Трансгенные грызунов Анализ на Количественная мужской половой клетки Частота мутантного

Резюме

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Аннотация

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

Введение

Отдельные мутации ДНК в зародышевой линии может привести к снижению репродуктивного успеха и, если в наследство, может вызвать генетические заболевания или повышенное предрасположенности к раку у потомства ^1-3. Имеются веские доказательства показывает, что большая часть De Novo мутаций наследуются от отцовской зародышевой линии ^4, и что число мутаций у потомства положительно коррелирует с отцовской возраст на момент зачатия ^5. Чем выше доля мужчин мутаций, как полагают, является результатом различий в возрасте во время гаметогенеза между полами, тем больше количество клеточных делений сперматогенных по сравнению с числом делений клеток oogenic в женской зародышевой линии ^2, и прогрессирующее снижение ДНК ремонт эффективность с возрастом у мужчин. Все эти факторы способствуют увеличению вероятности ошибок репликации в мужской зародышевой линии ^6. Тем не менее, влияние отцовской воздействия Environmental факторов на частоте De Novo мутаций остается неопределенным. Тем не менее, большое количество агентов окружающей среды, как известно, вызывают зародышевых клеток мутации у грызунов ^7, и появляется все больше доказательств того, что некоторые из этих агентов также может влиять на человеческое зародышевой линии ^8. Несмотря на эти проблемы, испытания химических веществ в плановом порядке для их способности индуцировать мутации в соматических клетках для целей регулирования и она, как предполагается, что соматические тесты достаточно для защиты зародышевой линии. Поэтому, химические вещества редко оценены по их способности индуцировать зародышевых клеток мутации.

Одна из причин зародышевых клеток мутагенность испытания в значительной степени исключены из процесса регулирования принятия решений является отсутствие практических методик. Традиционные методы грызунов основе, такие как доминантных летальных ⁹ и конкретных локус ¹⁰ тестов, оценить частота мутаций зародышевых клеток, забив мутантные фенотипы в эмбрионах или потомковоблученных родителей. Эти анализы требуют использования очень большого числа животных, времени и ресурсов, чтобы приобрести статистически значимые результаты.

Хотя несколько современных методов количественной мутации зародышевой клетке недавно появились, многие страдают недостатки с точки зрения их практичности, эффективности и биологической значимости. Например, повторить длины мутации в расширенном просто тандемного повтора (ПЭБТ) локусов может быть определена количественно в мужских половых клеток с использованием одной молекулы ПЦР подход ^15. Тем не менее, выполнение этого метода может быть технически сложным и трудоемким, и в отличие от точечных мутаций, биологическая и здоровье значимость изменений в длине повторение того крайне нестабильной ПЭБТ локусов остаются неясными ^16. Современные целые технологии секвенирования генома может обеспечить богатство биологически значимую данных при применении к проблеме наследственных мутаций ^4,17, но высокая стоимость, высокие коэффициенты ошибок, требуется связано проверкидля подтверждения мутации, и биоинформатики проблемы по-прежнему ограничивают рутинную применение этой опции в регулирующего потенциала тестирования ^18.

В данном случае мы описываем практичный способ количественного определения индуцированных мутаций непосредственно в половых клетках трансгенных мышей-самцов. Этот протокол описан для трансгенной модели MutaMouse, который имеет несколько сцепленных копий рекомбинантной λgt10 фага вектора, содержащего ген-репортер кишечная палочка LacZ интегрированный в обеих копиях хромосоме 3 ¹⁹ (рисунок 1).

Этот протокол является также актуальны для других трансгенных грызунов (ТТГ) моделей, основанных на тех же принципах (BigBlue мышей и крыс, или LacZ плазмиды мыши, и т.д..) Или слегка различных генов-репортеров (GPT дельта мыши и крысы, модели TGR отзывы в Lambert др Al. ^20). Этот метод основан на анализе мутации TGR, описанной в недавно опубликованноми пересмотренный руководящий принцип ОЭСР ²¹ и мы разрабатываем на специальных соображений, необходимых для размещения оценку мутаций в мужской зародышевой линии из уникальных характеристик сперматогенеза. Вкратце, анализ включает подвергая трансгенных мышей мужского пола в мутагенного вещества с последующим временем выборки, где предварительно мутационные повреждения фиксируются в стабильные мутаций. При выбранной времени выборки, мышей подвергали эвтаназии и зародышевые клетки собираются либо из конского придатка или семенных канальцев. Как обсуждается ниже, мутагенных эффектов на различных этапах сперматогенеза может быть определен путем выбора времени между воздействием и отбора проб. Трансгенные вставки, содержащие несколько копий λ генома фага на клетку, изолированы от зародышевых клеток геномной ДНК и упакованы в пустые λ-фага капсид, создающих инфекционные частицы λ фагов, которые затем используются для заразить E. палочка хозяин. Инфицированные бактерии выращивают на выбраннтивные СМИ, что можно выделить клетки, содержащие вектор с мутантным копии LacZ из клеток, несущих дикого типа LacZ. Мутагенный эффект воздействия на мужской зародышевой линии определяется путем сравнения частоты мутантных трансгенов между контрольных и обработанных мышей (рисунок 2, рассмотренных в Lambert и соавт. ^20). Большое количество зародышевых клеток можно анализировать с одной мыши, что дает этот анализ высокую чувствительность по сравнению с традиционными методами, в то время как уменьшение количества животных, необходимых. И потому, что не требуется специальное оборудование или обучение, этот анализ представляет собой практическое и эффективное решение для тестирования зародышевых клеток мутации в большинстве современных токсикологии / молекулярных лабораторий биологии.

