротивления.

Аннотация

Бук кора болезнь (BBD) приводит к высоким уровням начальной смертности, оставив выживших деревьев, которые сильно ослабленных и деформированных. Заболевание инициировали путем подачи деятельность инвазивной бук шкалы насекомых, Cryptococcus fagisuga, который создает точки входа для заражения одного из видов Neonectria гриба. Без масштабного заражения, существует мало возможностей для грибковой инфекции. Использование масштабные яйца искусственно заражают здоровые деревья в значительной степени BBD затрагиваемых стендах показали, что эти деревья были устойчивы к масштабной насекомых части комплекса болезней ^1. Здесь мы приводим протокол, который мы разработали, основанный на технике искусственного заражени Хьюстон ^2, которые могут быть использованы для скрининга устойчивых масштабных деревьев в этой области и в небольших горшках рассады и трансплантатов. Идентификация масштабных устойчивых деревьев является важным компонентом управления BBD через деревопрограммы улучшения и лесоводственной манипуляции.

Введение

Бук заболевания коры (BBD) оказало пагубное воздействие на американской бука в Северной Америке с момента введения инвазивного бук масштабного насекомого, Cryptococcus fagisuga, в канадской провинции Новая Шотландия в конце 1890-х годов ^3. Этот комплекс насекомых болезнь начинается, когда бук масштаб насекомое вставляет его подачи стилет в кору, создавая небольшие трещины, которые обеспечивают подъезде для инфекции одним из видов Neonectria гриба (Neonectria ditissima или Neonectria faginata). Как грибковые мицелий растет, большие площади ткани могут умереть, в конце концов полностью кольцевание дерево. Ущерб от этой болезни ослабляет дерево, что делает его склонным к щелкая при сильном ветре ^4. Уровни смертности в первой волне заболевания были зарегистрированы, чтобы быть выше, чем 50% ^5. Выжившие деревья часто сильно деформируется, как язвы образуют снижения стоимости дерева как изделий из древесины.0; Такие деревья имеют склонность к корневой прорастания, что приводит к образованию "буковых зарослях", которые мешают другие, более желаемые виды от установления, уменьшая экономическую и экологическую ценность стенде ^6. Хотя бук болезнь кора не может привести к исчезновению американской бука, он изменяет стоять состав и здоровье приводит к уменьшению продуктов питания и среды обитания для диких животных ^7,8.

В стендов, пострадавших от BBD в течение многих лет, были зарегистрированы деревья, которые остаются без каких-либо симптомов заболевания. Искусственные испытания прививки показали, что эти деревья устойчивы к масштабной насекомого ^2. Без масштабного заражения, существует мало возможностей для Neonectria инфекции, минимизации воздействия гриба. Крупномасштабное смертности в американской бука из-за Neonectria инфекции в отсутствие до масштабного заражения ни разуСообщалось, поэтому устойчивость к бук масштабных насекомых приводит к устойчивости к BBD.

Недавние исследования в области управления BBD была сосредоточена на выявлении, распространения, селекции и хранения американских бука с устойчивостью к бук масштабного насекомого. Генетические исследования показали, что устойчивость к масштабной насекомого наследуется и тщательный отбор и разведение устойчивых деревьев может привести к значительному улучшению жизни одного поколения ^9. Этот вывод вызвал усилия государственных и национальных лесных менеджеров в США по созданию региональных семенных плантаций из стойкого американского бука, чтобы обеспечить источник генетически разнообразной BBD устойчивостью семян для восстановления насаждений ^10,11. Исследования также показали, что лесоводственной манипуляция генетики стенда путем удаления восприимчивых деревьев и сохранения устойчивых деревьев может привести к стенда улучшение ^9,12.

Управление BBD через деятельности по улучшению деревьев или путем проведения лесохозяйственных рецепты требуется возможность выбора для и различать буковых масштабных-стойкие и восприимчивы деревьев. Методы, представленные здесь, были адаптированы из метода впервые введена Дэйв Хьюстон, чтобы искусственно привить сеянцы с бук масштабных яиц ^1. Способ может быть использован в качестве скрининга для выявления локусов количественных признаков (QTL), связанное с сопротивлением или различать устойчивых и чувствительных горшках проростков или привитыми ramets в генетических исследований. В качестве альтернативы, он может быть использован для скрининга взрослых деревьев в области идентифицировать резистентных деревьев для развития семян фруктовый сад, или удержания в этой области. Восприимчивые деревья могут быть обнаружены и удалены, чтобы минимизировать последствия заболевания.

