Озвучивание при содействии Иммунофлуоресцентное Окрашивание поздней стадии эмбрионального и личиночного<em&gt; Drosophila</em&gt; Ткани<em&gt; На месте</em

Резюме

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Аннотация

Исследования, проведенные в Дрозофилы эмбрионов и личинок обеспечивают решающую понимание процессов развития, таких как спецификации клеточных судеб и органогенеза. Иммуноокрашивание позволяет для визуализации развития тканей и органов. Тем не менее, защитная кутикула, что образует в конце эмбриогенеза предотвращает проникновение антител в эмбрионы поздней стадии и личинок. В то время как рассечение до иммунной регулярно используется для анализа дрозофилы личинок тканей, это доказывает, неэффективны для некоторых анализов, потому что маленькие ткани может быть трудно локализовать и изолировать. Озвучивание предоставляет альтернативу вскрытия в личиночной иммуноокрашивания протоколов дрозофилы. Это позволяет быстро, одновременной обработки большого количества зародышей на поздней стадии и личинок и поддерживает на месте морфологии. После фиксации в формальдегид, образец обрабатывают ультразвуком. Образец затем подвергают иммунным окрашиванием с антиген-специфического первичного муравьевibodies и флуоресцентно меченных вторичные антитела визуализировать типы клетки-мишени и специфических белков с помощью флуоресцентной микроскопии. В процессе обработки ультразвуком, правильное размещение ультразвуковую зонда над образцом, а также от длительности и интенсивности ультразвука, имеет решающее значение. ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ незначительные модификации стандартных протоколов иммуноокрашивания могут потребоваться для высоких пятен качества. Для антител с низким отношением сигнал-шум, более длительное время инкубации, как правило, необходимо. Как доказательство концепции для этого протокола обработки ультразвуком при содействии, мы показываем immunostains трех типов тканей (яичках, яичниках и нервной ткани) в диапазоне стадиях развития.

Введение

Эмбрионы дрозофилы и личинки предоставит прекрасную модель для изучения процессов развития во многих органах и тканях. Визуализация отдельных клеток часто необходимо в этих исследованиях для выяснения сложных условий, в которых клетки развиваются. Визуализация клеток в тканях может быть достигнуто через иммунной окраски. Ну описанных иммуноокрашивания протоколы касаются эмбриональных тканей Drosophila <17 ч после откладки яиц (AEL) ^1-3. Тем не менее, защитные кутикулы формы к концу эмбриогенеза, предотвращая эффективное проникновение антител. Таким образом, эти Иммуноокрашивание протоколы неэффективны при анализе тканей у эмбрионов поздней стадии и на последующих этапах развития личинок ^(1-й возрастной стадии (L1), ^2-й возрастной стадии (L2), и ^3-й возрастной стадии (L3)). Эта неэффективность накладывает барьер для нашего понимания динамических процессов, которые происходят в течение этого длительного периода развития ^4. Tissие рассечение является широко применяется методика, чтобы обойти этот барьер ^5-7. Однако, рассечение может оказаться неэффективным. Добыча может быть обременены трудностями в поиске или выделения эмбриональных и личиночных тканей. Кроме того, физическое удаление ткани-мишени может привести к повреждению путем разрыва их или будучи не в состоянии извлечь их во всей их полноте.

Озвучивание это метод, который использует звуковые волны, чтобы нарушить межмолекулярных взаимодействий. Он был использован нарушить целостность кутикулы личинок Drosophila, чтобы immunostain разработке нейронных типов клеток ^6. Этот протокол был адаптирован для immunostain поздней стадии эмбрионального и личинок половые железы, которые могут быть как малые, как 50 мкм в диаметре ^8-10. С помощью таких исследований, процесс мужской зародышевой линии стволовых клеток (ГСК) формирование ниши был охарактеризован в конце стадии эмбрионов Drosophila ^8-10 и механизмы, регулирующие развитие стволовых клеток и DIFференциации в поздней стадии эмбриональных половых желез и личинок были выяснены ^9-12. Таким образом, обработка ультразвуком обеспечивает эффективную альтернативу рассечения тканей, что может быть трудно, потому что от размера ткани. Кроме того, это позволяет иммунным окрашиванием тканей Drosophila в месте, в результате чего клетки в контексте всего организма и сохранение морфологии на месте. Здесь мы описываем шаг за шагом протокол для флуоресценции иммуноокрашивания поздней стадии эмбрионального через начале / середине L3 тканей в месте. Анализ Drosophila гонадного и нервной ткани показано в Представитель Результаты чтобы продемонстрировать эффективность этого протокола. Кроме того, этот протокол иммунное окрашивание может быть приспособлен для анализа других тканей Drosophila, а также ткани в других организмах с наружным кутикулы.

