Понимание начале Органогенез, используя упрощенную<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация Протокола в<em&gt; Xenopus</em

Резюме

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Аннотация

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Введение

The expression pattern of a specific gene is an important piece of information in determining the potential role for that gene in the development of a specific organ or cell type. Simply put, if it is not expressed at the right time and place it is unlikely to play a key role. In Xenopus, as in most early embryos, the most commonly used assay for detecting the expression of a gene is whole mount in situ hybridization using labeled antisense RNA probes. The use of antibody staining to assess expression of a gene in Xenopus is becoming more common as researchers discover antibodies, usually raised against mammalian proteins, that cross react to the Xenopus homologue or generate their own ^1-3. However, the vast majority of studies on Xenopus organogenesis still utilize antisense RNA probes. When antibodies are used, each individual antibody often requires optimization for the primary antibody concentration or fixation protocols. In contrast, the protocol for in situ hybridizations is essentially invariant for different probes. The basic concept is relatively simple and an excellent standard protocol has been well established ⁴. Our protocol is a streamlined version of the original protocol ⁴ that still provides excellent detection of gene expression patterns in the early embryo. The embryos are fixed and then prepared for hybridization by changing solutions and temperatures such that it allows for high stringency binding of the labeled antisense RNA probe to its target mRNA. The unbound probe is washed away and the embryos are then prepared for binding of an antibody against the label on the RNA probes. Excess antibody is then washed away and an enzymatic color reaction is used to localize where the RNA probe is bound in the embryo. There are now a number of Xenopus transgenic lines that drive expression of fluorescent proteins in specific tissues and these are available at the Xenopus stock centers such as the National Xenopus Resource in Woods Hole. While very useful for many experiments that require examining organogenesis in living embryos, this option requires separate housing for the transgenic lines.

In situ hybridization can clearly delineate where specific organs or cell types will form in the early embryo (Figure 1). The technique is remarkably sensitive given that one can detect gene expression in a small number of cells in a single embryo ⁵. However, in situ hybridization using the intensity of colorimetric staining is not considered quantifiable because the color reaction is not a linear one. Despite difficulty in quantifying staining intensity, changes in expression are often quite noticeable; particularly when the in situ hybridization shows quantifiable increases or decreases in the size of expression domains ^6,7.

The clear advantages of whole mount in situ hybridization make it a critical assay in the study of early development. However, it is a time consuming one that requires many steps over several days. This protocol is a simplified version of the standard protocol that eliminates several steps without reducing the quality of the in situ result. The simplification also eliminates sources of variability, making trouble shooting easier if an in situ hybridization is not optimal. Specifically, we have eliminated the use of proteinase K and RNAse treatments of the embryo, two steps that can depend on reagent quality and can also reduce signal intensity if overdone. The protocol also provides some degree of cost saving due to eliminating the use of several reagents. Finally, this protocol also provides some simple guidelines for improved capturing of images of in situ hybridization results. Although this protocol is optimized for work in Xenopus embryos, it is likely that at least some of the simplifications will be applicable to in situ hybridization work in other embryo systems.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Эмбрион Подготовка

