Полуавтоматическая изображений тканеспецифических флуоресценции у эмбрионов данио рерио

Резюме

Описанный здесь это протокол для полу-автоматизированной визуализации тканеспецифической флуоресценции у эмбрионов рыбок данио.

Аннотация

Эмбрионы рыбок данио являются мощным инструментом для крупномасштабного скрининга малых молекул. Трансгенные данио, которые выражают флуоресцентные репортер белки часто используются для выявления химических веществ, которые модулируют экспрессию генов. Химические экраны, которые анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования для скрининга высокое содержание. Мы описываем процедуру с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскоп с моторизованным этапе для автоматической изображения эмбрионов данио рерио и выявления тканеспецифической флуоресценции. Использование трансгенных данио, что отчет о деятельности рецептора эстрогена через выражение GFP, мы разработали процедуру полуавтоматического для выявления рецептора эстрогена лигандов, активирующих репортеру в тканеспецифического образом. В этом видео мы описываем процедуры выстроив эмбрионов данио рерио в 24-48 часов после оплодотворения (ФВЧ) в 96-луночный планшет и добавляя небольшие молекулы, которые связывают рецепторы эстрогена. В 72-96 часов после оплодотворения, образы каждую лунку отвся пластина автоматически собираются и вручную проверять на тканеспецифической флуоресценции. Этот протокол демонстрирует способность обнаруживать эстрогены, которые активируют рецепторы в сердечных клапанов, но не в печени.

Введение

Трансгенные данио были разработаны, которые позволяют прямой визуализации активности в пути, такие как роста фибробластов факторы ^1, ретиноевой кислоты ² и эстрогены ^3, в живых эмбрионов сигнализации. Такие инструменты позволяют скрининг для химических веществ, которые возмущают сигнальных путей (анализировали, как изменение интенсивности флуоресценции) или химических веществ, которые модулируют сигнализации в ткане-специфическим образом (изменение локализации флуоресценции) ^4. Автоматизированный ввод изображений увеличивает пропускную способность химических экранов резко ^5,6. Экраны, которые автоматически анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования. Так называемый скрининг высокого содержания обеспечивает преимущества высокого разрешения, количественного изображений, но за счет использования специализированных читателей пластины оборудованные для конфокальной микроскопии ^7,8. Цель этого метода состоит в автоматическом анализе тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рериов 96-луночный планшет с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскопа. Тканеспецифическая флуоресценции можно отличить с помощью этой техники и может быть разумным подходом для лабораторий, которые не имеют доступа к специализированным читателей пластины или высокой-контент оборудования для досмотра.

В этом протоколе, мы используем автоматизированную изображений для обнаружения тканеспецифической рецептора эстрогена (ER) агонисты в живом рыбок данио в 3 дней после оплодотворения (DPF). Трансгенной линии Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 содержит 5 тандем реагирования эстрогена элементов последовательности ДНК (ЭРД) вверх по течению от зеленого флуоресцентного белка (GFP) ^3. В отсутствие лиганда, ERS обычно неактивны. Связывание лиганда вызывает конформационные изменения, что позволяет рецепторы для связывания ERE ДНК и регулируют транскрипцию ^9. 5xERE: GFP рыба может быть использован для скрининга химических библиотек для ER модуляторов и может быть использован для скрининга образцов окружающей воды для эстрогенных загрязнений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был одобрен Университета Алабамы в Бирмингеме институционального комитета уходу и использованию животных.