Одним из важнейших условий эффективного применения TGR мутации половых клеток анализа является понимание сперматогенного цикла (рисунок 3). Время для зародышевых клеток мыши, чтобы прогрессировать от улэм клетки в семенных канальцах в сперматогенов, сперматоцитах, сперматидах, и, наконец, чтобы созреть сперму в придатке яичка (т.е.. сперматогенез) составляет примерно 49 дней. Мутация может произойти в различных фазах этого цикла и часто соединение конкретных. Двумя основными характеристиками, которые имеют особое значение для мутагенеза в мужских половых клетках являются прекращение синтеза ДНК в начале мейоза, и прогрессирующая потеря репарации ДНК мощностью ⁶ в конце пост-мейоза, два процесса, которые необходимы для индукции и фиксации большинство мутаций.

Из этих уникальных характеристик сперматогенеза, есть три критических экспериментальные переменные для проведения TGR мутации половых клеток анализа: (1) времени администрация соединение испытание; (2) время выборки; и (3) Выбор зародышевых клеток населения собрать для анализа (рисунок 3 и в таблице 1). Время Администрация experimental переменная, которая определяет, как долго клетки-мишени подвергаются испытуемых соединений. Длина времени введения также могут быть использованы для целевой воздействия на специфические типы клеток или фаз сперматогенеза. Например, однократное введение день может быть использован для определения влияния острого воздействия на одном конкретном типе клеток. Точно так же, экспозиция может быть сосредоточено до целой сперматогенного фазе, например, таргетинг только мейотически разделительные сперматоциты или митотически деления сперматогоний использованием 2-недельный время администрирования и соответствующий времени выборки. Хронические и субхроническом раз администрирования используются для оценки последствий долгосрочного воздействия, чтобы обеспечить достаточное распределение фармакокинетический тестируемого соединения, или разрешать достаточное накопление мутаций от слабых мутагенов (например 28 день время администрация рекомендованный в тесте ОЭСР руководство).

Время выборки является критической переменной для определения, на которомфаза сперматогенеза клетки-мишени были в то время облучения. Время выборки определяет, как много времени, и, следовательно, насколько дальше по сперматогенного цикла, клетки проходят через после воздействия. Например, изучать эффекты, в стволовых клеток сперматогенов время выборки> 49 дней требуется, если сбор вполне назрел сперму, или> 42 дней, если сбор незрелых половых клеток из семенных канальцев, чтобы гарантировать, что все собранные клетки имели достаточно времени, чтобы развиваются из подвергается стебли клетки. Важно отметить, что время выборки, по меньшей мере, 70 дней было бы предпочтительно, чтобы продемонстрировать истинную эффект стволовых клеток, чтобы обеспечить достаточное время для распространения фармакокинетического в токсиканта, для устранения клеток, подвергнутых на более поздних этапах сперматогенеза, и для учета Период временного бесплодия, которые могут возникнуть ~ 6 недель после контакта с высокой мутагенных соединений ^22. Аналогично, время выборки из 21 дней будет гарантировать, что спермы КоллеИДКТК из конского придатка бы только что завершили мейоза в последний день экспозиции.

Половые клетки могут быть собраны в зрелой спермы из конского придатка, или в виде смеси различных типов клеток сперматогенеза из семенных канальцах. Зрелые сперматозоиды остаются в конского для ~ 3 дней, что дает возможность определить с относительной точностью типа клеток или фазы сперматогенеза, из которых возник спермы для любого данного эксперимента. Таким образом, анализ разрешений спермы конского весьма целенаправленные исследования стадии конкретных мутаций эффектов. С другой стороны, клеточные суспензии, полученные из семенных канальцах содержать смесь различных типов зародышевых клеток в различных стадиях развития, и, таким образом, предлагает хуже разрешение сперматогенеза фазы, в которой возникла мутации. Кроме того, клеточные суспензии, выделенные из семенных канальцев, как правило, содержат по-представление сперматидах, а затем сперматоцитах и ​​верУ некоторых сперматогенов и стволовых клеток (эти пропорции представлены закончили белых полос на рисунке 3). Кроме того, суспензии, приготовленные из семенных канальцах может также содержать различные соматические клетки. Таким образом, потому, что так много типов клетки присутствуют, мутационные эффекты могут зависеть от различных нецелевых клеток. Однако, собирая образцы из семенных канальцев предлагает экономичное решение для одновременно скрининга нескольких типов зародышевых клеток и легкую интеграцию анализа зародышевых клеток в стандартный протокол испытания ОЭСР соматической мутации.

Повторим, в зависимости от потребностей исследователя, времени введения, времени выборки и собранной клеточной популяции можно регулировать, чтобы опросить эффекты воздействия в различных типах клеток и на разных этапах сперматогенеза. Тщательно выбирая эти переменные, эксперименты могут быть разработаны для целевых механистических исследований, или для более обобщенного нормативного тестаЦЕЛЕЙ.

Для достижения мастерства в анализе, мы рекомендуем использовать острого перорального введения 100 мг / кг N-этил-N-нитрозомочевины (ЕНУ), за которым следует 70-дневного времени выборки в качестве положительного контроля. Анализ конского спермы, таким образом, нацелен сперматогониальные стволовые клетки (рисунок 3), которые обычно имеют 4-5 кратное увеличение мутант частоты (СЧ) по сравнению с контрольными следующую этом высоко мутагенного дозе ЕНУ. Следует отметить, что эта доза, как известно, вызывают стерильность 6 недель после облучения, таким образом, оно не может быть подходящая доза управления для сокращения времени отбора проб. Эта доза будет также получения выявляемой увеличение MF в большинстве соматических тканях ^20. Представительные результаты, представленные ниже, были генерируется После острой +70 режима воздействия, используя три дозы ЕНУ вплоть до 100 мг / кг.