1. Если это не сделано регулярно как часть эмбриона культуры, де-желе эмбрионов с использованием 2,5% цистеин, pH 8,0 до фиксации ^8. Хотя это не является абсолютно необходимым, полезно затем вручную удалить оплодотворения конверт до фиксации с использованием тонких щипцов.
   1. Используйте стекло пипетки Пастера перенести эмбрионы. Пипетки не достаточно широким, чтобы передать эмбрионы, так что используйте с бриллиантом перо, чтобы сократить стеклянную пипетку в точке достаточно широким, чтобы забрать эмбрион. Исключите острые края пипетки после резать, быстро передавая вырезать наконечник через пламя горелки Бунзена, чтобы расплавить острые края.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уход должны быть приняты, как стекло может все еще быть достаточно горячей, чтобы вызвать ожоги, хотя это, кажется, охлаждается визуального осмотра.
2. Выполните фиксацию эмбриона в несколько этапов. Во-первых, подготовить стеклянные флаконы для использования в зародыше фиксации. Используйте эти пузырьки на всех этапах, включая финалхранение. Использование флаконов, которые понятны с хорошей уплотнения тефлоновой в крышке, что позволяет для мониторинга эмбрионов во всех этапах процесса. Добавьте флаконы с соответствующей экспериментальной информации с использованием постоянного маркера, а затем покрывают этикетку с четким ленты, так как даже маркером будут потеряны в течение процедуры за счет использования спиртов и других растворителей.
   1. Используйте Mempfa исправить эмбрионов. Сделать запас 8% параформальдегидом в партиях 50-100 мл за один раз. Использование примерно 75% от необходимого H ₂ O и нагревают до 50-60 ° С, что необходимо, чтобы получить параформальдегид в раствор.
      Примечание: данное решение немного отличается от Memfa используется в старых версиях опубликованных протоколов в том, что он использует параформальдегида, а не формальдегида.
   2. Добавьте 2-3 капель 10N NaOH или до тех пор, пока рН не составляет примерно 7,5 (использование лакмусовой бумажки для проверки рН). Параформальдегид очень токсичен, поэтому генерировать исходный раствор в вытяжном шкафу. После того, как параформальдегида в растворе, фильтруют раствор через ватмана в свежем контейнера и добавить H ₂ O до конечного объема. При необходимости хранить параформальдегида раствора при 4 ° С в течение 1-2 недель.
   3. Сборка остальные компоненты раствора фиксации Mempfa (Таблица 1). Убедитесь, что заключительная рабочая концентрация параформальдегида 4%. Хранить все компоненты фиксирующего раствора при 4 ° С в запасах.
   4. Используя стеклянную пипетку вырезать, исправить эмбрионов путем добавления эмбрионов с меченым стеклянные флаконы, которые были заполнены с приблизительно 3-4 мл раствора Mempfa (Таблица 1). Избегайте крепления более 20-30 эмбрионов в пузырек. Добавить эмбрионов с минимумом жидкости передачи из эмбриона среды. Исправить эмбрионов в растворе Mempfa в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
   5. За несвоевременное энтодермы структур выполнять в Situs вручную изолированных кишечных и энтодермы производных ^9,10, Который позволяет для хорошего проникновения зонда, а также предотвращает окрашивание полости.
   6. Хранить раствор 100% метанолом при -20 ° С. После фиксации параформальдегидом, замените решение Mempfa приблизительно с 4 мл -20 ° C, 100% метанола для хранения эмбрионов.
   7. Вихревой флаконов после добавления метанола, чтобы предотвратить эмбрионов от прилипания к стеклу или других эмбрионов. Кроме того, убедитесь, что флаконы плотно закрытыми, потому что метанол может испариться в морозильной камере в течение долгого времени, если свободно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы могут храниться в течение по крайней мере года, и, вероятно, больше, в метаноле перед окрашиванием без потери качества гибридизация.