1. Данио рерио Разведение и яичные Коллекции

1. За три дня до начала воздействия химикатов, собрать размножения танки с разделителями в отдельных мужчин и женщин. Заполните каждый танк наполовину с системой аквакультуры воды. Использование сети, передавать Tg ​​(5xERE: GFP) ^c262/c262 рыбу рыборазводных аквариумах, размещение 2 мальчика и 3 девочки в каждом баке с перегородкой. Поместите крышку на каждом баке и этикетка с указанием даты и штаммов, которые будут скрещенными.
2. На следующее утро, снять все барьеры и наклона перегородки для создания мелководье на одном конце разведении танк. Разрешить данио к спариванию, сбора эмбрионов на 10-минутные интервалы для обеспечения точного постановку развития. Чистые яйца по полоскания через ситечко с помощью E3B среднего и осторожно промойте эмбрионов в чашки Петри. Вернуться взрослых рыб в постоянноетанки.
3. Использование рассекает микроскопом, сортировать, рассчитывать, и удалите все неоплодотворенные, аномальные или поврежденные эмбрионы. Место эмбрионов в чашках Петри в E3B средних и дома в 28,5 ° C с 14:10 свете: темно-цикла. Плотность эмбрионов может повлиять на развитие. Поместите не более 100 эмбрионов в мм блюдо 100 х 35 и не более 50 эмбрионов в мм блюдо 60 х 15.
4. К 24 часов после оплодотворения, замените носитель с E3B содержащей 200 мкм 1-фенил 2-тиомочевины (ПТУ). ПТУ предотвращает образование пигмента и держит эмбрионов данио и личинок прозрачную для улучшения четкости изображения. ВНИМАНИЕ: концентрированный ПТУ акции опасными; носить перчатки при принятии решения E3B + ПТУ.
5. В 1 день после оплодотворения (DPF), вручную удалить хориона от каждого эмбриона с использованием тонких щипцов. Хорион, кажется, не влияет проникновение эстрогенов, однако удаление увеличивает четкость изображения. Там нет необходимости, чтобы удалить хорионов из средств массовой информации. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы ручной dechorionation, партии эмбрионов может быть чечески dechorionated с использованием 1 мг / мл проназы обработку, как описано выше ^11.

2. Химическая обработка эмбрионов

1. За день до лечения, подготовить исходные растворы каждого химического вещества в концентрации 1,000 раза в ДМСО (или соответствующем растворителе). Например, чтобы выставить эмбрионов до 10 мкм бисфенола А (BPA), подготовить исходный раствор 10 мМ BPA в 100% ДМСО. Это обеспечивает однородную концентрацию ДМСО в каждой обработки и позволяет нетоксичный 1:1000 разбавление ДМСО в качестве контроля транспортного средства. Магазин растворы при температуре -20 ° С. Для этого протокола, эмбрионы будут подвергаться воздействию 1 мкМ и 10 мкМ БФА, 18,5 нМ и 1,85 мкМ генистеина, 367 нМ эстрадиола (положительный контроль) и транспортного средства (0,1% ДМСО, отрицательный контроль).
   ВНИМАНИЕ: Химические вещества, такие как BPA и эстрадиола являются опасными и могут иметь негативное влияние на плода человека. Ручка эндокринные расстройства с осторожностью и всегда использовать средства личной защиты.
2. В день лечения, оттепель подготовлен фондовые химические растворы. Развести 1:1000 с помощью пипетки 1 мл E3B + ПТУ в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавляя 1 мкл складе химического раствора. Vortex энергично. Развести ДМСО 1:1000 в E3B + ПТУ в качестве контроля транспортного средства. С помощью 1 мл E3b + PTU в 1,5 мл микроцентрифужных трубки в качестве необработанного контроля.
3. Использование большого отверстие пластик передачи пипетки, эмбрионы передачи из чашек Петри в каждую лунку 96-луночного планшета, 3 эмбрионов на лунку, 3 скважины в состоянии. Для предотвращения испарения в течение длительного лечения, опустить эмбрионов из внешних строк и столбцов пластины (строки А и Е, колонн 1 и 12). Внешние скважины могут быть заполнены 300 мкл E3B + ПТУ. Этикетка крышку пластины соответствующим образом.
4. Удалить вложение из каждой лунки с тонкой наконечником пластиковые пипетки. Работают быстро, чтобы избежать высыхания эмбрионов.
5. Добавить 200 мкл раствора для обработки в соответствующую лунку. Поместите крышку недеформированнойrneath пластину в качестве руководства для обеспечения добавление лечения в соответствующие лунки. Vortex каждая трубка до пипетки, чтобы распределить химического вещества в растворе. Визуально подтверждают друг эмбрион в обрабатывающем растворе. Если эмбрионы на стороне колодца, используйте чистую передачи пипетки, чтобы вымыть их в колодец с решением лечения.
6. Место пластины в инкубатор на 28,5 ° С. Эмбрионы будут проанализированы для флуоресценции при 72 часов после оплодотворения.