протокол

Все протоколы с участием животноводство, техническое обслуживание и обработку были утверждены по уходу за животными комитета здравоохранения Канады.

1. животных Воздействие

1. Случайно распределить трансгенных самцов мышей (8-12 недель) с контрольными группами и группами лечения (мин = 5 в группе) .Treat мышей с тестируемым соединением и соответствующим контролем соответствующим путем экспозиции для выбранного времени администрирования. Выберите подходящее время выборки в соответствии с сперматогенного типа клеток, представляющих интерес (рисунок 3).
2. После времени выборки, усыпить мышей путем смещения шейных позвонков под изофлуораном анестезии (или другим способом). Тщательно обратить яички из разреза на животе или мошонке и вырезать конского придатков. (Рисунок 4, чтобы посмотреть подробное видео придатка коллекции см Duselis др. ^24). Кроме того, собирать яички, если анализировать семенных канальцевс клетки. Замораживание в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.

2 Выделение и Переваривание Кауда спермы

1. Размораживание конского придатки на льду. Трансфер талой конского в чашку Петри и тщательно фарш с скальпеля или лезвия бритвы.
2. Добавить 700 мкл комнатной температуры D-PBS в чашке Петри. Использование широким отверстием 1000 мкл пипетки, выпуск спермы от конского рисуя и отпуская подвеску до D-PBS не мутнеет со спермой (примерно в 10 раз). Примечание: Для приготовления широким отверстием пипетки сократить 2-3 мм от конца пластмассовой пипетки.
3. Фильтр подвеска через фильтр из нержавеющей стали сетки в чистую пробирку 1,5 мл. Вымойте чашки Петри с дополнительными 700 мкл D-PBS и передать же трубки 1.5 мл через сетчатый фильтр. Удалить сетку, поместите трубку на льду.
4. Повторите шаги 2.1-2.3 для остальных образцов.
5. Спин samplesat 11000 мкг в течение 3 мин. Тщательно сцеживать супернатант. Избегайте нарушая гранул.
6. Добавить 1,0 мл холодной 1x цитрат солевой натрия (SSC). Vortex до гранул полностью ресуспендировали. Это будет иногда принимать несколько раундов встряхиванием.
7. Добавить 15 мкл 10% SDS. Обратить / энергично встряхивают в течение 30 сек, чтобы сорвать не-сперматозоидов. Встряхивания слишком аккуратно приведет к нарушению недостаточной, а осадок не будет должным образом сформировать на следующей стадии.
8. Отжим при 11000 мкг в течение 2 мин. Свободно, "пушистые" осадок свидетельствует о неполной нарушения соматических клеток в связи с недостаточным потрясение на шаг 2,7. Если это происходит, просто встряхнуть образец снова, и до тех пор, Respin плотно осадок не образуется. Осторожно перелейте супернатант. Избегайте нарушая гранул. Вкратце вращаться снова и удалить остатки супернатанта с 200 мкл пипетки.
9. Добавить 940 мкл 0.2X холодной SSC и вихрь, пока осадок не ресуспендировали. Это осадок может быть очень трудно вновь приостановить и может занять несколько раундов встряхиванием. Иногда скопления сПермь неизбежны.
10. Добавить 120 мкл β-меркаптоэтанола, 100 мкл 10% SDS, 20 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8, и 20 мкл протеиназы К (60 мг / мл, приготовленный свежий). Тщательно перемешать и переварить в течение ночи при вращении при 37 ° С. Приступить к добыче фенол / хлороформ.

3 фенол / хлороформ Выделение ДНК из Кауда спермы

Примечание: Поскольку ядерной ДНК в поздней фазе сперматидах и зрелых сперматозоидов образует комплекс с протаминов, и высоко конденсированные по сравнению с ДНК соматических клеток, обычные методы изоляции нуклеиновых кислот не генерируют ДНК достаточного выхода и чистоты для анализа мутаций на работу эффективно. Многократные экстракции фенол-хлороформ после агрессивной пищеварения обязаны освободить и очистить ДНК спермы (на основе методов из ^15).

1. Передача спермы клетки переваривают с 15 мл полипропиленовую трубку.
2. Добавить 2 мл фенола: хлороформа смесь (1: 1). Поверните трубку на 22 оборотов в минутув течение 3 мин.
3. Центрифуга при 1600 х г в течение 10 мин и передавать верхний водный слой вместе с нечеткой слоя интерфейса в свежую пробирку на 15 мл.
4. Повторите шаги 3.1.2 и 3.1.3 3x, но изменения раз вращение до 3 мин, 4 мин, и 6 мин, соответственно. На последнем повторе, избежать переноса любой из "нечеткой" граничного слоя.
5. После ^4-го добычи, добавить 70 мкл 3М NaAc, рН 5,2 на 1 мл водного экстракта и 2 мл хлороформа: изоамилового спирта (24: 1). Поверните трубку на 22 оборотов в минуту в течение 12 мин.
6. Центрифуга при 1600 х г в течение 10 мин и передавать верхний водный слой в чистую пробирку на 15 мл.
7. Осадок ДНК добавлением 2 объемов абсолютного этанола и осторожно вращая трубку на его стороне с нежным покачиванием.
8. Сбор ДНК путем намотки на кончике термосварного пастбищ пипетки. Промыть ДНК, вращая наконечник пипетки в 70% этанола и высохнуть в течение 5 мин.
9. После экстракции, растворить осадок ДНК в 40 - 100 мкл TriS-ЭДТА буфере, рН 8 Хранить при 4 ° С. Разрешить ДНК, чтобы растворить при 4 ° С в течение не менее двух дней, прежде чем перейти к LacZ мутации анализом. Если проблемы растворимости встречаются, ДНК может быть дополнительно растворяли при 65 ° С в течение 15 мин перед использованием. Определить концентрацию ДНК с spectrophotometre на A ₂₆₀ и обеспечить, чтобы концентрация растворенного ДНК между 200-2,000 нг / мкл.