2. Зонд Подготовка

1. Использование 1-2 мкг матричной ДНК, чтобы сделать дигоксигенином-меченых зондов. Сокращение плазмиду, содержащую ДНК-последовательность, соответствующую по 5'-концу гена интереса рестриктазой подходит для Тат вектор для создания антисмысловых зондов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: плазмиды должны иметь соответствующий РНК-полимеразы сайт связывания (например, T7, T3 или SP6).
2. Разрешить ДНК, вода, NTP смешивать и полимеразной буфера нагреться до комнатной температуры перед сборкой реакции синтеза зонда. Добавить компоненты реакции синтеза РНК в 1,5 мл микроцентрифужных трубки в порядке, как указано в таблице 2. Настройка громкости добавленной воды, чтобы довести общий объем реакции синтеза зонд 20 мкл. Сборка реакцию при комнатной температуре, потому что компоненты буфера полимеразы может осадить ДНК шаблона, когда в высоких концентрациях и холода.
3. Инкубируйте реакции транскрипции в течение 2 ч при 37 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубации чуть больше чем за два часа не приводит к неблагоприятным последствиям, но и показать несколько увеличился урожай. Если инкубировали в течение одного часа, выход будет снижена, но все еще достаточно, чтобы сделать хорошее зонд.
   1. В ожидании реакции транскрипции до конца, сделать агарозном геле, который будет использоваться для проверки качества зонда. Melt 1 мкг агарозы в 100 мл 1x TAE буфер (таблица 1) при нагревании раствора до температуры кипения. Удалить решение от тепла, когда агарозном порошок полностью не растворится.
   2. Добавить 2 мкл этидий бромида исходного раствора (10 мг / мл) до приблизительно 100 мл агарозном геле агарозы при остынет до около 60 ° С, чтобы позволить визуализацию РНК под действием ультрафиолетового (УФ) света.
      Примечание: Этот раствор агарозном геле можно хранить в 60 ° C инкубаторе с тем, что будущие гели можно вылить без повторного плавления. Будьте осторожны при обращении с бромид этидия из-за потенциальной токсичности.
4. Добавить 1 мкл (DNAseI РНКазы сорт) к реакции транскрипции после 2 ч инкубации и инкубировать еще в течение 10 мин при 37 ° С, чтобы исключить матричной ДНК.
5. Удалить 1 мкл реакционной смеси, чтобыпроверить на 1% агарозном TAE геле-и остальной (20 мкл) добавляют 80 мкл 1% SDS в ТЕ буфере (10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), 10 мкл 5 М NH ₄ ацетат и 220 мкл холодного этанола. Vortex смесь энергично и отложите в сторону на льду, пока результаты проверки качества РНК не известны.
   1. Запустите 1 мкл РНК удалены перед осаждением на 1% агарозном TAE геле. Чтобы облегчить нагрузку на геле, добавить 4-5 мкл воды и 1 мкл стандартного загрузочного красителя к РНК. Просмотр РНК на геле с использованием УФ-света просвечивания для проверки качества зонда (см обсуждение).
6. Осадок оставшуюся РНК, которая была установлена ​​в сторону на льду в шаге 2,5 спиннинг в микроцентрифуге при полной скорости в течение от 10 до 15 мин. Откачать супернатант с вытянутой стеклянной пипетки и позволяют немного высохнуть.
   1. Ресуспендируют зонд 1 мл РНК гибридизации буфера (таблица 1) в пробирку Эппендорфа. Vortex и шiefly нагрева трубки до 37 ° С и снова вихрь. Перенесите раствор зонда для 15 мл завинчивающейся полистирола трубку и заполнить до 7-10 мл с РНК-гибридизации буфера. Примечание: датчик может быть разбавлен дальше (10 раза дополнительное разбавление все еще может работать) часто приводит к низким уровнем фона, но реакции окрашивания также занять больше времени.