3. Автоматизированная изображений эмбрионов в 96-луночных

1. Обезболить эмбрионов путем добавления 10 мкл 4 мг / мл Tricaine в каждую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболить эмбрионов до визуализации. В 24-96 часов после оплодотворения, данио демонстрируют самопроизвольное движение и ответ испуга к меняющейся источника света во время захвата изображения. Обезболивающий эмбрионов уменьшает движение во время съемки.
2. Место пластины 96-а в моторизованной стадии и калибровки на сцену. Использование Zeiss Zen синий 2011 программного обеспечения для микроскопии автоматизацна и контроль, выберите опцию образец носителя и выберите многоямного 96. Выберите калибровку. Следуйте пошаговой направления для калибровки на сцену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимите кнопку плитки после этого шага. Если кнопка плитка не установлен, настройки калибровки могут быть потеряны и 96-луночный планшет необходимо будет калибровать.
3. Использование 10x объективом и светлого (BF) установки, определить положительное управления эмбриона и установить настройки экспозиции соответственно для BF и GFP каналов, убедившись, что сигнал флуоресценции не насыщая камеру. Сосредоточьтесь на одном эмбриона и запрограммировать микроскоп, чтобы приобрести 3 всего Z-секций, одно изображение 50 мкм выше и один 50 мкм ниже текущей фокальной плоскости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку различные ткани занимают разные фокальных плоскостей, это гарантирует, что для каждого данио изображения будут захвачены с сердца и печени в центре внимания.
4. Установите параметры программных приобрести выложены изображения с помощью GFP и BF каналлевая сторона На вкладке приобретения, выберите дополнительные настройки. Выбор регионов плитка, то плитка. Выберите опцию круг хорошо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Черепица используется для создания изображения каждой лунки. Одно поле-обзора захватывает только небольшую часть каждую лунку. Функция плитка может автоматически захватить несколько соседних полей-обзора из каждой лунки, создавая составное изображение всего скважины. Таким образом, можно автоматически захвата 96 составных изображений на тарелку, где каждый составное изображение содержит несколько десятков отдельных изображений из одной скважины.
5. Выберите носитель и коэффициент заполнения 90%. Выбор коэффициент заполнения 90% будет захватить несколько изображений выбранных скважин таких, что 90% площади каждой лунки будут видны в комбинированном изображении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе коэффициента заполнения, диаграмма будет отображаться представляющий область для включения в образ. Выберите процент, который будет включать в себя зону скважины, который подходит для эксперимента.
6. В разделе Параметры выберите величину перекрытия лучшего.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сшивая плитки для одного представительного изображения, перекрытие 5-10% обеспечивает плавный шов между изображениями. Однако, если изображение шить не является необходимым, используя 0% перекрытие сократит время обработки изображений. Использование 90% коэффициент заполнения и 5% перекрытие, составное изображение из одной скважины состоит из 59 отдельных изображений.
7. Начните изображений. Микроскоп автоматически получать изображения.
8. Вручную проверять составные изображения каждой лунки для тканеспецифической флуоресценции (рис. 1).
9. ПРИМЕЧАНИЕ: Это лучше всего начать с положительного контроля, чтобы убедиться, что химическое воздействие работал до наблюдения экспериментальных скважин лечения.

4. Руководство Image Capture эмбрионов в 96-луночный планшет

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения результатов следует использовать 20x длиннее расстояние цели в переменныйдесть более детальные изображения вручную (рис. 2).

1. Использование 20x объективом и светлого (BF) установки, определить положительное управления эмбриона и установить настройки экспозиции для BF и GFP каналов соответственно, убедившись, что сигнал флуоресценции не насыщая камеру.
2. Определить индивидуальные эмбрионов и снимать вручную.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как параметры экспозиции были отобраны, положительного контроля эмбриона, не изменить настройки. Это позволяет сравнение интенсивности флуоресценции как каждом снимке на единообразных условиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1 показана составных изображений из отдельных скважин 96-луночный планшет с. Каждый составное изображение состоит из 59 отдельных изображений с 5%-ым перекрытием изображения. Обратите внимание, что в прямом эфире данио ориентированы случайным образом в каждой лунке, н...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает прямой метод, автоматически изображений тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рерио. Протокол был разработан с использованием Zeiss Axio Observer. Z1 с дзен Синий 2011 программного обеспечения, однако методика может быть адаптирована с помощью любого инвертир...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plates	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    - 17.2 grams KCl                       - 0.76 grams CaCl2-2H2O     - 2.9 grams MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150 ml 2% methylene blue     100 μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water