4 Выделение и Переваривание половых клеток из семенных канальцев

1. Если заморожен, разморозить яичка на льду (примерно 1 час). Передача яичка к земле стеклянную пластину.
2. Удерживая один конец яичка с парой щипцов. На другом конце яичка, проколоть дырку в эпителиальной капсулы, используя другую пару щипцов или пару рассечение ножницами (Рисунок 5A). Сожмите семенных канальцев через прокол и выбросьте эпителия капсулы (Рисунок 5Б).
3. дд 500 мкл комнатной температуре D-PBS к decapsulated семенных канальцев.
4. Угол ткани ролик (силиконовый каучук плотно установлена ​​более свободно вращающийся диаметром 5 мм трубки из нержавеющей стали, или аналогичный аппарат) таким образом, что один конец находится в контакте с пластиной приблизительно под углом 5-10 ° (фиг.5С). Без применения никакого давления, осторожно двигаться ролик назад и вперед через канальцев, пока они не сглажены и D-PBS мутнеет с опубликованным клеток (примерно в 5-10 раз).
5. Добавить еще 500 мкл D-PBS в течение канальцев и аккуратно перевернуться канальцев несколько дополнительных раз.
6. Передача клеточной суспензии в 1,5 мл пробирке при сведении к минимуму количество отдельных трубок, передаваемого рис (5d).
7. Повторите шаги 4,5-4,6 собрать больше клеток при необходимости.
8. Разрешить 1 - 2 мин для любых случайно собранные трубочки оседают на дне пробирки. Перенести D-PBS к фрЭШ 1,5 мл трубку оставив оседлых канальцев (примерно 100 мкл D-PBS). Небольшую аликвоту этой суспензии могут быть проверены под микроскопом (фазового контраста) с целью оценки состава клеточной популяции.
9. Спин вниз клеток при 11000 х г в течение 30 сек. Тщательно слейте супернатант, не нарушая гранул. Осадок клеток могут быть заморожены при -80 ° С в этой точке, если это необходимо.
10. Оттепель клетки при необходимости. Передача в полипропиленовую пробирку и ресуспендирования клеток 15 мл в 5 мл буфера для лизиса (10 мМ Трис, рН 7,6, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1 мг / мл протеиназы К, 1% ДСН). Дайджест в течение ночи в инкубаторе с вращением при 37 ° С.
11. Приступить к добыче фенол / хлороформ.

5 фенол / хлороформ Выделение ДНК из семенных канальцев половых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: менее агрессивным добыча используется для изоляции семенных канальцев ДНК половых клеток, так как эти типы клеток еще не прогрессировала через пuclear конденсации.

1. Добавляют 5 мл фенола: хлороформа смесь (1: 1) в течение ночи семенных канальцах клеток пищеварения. Поверните трубку при 22 оборотах в минуту в течение 20 мин.
2. Центрифуга при 1600 х г в течение 10 мин и передавать верхний водный слой, избегая при этом "нечеткой" граничный слой, в чистую пробирку на 15 мл.
3. Добавить 100 мкл 5 М NaCl на 5 мл водного экстракта (обычно 5 мл восстанавливается)
4. Добавить 5 мл хлороформа: изоамилового спирта (24: 1). Поверните трубку на 22 оборотов в минуту в течение 12 мин.
5. Центрифуга при 1600 х г в течение 10 мин и передавать верхний водный слой в чистую пробирку на 15 мл.
6. Осадок ДНК добавлением 2 объемов абсолютного этанола и осторожно поворота и инвертирования трубки.
7. Сбор ДНК путем намотки на кончик герметичной от пастбищ пипетки. Промыть ДНК, вращая наконечник пипетки в 70% этанола и высохнуть в течение 5 мин.
8. Растворить ДНК в 40-100 мкл Трис-ЭДТА буфере, рН 8 Хранить при 4 ° С. Разрешить ДНК, чтобы растворить при 4 ° С в течение минимум двухдней, прежде чем приступить к LacZ мутация пробирного (см шаг 3,9). Если проблемы растворимости встречаются, ДНК может быть дополнительно растворяли при 65 ° С в течение 15 мин перед использованием. Определить концентрацию ДНК с spectrophotometre на ₂₆₀ A и гарантировать, что концентрация находится в диапазоне от 200 до 2000 нг / мкл.

6 LacZ мутация пробирного

Бактериальной или грибковой загрязнение может помешать эффективности упаковки, а также роста бляшек и озвучивания. Поэтому очень важно, чтобы выполнить LacZ анализа с использованием соответствующих асептических меры для предотвращения загрязнения упаковка реакции, культуре принимающей страны и питательных сред.