3. В гибридизация

1. Возьмем эмбрионов, которые были сохранены в -20 ° C метанола и дают нагреться до комнатной температуры. Выполните всю процедуру в стеклянных флаконах. Если разные эмбрионы из одной группы будет посмотрел на различных зондов, не храните их в одном флаконе только перед зонды добавил, чтобы уменьшить изменчивость и труда в первый день.
   1. Увлажняет эмбрионов через ряд метанола, как описано в таблице 3 (см таблицу 1 для стирки рецептов) в рамках подготовки к добавлением зонда. Аккуратно вихревой ЭмбриОС после каждого изменения, чтобы гарантировать, что они не выступает в стороны или друг с другом, и рок эмбрионов путем установки флаконов на nutator. При передаче жидкости, проверьте внутреннюю часть крышки, чтобы убедиться, что эмбрионы не были в ловушке там.
   2. После того как в растворе зонда, гибридизацию в течение ночи эмбрионов, как описано в таблице 3.
2. Удалить раствор зонда. Сохранить используемого зонда при хранении в 15 мл завинчивающейся полистирола трубки, отмеченные даты и количество раз зонд была использована, при -20 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: же зонд может быть использован повторно много раз для последующего в точке гибридизации до колориметрические реакции не начать принимать аномально много времени, чтобы достичь желаемой интенсивности.
   1. После того, как зонд удален, подготовки эмбрионов для окрашивания антител против зонда через серии промывок, описанных в таблице 4. Изменение температуры по мере необходимости (таблица 4), перемещая тон nutator, с пузырьками эмбрионов, прикрепленных непосредственно в гибридизации печи, которые установлены до соответствующей температуры.
   2. Составляют соответствующий объем MAB + HTSS + BR + анти-Dig антитела (таблица 4) в то время, что эмбрионы инкубируют в МАВ + HTSS + BR блокирующего раствора таким образом, что антитело до их добавлением к эмбрионов. Сделать блокирующие растворы свежего в день использования.
3. Удалить раствор антител и начинают моет, как показано в таблице 5 следующей инкубации в течение ночи с антителом. Выполнение по крайней мере, двенадцать 30 мин промывки с целью подготовки для окрашивания с щелочной фосфатазы подложки и уменьшить фон в максимально возможной степени. Используйте либо буфер МАБ или раствор ТБТ (таблица 1) на стадии отмывки.
   Примечание: раствор ТБТ является TTW, который имеет 2 мг / мл BSA добавляли.
   1. Заменить последнее промывочного раствора с БМ Фиолетовый щелочной фосфатазы подложки. Выполните окрашивание Reacции на любом комнатной температуре или 37 & deg; С.
      Примечание: Окрашивание более быстро при 37 ° C, но если оставить на ночь, неприемлемы фоновое окрашивание часто может быть результатом. Реакции окрашивания будет часто требуют окрашивания в течение ночи и при комнатной температуре является самым безопасным выбором.
   2. Если в дальнейшем окрашивание не требуется, и пурпурный раствор BM берет на себя синим цветом, замените окрашивания раствора с пресной BM Фиолетовый и поставить пробирки в 37 ° C. Если целевой мРНК очень обильным, поместить эмбрионов в окрашивающего раствора при 4 ° С в течение ночи, а затем перейти эмбрионов до комнатной температуры или 37 ° С для улучшения мониторинга реакции окрашивания.
   3. Тщательно отслеживать новые реакции, как время окончательного результата значительно варьируется между различными целевыми РНК. Для согласованности, остановить реакцию окрашивания (см 3.4), когда нет никаких новых сайтов выражения, возникающие с более инкубации. Важно отметить, что, если в гибридизация используется в качестве тестадля экспериментов, глядя на различных группах лечения, использовать то же самое время для цветных реакций между опытной и контрольной эмбрионов.
4. Остановить реакцию окрашивания и подготовки эмбрионов для хранения и записи изображения путем изменения жидкости, как указано в таблице 6. Не раскачивайте эмбрионов на этой стадии, потому что удаление пятна можно представить в виде пурпурная окраска метанола вокруг эмбрионов.
   Примечание: Часто эмбрионы имеют светло-голубой окраски с раствором окрашивающего и холодным метанолом может, по меньшей мере, частично удалить, что, хотя это и не является достаточным, чтобы удалить тяжелую фона или окрашивание полости. Холодным метанолом относится к метанола, который поддерживается в -20 ° C морозильнике.
   1. Увлажняет эмбрионов и исправить пятно Mempfa (таблица 6). После того, как фиксированной, удалите Mempfa и мыть эмбрионов с 25% метанола.
   2. Снимите 25% метанола и добавляют отбеливающий раствор, если удаление эндогенного пигментанеобходимо. Будьте осторожны при обращении с отбеливающий раствор, как это может привести к ожогам. Обратите внимание на отбеливание тесно, как это происходит относительно быстро и степень отбеливания может варьироваться для разных эффектов (рисунок 2).
   3. Дегидрировать эмбрионов через метанол серии до 100% метанола для длительного хранения следующих отбеливания, или передать PBS для кратковременного хранения и последующей обработки изображений (табл 6).

