Ультразвуковая руководствуясь Трансторакальная интрамиокардиальной впрыска у мышей

Резюме

Эхокардиография наведением чрескожная интрамиокардиальные впрыска представляет собой эффективное, надежное и наведения модальность на поставку средств Перенос генов или клеток в мышиной сердце. После действия, описанные в данном протоколе, оператор может быстро стать компетентным в этой разносторонней, минимально инвазивной техники.

Аннотация

Мышиные модели сердечно-сосудистых заболеваний важны для исследования патофизиологических механизмов и изучения потенциальных регенеративные методы лечения. Опыты с инфарктом инъекции в настоящее время выполняется путем прямого хирургического доступа через торакотомии. В то время как удобно, когда выполняется во время другой экспериментальной манипуляции, такие как лигирования коронарной артерии, потребность в инвазивной процедурой интрамиокардиальной доставки ограничивает потенциальные экспериментальные образцы. С постоянно улучшая разрешение ультразвуковое и передовые неинвазивные методов визуализации, то теперь это возможно, чтобы регулярно выполнять под ультразвуковым контролем, чрескожное интрамиокардиальной инъекции. Эта форма эффективно и надежно обеспечивает агентов к целевой области миокарда. Преимущества этого метода включают избегание хирургической заболеваемости, средство, чтобы целевых регионах миокарда выборочно под ультразвуковым контролем, и возможность поставлять вводимого в myocardiuм при многократных, заданные интервалы времени. С практикуется техники, осложнения от интрамиокардиальной инъекции редки, и мышей быстро вернуться к нормальной деятельности на восстановление от наркоза. После действия, описанные в данном протоколе, оператор с основной опыт эхокардиографии может быстро стать компетентным в этой разносторонней, минимально инвазивной техники.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смерти среди мужчин и женщин в Соединенных Штатах, что составляет 600 000 смертей в год ^1. Мышиные модели сердечно-сосудистых заболеваний являются критически важными для исследования патофизиологических механизмов и для того, чтобы исследовать потенциальные методы лечения. Инфаркт доставка векторов генной терапии, стволовые клетки, модифицированные РНК и других разрешительных документов терапевтические агенты расследование их терапевтический потенциал для болезни сердца ^2-7. В настоящее время, есть ограниченные варианты для инфаркта доставки терапевтических агентов в мышиных моделях ^6. Интрамиокардиальной инъекции в непосредственной визуализации обычно используется, но требует стернотомию или торакотомии, и ограничена открытой области сердца. В то время как удобно, когда выполняется во время другой экспериментальной манипуляции, такие как LAD лигирования, потребность в инвазивной процедурой интрамиокардиальной доставки ограничивает потенциальные экспериментальные образцы и вводитопо лни тельная эффекты от процедуры (например, фиброз благодаря торакотомии). Чрескожная перикарда доставка вирусных векторов сообщалось, но сайт и распределение терапевтического агента не является однородным и трудно контролировать ^8. Чрескожных коронарных Результаты инъекций в более однородным распределением закачиваемой материала, но эффективного и воспроизводимого коронарной доставки является сложной задачей в мышиных моделях.

Здесь мы описываем замкнутую груди интрамиокардиальной технику инъекции, что позволяет минимально инвазивной, оператор контролируется адресности терапевтических агентов под ультразвуковым контролем. Методика проста в освоении, устраняет необходимость в торакотомии или стернотомии и сопровождающими их экспериментальных осложнений, и обеспечивает большую гибкость в отношении сроков и сайтах интрамиокардиальной инъекции. Таким образом, эхокардиография-помощь интрамиокардиальные впрыска представляет собой технически простой и очень эффективный метод манипулированиямиокард в мышиных экспериментальных моделях.

протокол

Все описанные этапы проводили под протоколами, утвержденными уходу и использованию комитета Институциональная животных больницы Бостонской детской путем.