протокол

1 завод Материал:. Зрелые поле деревья, Комнатные Рассада, или в горшках трансплантатов

1. Для полевых испытаний, выберите зрелые здоровые американские буковые деревья, которые не проявляют никаких признаков масштабного заражения или заболевания для тестирования на предмет возможного сопротивления. Заметно восприимчивых деревья будут также должны быть определены для использования в качестве контроля (рис. 1).
2. Для тестирования в горшках рассаду или трансплантатов, собирать и прорастают beechnuts, как описано в Кох & Carey, 2004 или трансплантата привоя, как описано в Кэри и др., 2013.
3. Вырастить рассаду или трансплантатов в герметичные почвенной смеси поправками с 47 г микроэлементов, 477 г медленное высвобождение удобрений 15N-3.9P-9.9K, 700 г грубой перлита и 75 г сульфата алюминия на 2,8 куб. футов мешок. При необходимости позднее в период вегетации, удобрения растений еженедельные растворимым 17N-1.3P-14.1K при 200 промилле азота.
4. В период вегетации, сохранить растения в тени дома. Разрешить растения пойти покоя за пределами осенью до переезда ихс контролируемым хранилища температуры (~ 4 ° С) с ноября по апрель.

2. Сбор Beech Scale яйца

1. В BBD-зараженных стенде, осмотрите сильно зараженные деревья (легко определить по их "побелены" внешний вид, фиг.1А) с ручным увеличительное стекло, чтобы подтвердить наличие яиц, как правило, обильные с середины июля до середины августа.
2. Используйте кисть, чтобы аккуратно почистить белые восковые скопления масштабных взрослых насекомых, яйца и другого мусора, в пластиковый герметичный сбора один галлон мешок (рис. 1В). Сбор от минимум трех различных деревьев по крайней мере 12 м друг от друга.
3. При необходимости хранить яйца в запечатанном сбора мешок на срок до двух недель при температуре 4 ° C. Лента небольшой кусок (2,5 см квадрат) из влажной вспененного полиэтилена к внутренней части сумки, чтобы предотвратить яйца от высыхания.
4. Для разделения масштабные яйца (0,15 х 0,25 мм) от взрослых (0,60 мм) и Debriс, построить сито используя короткий кусок 2 'ПВХ трубы и муфты для поддержки квадратный кусок 250 микрон нейлоновую сетку (рис. 2).
5. Слейте смесь взрослых, воска, яиц и мусора из мешка сбора на сито и использовать небольшую кисть, чтобы мягко поощрять яйца пройти через сетку в стеклянную чашку Петри ниже. Блюда Пластиковые Петри следует избегать, поскольку они занимают более статического электричества, что делает его трудно двигаться яйца. Яйца до и после просеивания показаны на рисунке 3.
6. Очищенные яйца можно хранить в чашке Петри при температуре 4 ° С в течение по крайней мере недели. Для предотвращения яйца от высыхания, лента влажную кусок пенопласта на крышке и печать с парафильмом.

3. Яичные жизнеспособности Анализы

1. Чтобы оценить жизнеспособность яиц, используют 10 мл шприц, чтобы нанести тонкий кольцо вазелина по окружности нижней части 60 мм стекл нную чашку Петри (фиг.4А ).
2. Трансфер около 100 яиц в центре кольца, поместите крышку на чашке Петри и печать с парафильмом. Разрешить герметичный чашку Петри, чтобы оставаться в покое при комнатной температуре в течение 2 недель, или 3 недель, если яйца хранили при 4 ° С до начала анализа.
3. Появившиеся нимфы будет застрять в вазелина и может быть легко подсчитаны, и пустые яйца легко отличить от невылупившихся яйца по цвету и блеском (рис. 4В). Рассчитать жизнеспособность путем деления числа нимф на сумму пустых яиц плюс остальных полных яиц. Хорошо жизнеспособность должна быть в 75% до 90% вылупившихся диапазоне яйца.