4. визуализации Эмбрионы

1. После того, как эмбрион завершила процесс окрашивания, изображение эмбриона, так что информация о том, где интерес ген экспрессируется в плен для более широкой аудитории. Используйте 1% агарозном в качестве фона, чтобы посмотреть непогашенные эмбрионов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: агарозы дает синий / серый фон, который хорошо контрастирует с эмбриона и синего цвета реакции окрашивания. Это также помогает диффузного отвлекающие тени и отражения, которые отвлекают внимание от эмбриона.
   1. Добавить в агарозном в воду и затем довести до кипения, пока агарозном находится в растворе, а затем дайте остыть до 50 перед заливкой в ​​чашке Петри. Как и в раствор геля TAE, хранения раствора агарозы в 55 ° C инкубаторе в течение нескольких целей. Налейте агарозы на глубину около 2 мм в чашках Петри. При необходимости, регулировать глубину агарозы с получением слегка иначе оттенок фоне.
   2. После регидратации из хранилища в метаноле с водным раствором (PBS) или TTW, используя ряд метанол, поместить эмбрионов в чашке Петри с агарозном базы (табл 6). Держите решение чистым и если необходимо, использовать простой фильтрации для устранения мелких частиц вещества, которые могут нарушить чистый фон хороших изображений.
   3. Для изображения эмбрионы из альтернативных взглядов, например, от вентральной стороне, нарезать тонкими каналами в агарозы, чтобы соответствовать эмбриона с использованием тонких щипцов и поместите эмбрионы в этих каналов для ориентации (рис 3 ). Будьте внимательны, манипулируя эмбрионов, поскольку они легко повреждаются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство ступени имеют характерный позицию, что они берут на себя, когда помещали в раствор. Например, зародыши бластула-стадии, как правило, сидят на животных стороной вверх. После того, как эмбрионы начинают удлиняться, они лежали на их стороне.
2. Используйте волоконно источник оптического света, чтобы осветить эмбрион из малым углом, создавая тени на эмбрион, которые обеспечивают глубину изображению и помочь распознать поверхностные структуры. Потому что отбеливание может устранить пигмент, который содержит полезные ориентиры, использовать теневое копирование для сильно обесцвеченных эмбрионов.
3. Снимите эмбрионов окрашивания образа, который глубоко внутри эмбриона, например, в хорде, легких, или областей мозга, (рисунок 4). Чтобы достичь этого, не поставить эмбрионов через серию метанола до 100% в метаноле.
   1. После полного погружения в метаноле, передачи эмбрионов к раствору одной части бензилового спирта и две части бензил бытьnzoate (Бабб). Эмбрионы первоначально будет плавать на поверхности, но, как метанол смешивается с Babb, они будут погружаться в Babb. Выполните каждый шаг, касающийся Бабб в стеклянных флаконах или блюд; Бабб растает любого пластика или краски.
   2. После очистки, просматривать эмбрионов в проходящем свете, идущим снизу эмбриона. Регулировка интенсивность света, а также угол снизу, чтобы улучшить контраст и обеспечивают лучший цвет.
   3. При просмотре очищенные зародыши повысить стеклянную чашку Петри от основания. Сделайте это, просто используя два других чашке Петри крышки, чтобы поднять его так, что область блюдо с эмбрионами повышен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет преимущество в том, базу в фокусе и ликвидации отвлекающие эффекты от несовершенства или пятна на микроскопе базы, которые могут помешать изображения.