1 Подготовка

1. Выполните базовую сердечной анатомическую и функциональную оценку по эхокардиографии до начала протокола впрыска, как оптимальное положение фиксируется преобразователь для интрамиокардиальной инъекции не может дать оптимальные стандартные представления для разграничения анатомии и оценку функции.
2. Установка впрыска показано на фиг.1А-1С. Поместите пустой шприц с оболочкой иглы, конические ориентированных вверх, в шприце зажима (рисунок 1С) и закрепите ультразвукового преобразователя зонда в скан-зажим (рисунок 1В). Ослабить скан-зажим мяч блокировки сустава (рисунок 1b) и манипулировать ориентацию датчика таким образом, чтобы оно располагалось параллельно оси иглы. Закрепите сканеровположение головы, затянув скан-зажим мяч блокировки сустава.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекций у взрослых мышей, 30 G иглы с 1 в / 2,5 см длины является оптимальным. 1 мл шприц может быть использован для больших объемов, в то время как герметичная шприц можно использовать для более точного контроля небольших объемов (5-10 мкл).
3. Применить ультразвуковое гель либерально до кончика датчика с помощью шпателя, чтобы покрыть голову вдоль всей его полноте. Тщательно обнажить иглу и использовать игла смонтировать управления продвигать иглу непосредственно под преобразователем и в ультразвуковой гель для визуализации. Внести незначительные корректировки с помощью иглы крепление управление так, что игла визуализируется четко вдоль его длины на ультразвуковом изображении. Если датчик был выровнен параллельно иглы в шаге 1.4, то игла должна оставаться в плоскости изображения, как это расширенный и изъяты с контрольной инъекции ручкой (Рисунок 1C).
4. В последующих шагах, не беспокоить необходимостьле / преобразователь горизонтального выравнивания путем перемещения в горизонтальном оси. Скорее, ориентироваться на конкретные области сердца для инъекций путем изменения по вертикали (по оси) положение иглы монтирования и, перемещая платформу животных.
5. Перемещайте датчик кверху от животного платформы с помощью сканирования контроль высоты (рисунок 1b), чтобы разрешить последующую размещение анестезированной мыши на платформу животных. Это не нарушить выравнивание х-оси преобразователя к продольной оси иглы.
6. Удалите шприц, который был использован для выравнивания из шприца зажимом и отбросить тщательно. Загрузите новую иглу и шприц с инжекционной до конечного объема целевой, что позволяет мертвого пространства в наконечника шприца. Будьте осторожны, чтобы удалить пузырьки воздуха. Поместите шприц в шприц зажима без корректировки его выравнивание по оси X.. Полностью убрать шприц с помощью регулятора впрыска.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для начальных учебных целях, использование синего ЭванаКраситель (1%), краситель трипанового синего (0,4%) или суспензию из флуоресцентных микросфер, как инжекционной может помочь оператору при подтверждении компетентности и успеха целевой инъекции.