протокол

1 Подготовка Collection Кейджем

1. Обезболить молодых, плодородные мух с CO _2. Трансфер наркотизированных мух в клетку. Для получения оптимального выхода, используйте 100-120 взрослых мух, начиная от 2-7 дневного возраста в соотношении 4: 1 самок и самцов. Разрешить летит соответствующий период акклиматизации, ~ 24 ч до получения образца для фиксации. Если клетка была создана с девственными женщин в паре с мужчинами, применение 36 - 48 ч акклиматизации период.
2. На открытом конце клетки, поместить предварительно подготовленную яблочный сок агаром с одной дозы размера капли дрожжевого теста в центре над открытием клетке. Тогда, закрепите ленту. Уплотнение стыка между яблочного сока агаром и клетку с парафильмом.
3. Поместите клетку во вторичной емкости яблочный сок с агаром в качестве основы и позволяют мухи, чтобы воспроизвести при определенной температуре в течение определенного периода времени, как определено в эксперименте.
   Примечание: раз взятия пробы Wiбуду меняться. Например, при сборе поздних эмбрионов на стадии ранней / L1 личинок (17 - 24 ч), чтобы мухи, чтобы отложить яйца на яблочный сок чашки с агаром в течение 7 ч при 25 ° С до старения образца в течение 17 ч при 25 ° С. Аналогично, для коллекции середине-конце первого возрастной стадии личинок (36 - 48 ч) позволяют мухи откладывают яйца в течение 12 ч при 25 ° С до старения образца в течение 36 ч при 25 ° С.
4. После того, как период времени будет завершена, нажмите клетку на стол так, что мухи упасть от яблочного сока агаром без анестезии. Быстро заменить используемую пластину на свежую, содержащую каплю дрожжевого теста. Закрепите новую тарелку с лентой и парафильмом и хранить клетку с яблочного сока агаром в качестве основания.
5. Осторожно снимите падение дрожжей от используемого пластины с металлическим шпателем. Место крышка от используемого яблочного сока пластины и позволяют положил эмбрионов возраста, если экспериментально необходимости.
   Примечание: В то время как старение образцы, плиты можно хранить при 25 ° С, если более высокие температуры не ExperimentaLLY требуется. Примеры того, как стареют эмбрионов для коллекции, описанной выше (примечание для шага 1,3). Удаление дрожжей пасты предварительного пробовать старение выполняется для предотвращения личинок от ползания в дрожжах и разбивая агар под. Остальные яблочный сок агар и дрожжи пасты остаток обеспечивают питательными веществами роста личинок. В то время как эмбрионы, установленные непосредственно в дрожжевой пастой теряются за счет удаления дрожжи пасты, эта потеря предпочтительнее дрожжей и агар остатка в образце, что позволяет уменьшить окрашивания эффективность. Если один выбор, чтобы не удалить дрожжевую пасту, дрожжи могут быть сжиженного фосфатным буфером Triton X-100 (PBTx), смешивают с кистью, а затем удаляют из образца с ячейки сетчатого фильтра до фиксации.