5. Дважды в гибридизация

1. Для того, чтобы одновременно видеть паттерн экспрессии TWO различных генов в одной эмбриона, синтезируют два зонда, по одному для каждого из различных генов. Синтезируют один зонд с использованием набора DIG-11-UTP в качестве метки, как описано выше. Развести продукт реакции транскрипции в РНК гибридизации буфера с получением 3-кратным более концентрированный, чем зонд для одного в точке гибридизации.
   1. Обобщить другой зонд интереса используя тот же протокол, для DIG меченых исследовали исключением того, что флуоресцеина-12-UTP должны быть заменены DIG-11-UTP. Развести продукт реакции транскрипции в РНК гибридизации буфера с получением 3-кратным более концентрированный, чем зонд для одного в точке гибридизации.
   2. Смешайте два концентрированных проб в соотношении 1: 1. Для достижения наилучших результатов используйте флуоресцеина-меченным зондом для гена, который показывает сильное выражение в один протокол гибридизация в.
2. Используйте тот же протокол гибридизация в описанной для одного в месте </ EM> гибридизации, за исключением того, использовать двойной зонд (зонд, содержащий концентрированную смесь 1.5x дигоксигенином меченных и меченных флуоресцеином зонды) в конце первого дня вместо одного в гибридизация зонда.
   1. Следуйте один протокол гибридизации на второй день дважды протокола гибридизация в, за исключением использования антифлуоресцеин-AP Fab фрагментов в разведении 1: 4000 в месте анти-DIG-AP Fab фрагментов. Промыть избытка антитела из эмбриона, как в один протокол полевых наблюдений и провести первый цветной реакции с помощью BM-фиолетовый AP субстрата.
3. После первого цветной реакции, инактивируют flourescein антитела в 0,1 М глицина, рН 2,0 в течение 40 мин, а затем на пять десять мин промывок в МАБ. Блок эмбрионов в МАБ + HTSS + BR в течение 90 мин. Добавить антитела анти-DIG при разведении 1: 2000 в MAB + HTSS + BR и инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
   1. На следующий день, мыть эмбрионов йoroughly в МАВ (12 промывок 30 мин), чтобы удалить избыток антитела.
   2. Вымойте эмбрионов в течение 10 мин в ЗС буфера (таблица 1), а затем окрашиваются БХИФ (0,5 мг / мл в АР буфера).
      ПРИМЕЧАНИЕ: в сочетании месте должен дать темно синего-фиолетового пятна на первый цветной реакции и светло-голубой цветовой реакции на второй (рис 5).
   3. Остановка окончательного цветной реакции путем удаления буфера AP и промыть три раза МАВ. Fix эмбрионов с Mempfa в течение 10 мин. Вымойте эмбрионов с 5 быстрых промывок в МАБ или ТБТ.
   4. С этой цветовой комбинации, использование метанола в пост окрашивания лечения уже не возможно, так как это позволит устранить одиночку цвет BCIP. Храните эмбрионов после окрашивания и фиксации в PBS с 0,02% азида натрия. Окрашивание интенсивность, может быть слабым с двойным в места нахождения имущества. Если это является проблемой, уменьшить до четырех промывок, каждое из 2 ч длительности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Использование тканей специфических зондов может обеспечить недостающей информации в отношении состояния развития конкретных органов. В следующих примерах, стадия эмбриона на основе промежуточной таблицы Nieuwkoop и Faber ^11. Если использовать гены зонды формы, выраженные после диффер...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Возможность использования в гибридизация для визуализации характер экспрессии специфических генов остается наиболее широко используемый метод для определения конкретных органов или типов клеток в эмбрионе Xenopus. Это из-за нескольких преимуществ этого метода. Экспрессия ге?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labguake Tube Shakers	VWR	17-08-2011
VWR Vials	VWR	10-07-2012
L-Cysteine	BioShop	CYS342.500
Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM	Roche	11277057001
Digoxigenin-11-UTP	Roche	11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA Polymerase	Fermentas	EPO111
T3 RNA Polymerase	Fermentas	EPO101
SP6 RNA Polymerase	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
Sheep Serum	Wisent	31150
Blocking reagent	Roche	11096176001
BM purple Ap Substrate	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments	Roche	11093274910
Methanol	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.500
Formamide	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
Maleic Acid	VWR	CAMX0100-3
tri-Sodium Citrate	BioShop	CIT001
Hydrogen Peroxide (30% Solution)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Benzyl Alcohol	Sigma	B-1042
Benzyl Benzoate	Sigma	B-6630
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500