1. День перед исследованием: Подготовка Bottom агар и ночной культуры
   1. Восемь пластины (4 пластины забить мутантов, 4 пластины рассчитывать титр), содержащий 8 мл дно агар друг требуются на образец (т.е.., 64 мл на образец). Нижняя агар одинакова для обоихмутантные и титр количество пластин. Подготовьте достаточное агар нижнюю для число образцов обрабатывается. Соблюдая правила асептики, влить в 90 мм чашки Петри (8 мл на чашку) и позволяют агар затвердеть. ПРИМЕЧАНИЕ: Нижние агара можно приготовить до 1 недели заранее.
   2. В 50 мл пробирку добавляют 10 мл LB бульона, 100 мкл 20% раствора мальтозы, 25 мкл ампициллин (20 мг / мл) и 20 мкл канамицин (5 мг / мл). Привить с Е. палочка (LacZ ^- / Gale ^{-) 25} и расти в течение ночи при 37 ° С при встряхивании при 240 оборотах в минуту.
2. День 1: субкультуре Клетки
   1. Субкультуре клеток путем подготовки 1: 100 разбавление ночной культуры в свежей LB (без антибиотиков). Объем 8 мл субкультуры необходимо на образец. Инкубировать при 37 ° C при встряхивании со скоростью 240 оборотов в минуту в течение примерно 3,5 ч, пока OD ₆₀₀ = 1.
   2. При OD ₆₀₀ = 1, разрыв клеточной суспензии равномерно в 50 мл пробирки и центрифуги в 1300 мкг при 15 ° С в течение 10мин. Удалить супернатант и вновь приостановить клетки в половине первоначального объема (то есть., 4 мл на образец) из LB, содержащей 10 мМ MgSO _4. Положите клетки в сторону, пока не нужны [шаг 6.2.4.3].
3. День 1: Упаковка ДНК в фага лямбда частиц
   1. Прогрейте на водяной бане к 30 ° C.
   2. Использование широким отверстием 10 мкл пипетки, передача 4 мкл ДНК в 1,5 мл трубки. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнена день или больше,, в заранее,, чтобы уменьшить время на подготовку.
   3. Прогрейте первую трубку (красный) от комплекта экстракта фагового упаковка (1 трубку за каждые 2 образцов). Кратко спина собрать экстракт внизу трубы.
   4. Трансфер 4,8 мкл экстракта упаковки из первой трубы к образцу ДНК и перемешать, осторожно перемешивании с кончика пипетки. Кратко спин вниз образцы в трубок. Инкубируют в течение 1,5 ч в 30 ° С на водяной бане.
   5. Прогреть второй (синий) упаковка экстракт трубку (1 трубка для ~ 15 образцов). Кратко прясть, чтобы собрать экстракт есть внизуиз трубки.
   6. Трансфер 4,8 мкл экстракта упаковки из второй трубки к образцу ДНК и перемешать, осторожно перемешивании. Кратко спин вниз образцы в трубок. Инкубируют в течение 1,5 ч в 30 ° С на водяной бане.
   7. Повторное приостановить упакованные фаговых частиц в 500 мкл С. М. буфере,, и перемешать с помощью вращающихся в течение 30 мин по крайней +20 оборотах в минуту.
   8. После поворота, кратко вихревые образцы и центрифуги при 11000 мкг в течение 30 сек, чтобы собрать образцы на дне пробирки. Фаговые частицы готовы для инфекции [шага 6.2.4].
4. День 1: Подготовка верхнего агара
   1. Подготовьте отдельный агар верхний для титром пластин и мутантных отбора пластин. Каждый образец требуется 4 титра пластины и 4 мутантных пластины. Каждая пластина требуется 8 мл верхнюю агар. Добавить селективного агента фенил-β-D-галактопиранозида (С-Гал) в верхней мутантного выбора агар только. Подготовьте обе верхние агары заранее (день анализа) и выдерживают при 50 ° С перед добавлением MgSO ₄ к обеим лучших агаров, и PGаль мутанта выбора агар.
5. День 1: Возбудителем таких инфекций Клетки с PACKAGED Фаг и Плакировка
   1. Добавьте описание два 50 мл пробирок за образца: 1 "мутант" трубка за образца и 1 "титр" трубка за образца
   2. Этикетка 8 агаром на образец: 4 "мутантные" тарелки на образец и 4 "титр" тарелки на пробу
   3. Алиготе 2 мл ресуспендированных клеток [от шага 6.2.1.2] в каждую пробирку.
   4. Добавить 500 мкл упакованных частиц фага [от шага 6.2.2.8] в "мутант" 50 мл трубки (содержащие клетки). Осторожно перемешать и дать фаговые частицы, чтобы инфицировать клетки в течение 30 мин при комнатной температуре.
   5. Через 30 мин кратко вихревого инфицированных клеток и передачи 15 мкл инфицированных клеток в соответствующие 50 мл "титром" трубки (содержащей клетки).
   6. Для пластины образца титра, добавить 30 мл теплой (50 ° С) "титра" верхнего агара (не содержащие P-Гал), чтобы "титр" 50 мл трубки. Сразу DISTRIBЮт смесь агар / элемент среди "титром" пластин 4 (~ 8 мл на чашку). Работают быстро, так, чтобы верхний агар не охлаждает в пипеток, и попытаться не вводить пузырьков воздуха.
   7. Пластина "мутант" образцы рядом. Убедитесь, P-Гал добавляется "мутант выбора" верхнего агара. Добавить 30 мл теплой "мутант выбора" агар (содержащей P-Гал), чтобы "мутант" 50 мл трубки. Сразу распространять смеси агар / клеток среди "мутант" пластин 4 (~ 8 мл на чашку).
   8. Разрешить пластины затвердеть (~ 15 мин), затем инвертировать и инкубируют при 37 ° С в течение ночи.
6. День 2: Подсчет Бляшки
   1. После того, как инкубации в течение ночи, подсчитать количество бляшек на мутантных, и титром пластин,. Для большого количества бляшек, рассчитывать только часть пластины, чтобы оценить общее количество (например,., Часто ¼ от титра пластины будет иметь между 100-200 бляшки). Минимум 100 бляшек следует считать за тарелку, когда CoUnting порцию пластине.
   2. Подсчитайте количество бляшкообразующих единиц (Pfus) за мкл клеток. Это делается путем деления количества бляшек на "титром" тарелок по объему клеток покрытием (15 мкл).
   3. Используйте количество Pfus / мкл оценить общее количество Pfus в общем объеме зараженных посеянных клеток на "мутант" пластин (Pfus / мкл * [2 мл клеток + 0,5 мл, упакованные частицы фага - 15 мкл для титром пластин] ).
   4. Оценить MF путем деления на общее число мутантных бляшек на 4 "мутант" пластин на предполагаемое общее количество Pfus в общем объеме инфицированных клеток, определенных из "титром" пластин.
7. Когда спонтанное LacZ МФ в порядке 3 х 10 ^-5 в контрольной группе, так как для MutaMouse зародышевых клеток, руководство ОЭСР рекомендует как минимум 125000 до 300000, не мутантных Pfus на животное быть экранаред для мутации, чтобы получить надежную базовую сигнал. Другие трансгенные модели могут иметь спонтанный ниже, MF, в этом случае потребовалось бы большее число Pfus. Испытание статистическую мощность может быть выполнена для того, чтобы определить минимальное количество Pfus и животных, необходимое для получения нужного разрешения. Данные из нескольких реплик, могут объединяться для удовлетворения этого требования минимального ОРП, если они не получены весьма различные мутантные частоты.