2 Фиксация

1. После того, как эмбрионы, установленные на яблочный сок агаром постарели в нужную точку времени, используйте маленькую кисть, смоченную раствором фосфатного буфера Тритон Х-100 (PBTx) тщательно удалить образец из йэ пластины.
   Примечание: Позднее личинки подвижны и могут ползать на внутренней стороне крышки. Этот пример может быть собран аналогично путем удаления с кистью.
2. Протрите образца-Ладена кисть против внутренней стороне хребта ячейки сетчатого фильтра. Тогда, промойте стены сито и кисть с шприц бутылку, содержащую решение PBTx. Поставьте Петри крышку блюдо под сито, чтобы захватить решение PBTx.
3. Ведь образец был передан в сито, влить достаточно PBTx в сито, чтобы поднять образец от сетки. Затем поднимите фильтр и вылейте содержимое чашки Петри на жидкую контейнер для отходов.
4. Повторите шаг 2,3 три раза, чтобы удалить дрожжи и летать отходов, которые могут быть переданы вместе с образца.
5. Налейте достаточно 50% отбеливателя (NaOCl) / воды (DDh ₂ O) решение в сито, чтобы поднять личинок от сетки. Разрешить личинки, чтобы сидеть в растворе в течение 5 мин. Затем поднимите фильтр и вылейте тОн содержимое чашек Петри в жидкой контейнер для отходов.
   Примечание: Отбеливатель требуется только в эмбриональных образцов в возрасте от 0 - 22 ч, с тем, чтобы удалить хорионический мембрану. Применение хлорной извести на старых образцов может быть опущен, но его включение не наносит ущерба. Если упущение желательно, заменить отбеливатель на этом этапе с PBTx. Слабым раствором хлорки следует использовать в течение 24 часов подготовки раствора.
6. Вымойте образец в ситечко с PBTx путем заливки достаточно PBTx в сито, чтобы поднять образец от сетки. Разрешить образца, чтобы сидеть в растворе в течение 3 мин. Затем поднимите фильтр и вылейте содержимое чашки Петри на жидкую контейнер для отходов.
7. Повторите шаг 2,6 пять раз.
8. Dab дно ячейки фильтра сухой, а затем перенести образец в сцинтилляционный флакон, содержащий 1,75 мл раствора PEMS с помощью кисти.
9. Работа в вентилируемом вытяжном шкафу, добавьте 250 мкл 37% формальдегида и 8 мл гептана, содержащую реагенты в сцинтилляционный флакон.
   Примечание: Формальдегид и гептан являются опасными. В целях безопасности, продолжают работать в вентилируемом вытяжном шкафу и носить соответствующую перчатки для шагов 2,9 - 3,3.
10. Разрешить флакон встряхнуть при 200 оборотах в минуту или аналогичного умеренной скоростью в течение 20 мин.
11. Добавьте 10 мл метанола в сцинтилляционный флакон, не удаляя предыдущую водную фазу и позволить, чтобы флакон энергично встряхивают при 500 оборотах в минуту в течение 1 мин.
    Примечание: Метанол является опасным. Продолжайте работать в вентилируемом вытяжном шкафу и носить соответствующую перчатки.
12. Удалить флакон от шейкере и сразу разлить содержимое в ячейки сетчатого фильтра над контейнером жидких отходов в капюшоне. Добавить дополнительный метанол в ампулу и проходить через сито клеток по мере необходимости, чтобы гарантировать, что все образцы были удалены.
    Примечание: Сотовые фильтры могут слить медленно. Чтобы исправить это, прикоснуться лабораторную салфетку, чтобы в нижней части ячейки фильтра, чтобы привлечь раствор через сито быстрее. Метанол, формальдегид, и гептан должны бытьне хранятся в специальных контейнерах с отходами до надлежащей утилизации как за ведомственным руководящим принципам.
13. Сухой нижней части ячейки сетчатого фильтра с помощью лабораторной ткани, затем с помощью кисти, чтобы передать образец захваченного в сито в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 0,5 мл метанола.
    Примечание: Если несколько сцинтилляционных флаконов в использовании, выполните шаги 2,12 и 2,13 один флакон в то время, чтобы предотвратить образец от высыхания на сотовые фильтров.
14. После того, как образец был добавлен в микроцентрифужных трубки, удаления метанола при помощи пипетки. Убедитесь, образец осела на дно пробирки.
15. Промыть образец в микроцентрифужных трубки путем добавления приблизительно 0,5 мл метанола на трубе. Подождите образца урегулирования затем удаления метанола с помощью пипетки.
16. Повторите шаг 15 в три раза.
17. Добавить 0,5 мл метанола к трубе, а затем сохранить в -20 ° C морозильник для последующего использования.