4. Масштаб Сопротивление Скрининг большой зрелый бука в области

1. Для количественного теста, отсчитывать 500 яиц с использованием рассекает микроскопом и с помощью небольшого шпателя осторожно посыпать их через центре predampened, с открытыми порами 10 х 15 х 1,3 см прямоугольника вспененного полиэтилена. Ксмочить пену, намочите ее затем выжать столько воды, сколько возможно. Для качественного теста, 500 яйца можно пересчитать, и помещают в небольшую стеклянную пробирку и линией "заполнить", проведенной который может быть использован для измерения дополнительных партий примерно 500 яиц.
2. Поместите пенопластовую подкладку на испытательном дерева с яичным стороной против коры. Держите прокладку в месте с веревкой, строки, шпагата или пластиковым покрытием аппаратной проволоки. Пластиковые или металлические основе материал следует использовать, а не природных волокнистых материалов, которые более легко продуваемых дикими животными.
3. Линия сверху и с боков из предварительно нарезанной 23 х 30 см кусок паропроницаемостью водонепроницаемый дом обертывание с использованием ацетатного основе силиконового клея и положите его на тест-пена площадку. Нажмите края дома обернуть к дереву, чтобы создать водонепроницаемость. Наведите нейлона шпагат или пластиковым покрытием аппаратного провод вокруг дерева и дома пленкой, чтобы удерживать его на месте в то время как клей схватывается (рис. 5).
4. Поместите не менее двухтестовые площадки на каждой тестовой дерева, предпочтительно на противоположных сторонах ствола. На каждом участке, место испытательных набивок, по крайней мере два чувствительных деревьев (с очевидным масштаба заражения) в качестве контроля. До размещения тестовые площадки на контрольных деревьев, удалите все природные червецов или яйца, используя фирма зубной щеткой.
   Примечание: Пена колодки с яйцами также могут быть размещены на деревьях с целью разведение масштабных яиц, которые могут быть особенно полезны в тех районах, где уровень заражения низок.

5. Масштаб Сопротивление Скрининг горшках рассады или прививки

1. Для тестирования, выберите в горшках деревья с минимальным диаметром 1 см (сателлитов 5 см выше линии почвы), которые достаточно высок, чтобы иметь по крайней мере 2 отдельных тестовых колодки размещены на них. Чернослив небольшие боковые ветви, когда это необходимо, чтобы освободить место для тестовых площадок.
2. Используйте рассекает микроскоп, чтобы отсчитывать 150 яиц и брось на предварительно нарезанной и смоченной 2,5 х 7,6 х 1,3 см с открытыми порами сумки изЛене пусковая площадка пены.
3. Прикрепите пены клавиатуры саженец с яичным стороной к коре, используя пластиковым покрытием проволоки. Оберните небольшой площади дома обернуть вокруг саженца чуть выше пены и скрепите ацетата основе силикона (см. рис 6А).
4. Включить известно восприимчивых семей рассады или трансплантатов в качестве контроля.

6. Сбор данных

Примечание: Приблизительно от 52 до 57 недель после размещения прокладки пены и яйца на тестовых деревьев, данные могут быть собраны. Важно, что это не делается, пока взрослые начали откладывать яйца, так что их способность воспроизводить может быть определена. На некоторых устойчивых деревьев она не является необычным, чтобы увидеть небольшое количество взрослых установить, но с нет воспроизведение происходит.

1. Осторожно снимите пенопластовую подкладку и подсчитать количество масштабных взрослых насекомых, установленных на коре использовании объектива рук или увеличительное стекло (10X).
2. Когда пена прокладку снимают, это не уncommon для некоторых взрослых и большинстве яичных кластеров, которые будут выдернутыми дерева с пеной (см. рисунок 7). Использование рассекает микроскоп, рассчитывать яичные кластеры и взрослых, которые остались прикреплены к поролоновую подкладку.

Результаты

Фиг.6 показывает устойчивый рассаду (С) и две чувствительные рассаду (D, E), обладающий различной степени восприимчивости. Пример того, что восприимчивы взрослое дерево выглядит как 57 недель после испытания искусственного заражения был создан показан на р?...

Обсуждение

Критические шаги, необходимые для успеха этого анализа включают выполнения теста на жизнеспособность на яйца и использование восприимчивых управления на каждом участке испытания, и в горшках материалов. Важно также, чтобы использовать более одного тестового прокладки в дерево или ра...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nylon Mesh Sheet, 250 micron	Small Parts	CMN-0250-D	Mesh opening size: 250 microns square, % of open area: 34, thread diameter: 180 micron, width: 24”, Length: 12”, Package quantity: 1
Tyvek Home Wrap	DuPont	D1349991	9 ft x 150 ft roll, can ask for it to be cut in half.
Polyethylene foam, ½” thick	Columbus Foam Products		2 ft x 50 ft roll
MetroMix 510	Sun Gro Horticulture		2.8 cu. ft. bark, peat moss, vermiculite, bark ash, starter nutrient charge (with Gypsum), slow release nitrogen and dolomitic limestone.
Osmocote Plus 15-9-12	Everris	E903206	Standard 3-4 month release
Sight Savers 10X	Bausch & Lomb	813434	10X magnification illuminated coddington
Nikon Mini Field Stereoscope	Nikon	7314	20X magnification
Silicone II clear	GE	159538	2.9 oz clear window & door caulk