7. Статистика

Экспериментальная установка для анализа является мышь. Данные, полученные из этого анализа, как правило, обычно не распределены. Таким образом, выбрать статистический метод анализа, основанный на распределении характеристикой данных.

Примечание: Стандартный параметрические анализы (. Например, дисперсионный анализ) могут быть использованы в случае необходимости преобразования данных применяется для выравнивания дисперсию ответ по всему спектру observaции. Пуассона или биномиальных регрессионный анализ являются более подходящий. Также могут быть использованы непараметрический анализ. Мы регулярно использовать регрессии Пуассона с помощью обобщенной процедуры линейной модели (т.е.., Proc GENMOD) в SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC), как описано Лемье и др ^26.

Результаты

При средней бляшек подсчета 200000 бляшек на животное, мы, как правило, наблюдается средний фоновый MF примерно 2,8 х 10 ^-5 в мужских половых клетках при стандартном отклонении 1,7 х 10 ^-5 в наших группах контроля (на основе данных из восьми независимых эксперименты). С этого счета бляшек, фонового уровня и дисперсии, дозы групп с п = 5 животных в каждой достаточно, чтобы обнаружить увеличение 2 раза в MF с властью> 0,8.

Результаты, как правило, сообщается в табличных или графических форматов. Таблица 2 и Рисунок 6 показывает репрезентативные результаты конского спермой MutaMouse мужчин (п = 5 в группе) подвергается одной острой пероральной дозе 0, 25, 50, и 100 мг / кг N-этил-N-нитрозомочевины (ЕНУ) с последующим добавлением 70-дневного времени выборки. Это 70-дневный период позволяет измерять мутационных событий, которые произошли в сперме, которые были сперматогониальные стволовые клетки в момент воздействия (рисунок 3). Типичные плотности доски на мутантных и титром пластин показаны на рисунке 7. Как показано в таблице 2 и на рисунке 6, острое воздействие ЕНУ вызвало значительное дозозависимое увеличение МФ сперматогониальных стволовых клеток. Низкая доза вызвало значительное 2,6 раза больше, чем управления, который имел базового MF 2,6 х 10 ^-5. Максимальная индукция произошло в высокой дозе, которая вызывала в 4,4 раза больше, чем в контрольной.

Примером такого анализа, выполненного на семенных канальцах зародышевых клеток могут быть найдены в Douglas и соавт. ^27, где МФ был определен в зародышевых клетках канальцев через различные интервалы времени после 5-дневного повторного внутрибрюшинной инъекцией 50 мг / кг ЕНУ. В этом исследовании, мутантные частоты в семенных клеток увеличивается до 15 дней после лечения и остается постоянной.

Expoуверен режим	Собранные ткани	Собранные тип клеток (клетки-мишени)	Фаза клетки-мишени в начале контакта	Фазы прошло во время экспозиции
Острая + 70	Конского	Зрелые сперматозоиды	Стволовых клеток	Стволовых клеток
14 + 21	Конского	Зрелые сперматозоиды	Сперматогонии	Сперматиды
14 +35	Конского	Зрелые сперматозоиды	Стволовых клеток	Сперматоцит
28 + 3	Конского	Зрелые сперматозоиды	Сперматоцит	Сперматоцит Сперматиды Зрелые сперматозоиды
	Трубочки	Стволовых клеток	Стволовых клеток	Стволовых клеток
		Сперматогонии	Spermatogonia	Сперматогонии
		Сперматоцит		Сперматоцит
		Сперматиды		Сперматиды
28 + 49	Конского	Зрелые сперматозоиды	Стволовые чел	Стволовых клеток
	Трубочки	Стволовых клеток Сперматогонии Сперматоцит Сперматиды	Стволовых клеток	Стволовых клеток

Таблица 1 Типы клеток и фазы сперматогенеза, которые ориентированы на трансгенных мутаций грызунов анализа различными экспериментальными конструкций.