3 Регидратация и Получение образца для Иммуноокрашивание

1. Удаления метанола из трубки микроцентрифужных с помощью пипетки, в результате чего образец в трубке. Магазин метанол отходы в соответствующий контейнер для отходов до момента надлежащей утилизации.
   Примечание: Для повышения эффективности обработки ультразвуком, использовать не более 3 мм образца не поселился в нижней части 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Избыток образца могут быть переданы в отдельную пробирку с помощью пипетки перед началом стадии регидратации выше. Режущий наконечник пипетки с чистым лезвием бритвы может быть использован для предотвращения засорения наконечника пипетки.
2. Добавить 1,0 мл 50% метанол / фосфатный буфер Твин (PBTw) раствора в пробирку и рок в течение 3 мин.
3. Удалить раствора метанола в надлежащем контейнер для отходов и промыть 1,0 мкл PBTw дважды. После каждого полоскания, позволяют образец урегулировать, прежде чем делать от PBTw с помощью пипетки.
4. Добавить 1,0 мл бычьего сывороточного альбумина / фосфатным буферным Tween (BBTw) смешивают в ампулу и породы. Через 3 мин на рокера, позволяют SAMPле урегулировать и снимите BBTw с пипеткой.
5. Повторите шаг 3,4 два раза, заботящиеся чтобы удалить как можно больше BBTw как можно, не теряя образец после последней стирки.
6. Добавить 0,5 мл BBTw к трубе и поместите трубку на льду.

4 Озвучивание образца

1. Установите ультразвукового до 10% максимальной амплитуды и назначить время работы 2 сек постоянной ультразвуком.
   Примечание: Эти настройки являются специфическими для обработки ультразвуком указывается в материалах и оборудования таблице и может потребовать оптимизации для различных sonicators.
2. Перед обработкой ультразвуком образца, очистить ультразвукового зонда, помещая наконечник зонда в 50 мл коническую пробирку, заполненную деионизированной воды и выполнения обработки ультразвуком для очистки зонда. Сухой ультразвукового зонда с лабораторным ткани после запуска.
3. Погрузите зонд в микроцентрифужных пробирку, содержащую образец таким образом, чтобы она располагалась примерно от 3 до 4 мм выше образца и начать ультразвуком.
4. Снимите мicrocentrifuge трубки и поместить его на льду в течение по крайней мере 30 секунд, чтобы рассеивать тепло от ультразвуком и позволяют образец, чтобы поселиться в нижней части трубки микроцентрифужных.
5. Повторите шаги 4.3 и 4.4 мере необходимости, исходя от возраста образца обрабатывается.
   Примечание: Для оптимального объема образца ультразвуком, эмбрионов моложе 17 ч не требуют ультразвуком, но те, между 17 и 24 часами (этап 17 / раннего L1) требуют двух sonications. Личинки между 24 - 36 (в начале / середине L1), 36 - 48 (СЧ / поздно-L1), 48 - 60 (в начале / середине L2), 60 - 72 (СЧ / поздно-L2), 72 - 84 ( рано-L3), 84 - 96 (в начале / середине L3), 96 - 108 (середина / поздно-L3) ч требуют 5, 9, 11, 13, 15, 18, и 22 sonications соответственно. Смотреть обсуждение дальнейшей разработки на время обработки ультразвуком.
6. Промыть 1,0 мл BBTw дважды. После каждого полоскания позволяют образец урегулировать до отвода BBTw с помощью пипетки.
7. Добавить 1,0 мл BBTw во флакон и рок. Через 3 мин на рокера, позволяют образец урегулировать и снимите BBTw с пипеткой.
8. Повторите шаг 4.7 в два раза.