2 инъекций

1. Включите интегрированы теплее нагревательного платформы и установить его на 37 ° C. Поместите платформы животного на 180 ° от обычного ориентации изображения, с зажимом анестезия шланга и голове животного ближайшего к оператору. Это позволяет сердца (в левой части грудной клетки), чтобы быть на той же стороне, чтобы зажим шприца и иглы. Примечание: Дополнительные незначительные по часовой стрелке вращения корректировки платформы животных может быть необходимо ориентировать сердце правильно для парастернального короткой оси плоскости формирования изображения, которое будет использоваться для инъекций (фиг.2А).
2. Подготовьте мышей для эхокардиографии, как сообщалось ранее ^9. Обезболить мышь в индукционной камере с 2% изофлуран. Удалить волосы на груди с крем для волос удаление апD применяются смазочных гель для обоих глаз, чтобы предотвратить высыхание склеры.
3. Поднимите датчик на сканирования контроль высоты головы (рисунок 1b). Поместите наркозом на спине мыши поверх нагретой животных платформе с мордой в носовой обтекатель доставки 1-3% изофлуран (2А-2В). Аккуратно вставьте ректальный зонд и заклеивайте четыре лапы к ЭКГ-электродов, применяя гель для электродов для электрического контакта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий уровень анестезии должно быть обеспечено за гуманное отношение животного. Там не должно быть никаких изменений в частоте сердечных сокращений и нет ответа на размещение иглы через стенку грудной клетки. Интегрированные гомеостатические терморегуляторов животного какой платформы должны быть использованы для поддержания нормотермию (37 ± 0,5 ° С), как гипотермия приведет к относительной брадикардии, желудочковой дилатации, и возможного дискомфорта.
4. Как только мышь находится в безопасности на платформе животных, снизить преобразователь на depilaТед грудь с помощью сканирования контроль высоты головы (рисунок 1b). Оптимальная настройка УЗИ для инъекций для сердца быть визуализированы в парастернальной короткой оси ориентации, в соответствии со стандартом эхокардиографического техники. Вращения платформы животного 20-30 ° по часовой стрелке, чтобы получить оптимальную акустическую окно для инъекций в короткой оси изображения плоскости (2А-2Б). Примечание: В качестве альтернативы, инъекции могут быть выполнены из парастернальной длинной оси ориентации по против часовой стрелки поворота платформы животных (фиг.2С).
5. Используйте элементы управления регулировки платформа животных регулировать поле зрения, и ориентироваться любую желаемую место инъекции в миокарде левого желудочка. Камера отъезжает, и вперед от вершины к основанию сердца целевой нужное место инъекции в миокарда левого желудочка (3А-3С). Примечание: midpapillary парастернальная вид короткой оси (3А) предлагает reproduciblе ориентиры, которые позволяют последующую визуализацию в месте инъекции. Примечание: В качестве альтернативы, парастернальная пор вид ось может быть использован для целевой предопределенный место инъекции (Рисунок 3D).
6. Начиная с шприцем в полностью сложенном шприца зажим, медленно продвигаться шприц к груди животного, повернув регулятор впрыска по часовой стрелке (рисунок 4А). Для обеспечения свободного ультразвуковое визуализацию как сердце и кончика иглы по мере приближения к груди, использовать много ультразвукового геля на левой стороне груди и оптимизировать акустическую окно, установив широкое поле зрения на контроль эхокардиографии. Установите Координатор / зону на целевые места для инъекций. Незначительные корректировки иглы монтировать элементы управления могут оптимизировать изображение иглы вдоль его длины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые ультразвуковые машины имеют функцию иглы руководство программного обеспечения для цифровой продлить линию вдоль длинной оси иглы до целевой миокарда(Фиг.4В). Такое программное средство может быть полезным, но не является необходимым.
7. С животное соответствующим образом седативные (1-3% изофлуран смешивают с 0,5-0,8 л / мин на 100% кислорода), Advance иглу через стенку грудной клетки мыши, и в миокард, тщательно наблюдая положение скошенным кончиком иглы на всех раз. Остановка вперед, когда кончик иглы находится в пределах целевого миокарда (фиг.4С). Весь скошенный кончик должен быть надежно в миокарде, чтобы избежать вводимого вещества утечку в перикарда пространстве.
8. Когда кончик находится в нужном месте, доставить вводимого вещества, нажав на поршень шприца. Доставьте вводимого вещества медленно, в течение 5-30 сек (в зависимости от объема доставляется). До 50 мкл вводимого вещества могут быть доставлены без ущерба желудочка функцию. Переходный echobright появление в закачиваемой инфаркта регионе может быть очевидным после успешного введения. Краткий (секунд) период относительной bradycardИ.А. иногда с введением в миокарде отметил и быстро решает.
9. После впрыскивания находится под управлением, оперативно вывести иглу на против часовой стрелки вращения ручки управления впрыском. Мышь должна находиться под наркозом в течение нескольких минут эхокардиографического наблюдения для подтверждения сохранившийся функцию желудочков и никаких postprocedural осложнений. Если указано, несколько регионов миокарда может быть последовательно вводят путем перестановки угла иглы подхода путем регулировки платформы животных. После инъекции интрамиокардиальной, Мышь помещают в клетку по себе и давали отойти от анестезии под наблюдением.
10. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение. Не возвращать животное, которое претерпела интрамиокардиальной инъекции в компании других животных, пока полностью не восстановился. Клетка должна быть размещена на терморегулируемой площадку с реADY предоставление воды и мыши диеты. Postprocedural дискомфорт не ожидается и ненадлежащее возобновить нормальное поведение вскоре после вмешательства предполагает потенциальное осложнение (см Обсуждение).
11. Осторожно удалите иглу сразу после завершения интрамиокардиальной инъекции, чтобы минимизировать риск травмы острых оператора или прохожих. Повторное использование иглы может привести к притупление кончика делает его более сложным для прокалывания миокарда и приводит к более высокому риску осложнений.

Результаты

Мышиный интрамиокардиальной впрыска с синим красителем или флуоресцентных микросфер

Инъекция синего красителя Эвана полезно для учебных целей. Вскоре после инъекции, усыпить мыши и удалить сердце визуализировать расположение введенного синего красителя. Рисунок 5...

Обсуждение

Biologics может быть доставлен в миокарде путем прямой инъекции, интрамиокардиальной intrapericardial инъекции или косвенного управления через кровоток. Недавние испытания клеточной терапии на основе в моделях инфаркта миокарда описали открытый подход торакотомии с доставкой вводимого веществ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 ultrasound imaging system	Visualsonics
Vevo Integrated Rail System III	Visualsonics
Microscan MS400 transducer	Visualsonics
Microscan MS550D transducer	Visualsonics
PrecisionGlide needles	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc slip tip syringe	Exel International	26048	or equivalent
Gastight 50 μl glass syringes	Hamilton	1705
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250	or equivalent
Isoflurane	Baxter	AHN3640	or equivalent
Aquasonic 100	Parker Laboratories	(01-08)	or equivalent
Polystyrene microspheres (red fluorescent)	Life Technologies	F-8842	or equivalent