Группа Доза	Животное #	Мутант PFU	Всего PFU	MF (х10 -5)	Средняя MF (х 10 -5)	Сменить	р-значение
Управления	1	5	180245	2.8	2.6	1.0	-
	2	4	137835	2.9
	3	11	385672	2.9
	4	2	431396	0.5
	5	6	152413	3.9
25 мг / кг	6	17	162353	10.5	6.9	2.6	0.0002
	7	14	150094	9.3
	8	4	154401	2.6
	9	9	154401	5.8
	10	12	196978	6.1
50 мг / кг	11	17	155727	10.9	9.3	3.6	<0,0001
	12	11	135847	8.1
	13	25	193499	12.9
	14	12	133859	9.0
	15	14	252807	5.5
100 мг / кг	16	26	170968	15.2	11.5	4.4	<0,0001
	17	28	234584	11.9
	18	10	145289	6.9
	19	35	292236	12.0
	20	22	190848	11.5

Таблица 2 Частота мутантного LacZ в конского спермы трансгенных мужского млед подвергается остро в ЕНУ, когда они были сперматогониальные стволовые клетки (время администрация = 1 день, время выборки = 70 дней). PFU = блок формирования бляшек, MF = мутантный частоту.

Рисунок 1 схематическое изображение конструкции фаг λgt10.

Рисунок 2 контур трансгенных зародышей грызунов мутации клеток анализа.

Рисунок 3 схема сперматогенеза у мышей и клеточных типов и фазоваяэс, которые ориентированы на трансгенных мутаций грызунов анализа различными экспериментальными конструкций. Примечание: окончившие белые полосы представляют относительной доли типов клеток, присутствующих в суспензии клеток, полученных из семенных канальцев (т.е. сперматидах> сперматоциты> Сперматогены> стволовые клетки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис.4 Коллекция мыши конского придатка. А) Сделайте надрез в брюшной полости по направлению к мошонке. B) Определите придатка жировой ткани. C) Осторожно вытяните жировой ткани, чтобы вытянуть яички и придатки. D) Найдите и акцизного конского придатки.

Рисунок 5. Подготовка суспензии половых клеток от семенных канальцев. А) разрез делается в эпителиальной капсулы яичка, подвергая семенных канальцев. B) семенных канальцев выдавливаются из капсулы. C) ткани валик аккуратно прошел мимо канальцев под углом 5-10 ° к освободить зародышевые клетки, содержащиеся в. D) подвеска зародышевой клетки, собранные для дальнейшей обработки.

Рисунок 6 Графическое представление LacZ мутантного частоты в MutaMouse спермы подвергается остро, как стволовые клетки, чтобы ЕНУ (N = 5). Каждыйтреугольник представляет MF одного животного. * р <0,05, как определяется регрессии Пуассона.

Фигура 7. Представитель агара из трансгенной грызунов мутация пробирного с бляшек образуется на газоне Е. палочки бактерий-хозяев. А) "мутантные" тарелки будет очень мало бляшки (отмеченные стрелками), особенно в группах доз управления, которые будут время от времени имеют нулевые бляшки на некоторых пластинах. Б) "титр" тарелки могут иметь сотни бляшек.

Обсуждение

По сравнению с традиционными методами, TGR мутация половых клеток анализ обеспечивает более быстрый, более экономичные и более чувствительные способы количественной индуцированных в естественных мутаций зародышевых клеток. По оценке трансгена MF непосредственно в сперме, в отличие от потомство, количество животных, время и ресурсы, необходимые для оценки зародышевой линии мутагенность любого одного соединения значительно снижается. С точки зрения чувствительности, мы смогли обнаружить значительное 2,6 кратное увеличение сперматогониев стволовых клеток MF после воздействия 25 мг / кг ЕНУ, используя только 5 животных на группу дозы. В отличие от этого, конкретного локуса анализа не удалось обнаружить никаких существенных изменений в МФ в этой же дозе, используя> 3000 мышей в открытой группы и> 500 000 ²⁸ контрольных мышей.

В дополнение к его пригодности для обеих механистических и нормативных исследований, этот метод дает возможность сравнительных исследований между соматическими и зародышевой линии mutatiпо темпам. Последние данные свидетельствуют о том, что для некоторых агентов зародышевые мутации клеток может быть вызвана при более низкой концентрации, чем требуется для соматических мутаций. Например, длительное пребывание на N-hydroxymethylacrylamide, метаболит пищевой канцероген акриламид ^12, увеличивает частоту доминантных летальных мутаций зародышевых клеток у мышей, не влияя на частоту микроядер в эритроцитах, традиционный меру соматических клеток цитогенетических повреждений ^13. Кроме того, экспозиция мышей в обеих основного потока и побочного табачного дыма является причиной повышенных частотах мутации в тандемного повтора локусов ДНК в сперме в дозах, не увеличивающих микроядер крови частоту ^14. Эти выводы оспорить предположение, что соматические тестирование генотоксичности всегда защищает зародышевой линии, и усилить спрос на более эффективных и экономичных средств для количественной частоты мутаций клеток зародышей. Тем не менее, доказательства льготных мутагенов зародышевых клеток по-прежнему слаб, В основном в связи с отсутствием доступных данных для сравнения частота мутаций в соматических и половых тканей клеток. TGR мутация анализ позволяет параллельное тестирование и сравнение индуцированных частоты мутаций в нескольких тканях, использующих тот же трансген. Таким образом, сравнительный мутация тестирования с использованием анализа TGR бы помочь заполнить пробелы в данных окружающие возможность льготных эффектов зародышевых клеток.

Одновременное оценка соматического и зародышей мутации клеток для нормативной тестирования будет также повысить эффективность за счет сокращения количества животных, необходимых. Руководящие принципы ОЭСР для соматической мутации рекомендует 28 день время на администрирование, а затем трехдневного времени выборки (28 + 3). Анализ конского спермы может предложить слабую чувствительность в этот момент времени, так как он нацелен на клетки подвергаются главным образом в течение сперматоцит и сперматид этапах сперматогенеза (рисунок 3). Клетки в этих фазах не синтезируют ДНК и постепенно теряют свою способность к репарации ДНК ^{6 <}/ SUP>. Кроме того, отбор проб конского спермы в этот момент времени не сможет обнаружить мутации, происходящие в сперматогенов и стволовых клеток. Таким образом, для интеграции в 28 + 3 дизайна, Руководящие принципы ОЭСР рекомендует собирать зародышевые клетки от семенных канальцев. Это смешанное население содержит клетки, полученные из синтез ДНК и ремонта опытным типов клеток, в том числе стволовых клеток, и подвергаются по большей части сперматогенных фаз. Тем не менее, в связи с смешанный характер этих клеток, семенных канальцах анализ клеток не дает информации фазы конкретного. Кроме того, есть опасения, что наличие нецелевых клеток может влиять на наблюдаемую MF (например ложноположительные зародышевых клеток мутагенные звонки за счет загрязнения мутировавших соматических клеток, или разбавления мутировал сигнала зародышевых клеток от ДНК ремонт-дефицитных половых клеток) . В настоящее время данных недостаточно для вывода о том, результаты семенных канальцев клеток в 28 + 3 предложению же чувствительность и специфичность вс конского сперма на более поздние моменты времени. Наша лаборатория в настоящее время по сравнению индуцированных МЖ в семенных канальцах клеток и конского спермы, собранных после различных времен выборки для решения этой точки. Отметим, что Руководящие принципы ОЭСР предлагает альтернативный время дискретизации 28 дней для медленно разделительных тканей, таких как печень, что может также быть пригодны для анализа зародышевых клеток. Тем не менее, имеющиеся данные по-прежнему недостаточно, и мы в настоящее время не в состоянии рекомендовать один единственный экспериментальный дизайн для одновременного анализа соматических клеток и половых клеток, используя мутация пробирного TGR для нормативной тестирования.

Одной из характерных черт этого анализа, которые необходимо отметить, что мутационные события оцениваются на не-мышиного трансгена. Тем не менее, имеется достаточно доказательств того, что трансгенная реагирует на мутагенов окружающей среды в аналогичным образом в эндогенных генов ^20. Кроме того, так как точное происхождение из независимых мутаций труднорешить, результаты, как правило, представлены как мутантного частоты (в отличие от частоты мутаций). Фактическая частота мутаций может быть решена, если результаты с поправкой на клоновых расширения (т.е.. Разделения и умножения одной мутантной клетки, которые могут способствовать наблюдаемой частоты трансгенных мутантов) путем секвенирования ДНК. Секвенирование мутантных трансгенов может быть выполнена, чтобы охарактеризовать LacZ мутации и идентификации мутантов, которые могут быть получены из клональных событий расширения, хотя это значительно увеличивает время и стоимость анализа. В дополнение к гена LacZ, theλgt10 трансгенного вектора альтернативного таит в зависимости от температуры мутации гена-репортера: вариант гена λ CII, который короче, (294 п.н. против на 3021 п.о. LacZ, Рисунок 1) и проще в последовательности ^29. Секвенирование также позволяет анализ спектра индуцированных мутаций, содержащие информацию в mutatioNAL механизм рассматриваемых соединений. Крайним примером клональной экспансии является появление "джекпот" мутации (т.е.., Трансгенные мутации в очень ранней стадии развития органа о том, что вносят вклад в резко повышенной MF, иногда от сотен до тысяч раз больше, чем фон). Животные или ткани с "джек-пот" мутации должны быть исключены из анализа.

Анализ, что мы описали широко применима к другим ТТГ моделей, таких как BigBlue мыши и крысы, и плазмиды мыши LacZ, все, которые несут подобные мутации репортерных векторов (обзор в ^20). Подавляющее большинство исследований половых клеток проведенных на сегодняшний день, которые используют подобные методы были сосредоточены почти исключительно на хорошо характеризующиеся мутагенов, таких как ЕНУ и излучения (обзор ^30). Ожидается, что с недавним выпуском тестового руководством ОЭСР для анализа TGR, этот анализ будетвсе более популярным для химической скрининга и нормативной оценки. Включение в TGR зародышевых клеток мутация пробирного в нормативно тестирования батареи заполнит существующий пробел, позволяя эффективно оценку индуцирования мутаций в половых клетках ^11. Кроме того, этот анализ может быть использован для измерения MF практически в любой ткани, что обеспечивает подходящие средства для сравнения относительной чувствительности соматических клеток и половых клеток к индукции мутаций факторов окружающей среды при одинаковых генетических конечных точек.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MutaMouse	Covance	-
E. coli (lacZ-/galE-)	Covance	-	See reference 25 in manuscript
Chloroform	Caledon	3001-2-40
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS)	Gibco	14190-250
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M, pH 8	Sigma-Aldrich	03690 FLUKA
Isoamyl alcohol	Caledon	2/10/7900
Lennon LB broth base	Invitrogen	12780-029
Stainless steel mesh filter	Sigma-Aldrich	S3770
Transpack packaging extract	Agilent Technologies	200220
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH)	Commercial Alcohols	-
Ampicilin	Gibco	11593-027	prepare 20 mg/ml in dH2O
Kanamycin	Gibco	11815-024	prepare 5 mg/ml in dH2O
Phenol	Invitrogen	15509-097	Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal)	Sigma-Aldrich	P6501	dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide
Proteinase K	Invitrogen	25530-031	prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample
Sodium acetate (NaAc)	Fisher Scientific	BP333-500	prepare 3 M solutution, pH 5.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L4390	prepare 10% solution in dH2O
1 M MgSO4			24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
LB Broth			5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclave and cool
Saline sodium citrate (SSC)			150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0
SM Buffer			5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1 L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
TE buffer			10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8