5 Иммуноокрашивание

1. Блок образец путем добавления 5% нормальной сыворотки разбавленный в BBTw в микроцентрифужных трубки. Удалить блок после качалки в течение 1 часа.
   Примечание: Используйте нормальную сыворотку от вида, в котором генерируются вторичные антитела.
2. Развести первичных антител к соответствующим рабочей концентрации в 5% нормальной сыворотки решения / BBTw.
3. Рок образца в начальной O раствора антител / N при 4 ° С или, по крайней мере, 3 часа при комнатной температуре (примерно 22 ° C.
   Примечание: антитела время инкубации и температуры могут различаться. O / N. инкубации при 4 ° С или 3 ч при комнатной температуре, как правило, достаточно. Тем не менее, в течение двух дней инкубационного периода может повысить окрашивания качество, особенно в старых образцов или при низкоаффинные первичные антитела используются. Более длинные инкубации, как правило, проводили при 4 ° С. Аналогичные соображения должны быть сделаны при использовании вторичных антител (см 5,10).
4. Разрешить образец оседают наДно пробирке. Откачать первичных антител с пипеткой. Сохранить антитела для повторного использования при желании.
5. Промыть 1,0 мл BBTw дважды. После каждого полоскания позволяют образец урегулировать до отвода BBTw с помощью пипетки.
6. Добавить 1,0 мл BBTw во флакон и рок. Через 3 мин на рокера, позволяют образец урегулировать и удалить BBTw с пипеткой.
7. Повторите шаг 5,6 пять раз.
8. Блок выборки добавлением 5% нормальной сыворотке решение / BBTw в микроцентрифужных трубки. Удалить блок после качалки в течение 30 мин до 1 часа.
   Примечание: Этот дополнительный этап блокировки не требуется, но может улучшить качество окрашивания для специфических антител.
9. Развести вторичные антитела к соответствующим рабочей концентрации в 5% нормальной сыворотки решения / BBTw.
10. Оберните микроцентрифужную пробирку алюминиевой фольгой для уменьшения обесцвечивания под действием светового излучения. Рок образца в средней раствора антител в течение 12 с 48 ч при 4 ° С или, по крайней мере, 3 часа при комнатной температуре (примерно 22 ° С.
11. Разрешить образец оседают на дне пробирке. Откачать вторичные антитела с пипеткой.
12. Промыть 1,0 мл PBTw дважды. После каждого полоскания позволяют образец урегулировать, прежде чем делать от PBTw с помощью пипетки.
13. Добавить 1,0 мл PBTw во флакон и рок. Через 5 мин на рокера, позволяют образец урегулировать и снимите PBTw с пипеткой.
14. Повторите шаг 5,13 три раза.
15. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Добавить DAPI разбавляют 1: 1000 в PBTw. Рок образца заворачивали в алюминиевую фольгу в течение 3 мин; затем снимите DAPI решение с помощью пипетки. Промыть пять раз с 1,0 мл PBTw, позволяя образец урегулировать, прежде чем снимать PBTw с пипеткой.
16. Добавить 80 - 100 мкл 1,4-диазабицикло [2.2.2] октан раствора (DABCO) в микроцентрифужных трубки и хранить при температуре -20 ° C.
    Примечание: Другой глицерина на основе анти-Fade агент может быть заменен на.

6 Анализ

1. Перед установкой образца на слайды, добавить дополнительный 5 - 10 мкл DABCO / р-фенylenediamine (PPD) Antifade решение микроцентрифужных трубки.
   Примечание: Образец может быть добавлен к слайдов без вскрытия. Объем пробы добавляли к ползуна изменяется в зависимости от размера покровным стеклом. Когда пипеткой образец на слайде, пипетки могут быть обрезаны, используя лезвие, чтобы предотвратить образец стрижку. Часто бывает полезно, чтобы выровнять образец в строках для легкого анализа. Добавление PPD в качестве дополнительного агента Antifade может не потребоваться, но может предотвратить фотообесцвечиванию, если образцы хранятся в долгосрочной перспективе.
2. Аккуратно поместите стекло крышки скольжения над образца. Тогда, безопасный покровное на месте с помощью лака для ногтей.
3. Посмотреть установлен образец с помощью флуоресцентной микроскопии.

Результаты

Для демонстрации эффективности обработки ультразвуком на основе иммуноокрашивания в анализе поздней стадии эмбрионального и тканей личинки в месте, эмбрионы дикого типа и личинки были обработаны для иммуноокрашивания яичек, яичников и нервной ткани. Образцы были обследованы с ?...

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает метод успешно immunostain целевому Drosophila эмбрионального и тканей личинки на месте, тем самым устраняя необходимость для вскрытия. По ранее протоколов для окрашивания ранних эмбрионов ^1,2,3, хорионический мембрану удаляют с помощью 50% отбеливателя (Na...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter