Трансплантация клапана легочной артерии с помощью мыши Модель гетеротопической Трансплантация сердца

Резюме

Для того чтобы понять клеточные и молекулярные механизмы, лежащие neotissue формирование и развитие стеноза в ткани инженерии клапанов сердца, была разработана мышиной модели гетеротопической трансплантации сердца клапана. Легочное сердце клапан был пересажен получателю с помощью гетеротопической технику трансплантации сердца.

Аннотация

Тканевые инженерии клапанов сердца, особенно decellularized клапаны, начинают набирать обороты в клинического использования реконструктивной хирургии со смешанными результатами. Тем не менее, клеточные и молекулярные механизмы развития neotissue, клапана утолщения и развития стеноза не исследовал экстенсивно. Чтобы ответить на эти вопросы, мы разработали мышиный гетеротопической клапана сердца модель трансплантации. Клапана сердца собирали из клапана мыши-донора и пересадить к сердечному мыши-донора. Сердце с новым клапаном был пересажен гетеротопически к мыши-реципиента. Пересаженного сердца показали свой сердцебиение, независимо от сердцебиения получателя. Кровоток измеряют, используя высокую ультразвуковую систему частоты с помощью импульсного волнового Доплера. Поток через имплантированного клапана легочной артерии показал вперед поток с минимальным срыгивания и пиковый поток был близок к 100 мм / сек. Это мышиной модели трансплантации сердечного клапана является Highlу универсальным, так что он может быть модифицированы и адаптированы, чтобы обеспечить различные гемодинамические сред и / или могут быть использованы с различными трансгенных мышей для изучения neotissue развитие в ткани инженерии клапанов сердца.

Введение

Врожденные сосудистые дефекты являются одним из ведущих причин детской смертности в западном мире ^1,2. Среди них, стеноз легочной артерии клапана и двустворчатый аортальный дефекты клапанов часто встречающиеся формы ^3. Замена клапанов сердца хирургия является рутинной выбор реконструктивных операций; Однако осложнения, включая стеноз и кальцификации клапана сердца, и на протяжении всей жизни зависимость от антикоагулянтов являются существенным источником хронического нездоровья и смерти ^4-7. Кроме того, отсутствие потенциала роста требуется операции редактирования, который еще больше увеличивает смертность этих молодых пациентов ^4,8,9.

В попытке разработать функциональную замену сердечного клапана с потенциалом роста, Shinoka др.. Сеяных аутологичных клеток на биоразлагаемых синтетических сердечного клапана ^8. Синтетический клапан трансформируется в родном сердечного клапана, как структура с Potenti ростадр.. Предварительные крупные исследования на животных показали возможность использования этой методологии для создания функциональной сердечный клапан ^10. Однако долговременные имплантации исследования показали плохую прочность из-за прогрессирующего утолщения neotissue клапана в результате сужения клапана сердца. Работа с Sodian соавт. Использовали методологию Shinoka, но в конечном счете заменить матрицу PGA с биоразлагаемым эластомера, который дал биомеханические свойства ткани инженерных клапана построить более физиологический профиль ^9,11,12. В исследовании в естественных условиях, несмотря на успех имплантации, сливающийся эндотелиальных клеток подкладка была не сформирована, которые могли бы ограничить долгосрочный успех этого эшафот ^12.

Для того, чтобы рационально проектировать улучшенное второе поколение синтетического сердечный клапан, на мышиной модели трансплантации клапана сердца была создана для расследования клеточные и молекулярные механизмы underlyinформирование г neotissue, клапан утолщение, и развитие стеноза. Мышиные модели предлагают широкий спектр молекулярных реагентов, в том числе трансгенных, которые не являются легкодоступными для других видов ^7. В этом сердечной трансплантации клапана модели, экс естественных сингенными замена легочное сердце клапана была выполнена первая; и тогда сердце с имплантированным сердечным клапаном был имплантирован гетеротопически в сингенной хозяина с помощью микрохирургической техники. Эта модель позволяет замену клапана сердца без необходимости искусственного кровообращения.

В данной работе, подробное объяснение урожай клапана сердца, препараты донорской сердце, трансплантация сердца клапан, и гетеротопическая трансплантация сердца описывается. Результаты показали непрерывный сердцебиение от донорского сердца, которая была независимой от сердцебиения получателя. Кровоток через имплантированного клапана легочной артерии измеряли с помощью высокой ультразвуковую систему частот с импульсно-волновом лиppler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Все животные процедуры были одобрены комитетом больницы Уходу за животными и использовать Национальная детская мимо.

1. Легочная клапана сердца Добывается из донорского сердца Valve Mouse

1. Автоклав все хирургические инструменты перед операцией: 1x тонких ножниц, 3x микро щипцы, 2x микро сосудистые зажимы, 1x зажим, применяющие щипцы, 1x микро держатель иглы, 1x весенние ножницы, 1x втягивающим.
2. 6-8 недельных самок C57BL / 6 мышей используют в качестве доноров легких сердечного клапана. Отключив мышь из клетки и взвесить его, то эвтаназии с кетамин / ксилазина коктейля (Кетамин, 200 мг / кг и ксилазина, 20 мг / кг, IP) передозировка.
3. Клип грудь и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Затем сделайте торакотомию. Expose сердце, сделать небольшой разрез на правом предсердии, и заливать левого желудочка с ледяной физиологический раствор.
4. Грубо рассекают легочной артерии (ПА) из восходящего аОрта. Вырежьте легочного клапана (PV) наряду с 2 мм манжеты легочной артерии. Утилизировать оставшейся части сердца.
5. Хранить PV в холодной гепарина и солевым раствором (100 единиц / мл). Примечание: PV может храниться в растворе в течение двух часов перед трансплантацией в донорского сердца.

2. Донорское сердце Подготовка

1. 6-8 недельных самок C57BL / 6 мышей используют в качестве доноров сердца. Отключив мышь из клетки и взвесить его, то эвтаназии с кетамин / ксилазина коктейля (кетамина, 200 мг / кг и ксилазина, 20 мг / кг, IP) передозировки. Это процедура терминал.
2. Клип грудь и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Затем сделайте торакотомию. Грубо отделить сердце, нижнюю полую вену (IVC), верхней полой вены (SVC), восходящей аорты, PA, и легочную вену. Заливать IVC ледяной стерильного физиологического раствора.
3. Лигируют IVC, SVC, и легочную вену с 6-0 шелковой нити затем разрезают превосходитлигатуры.
4. Разрежьте аорты и ПА с 2 мм манжеты.
5. Вырежьте PV и распоряжаться им.

3. Клапана сердца Трансплантация на донорское сердце

1. Сразу после шага 2.5, поместите клапан сердца, начиная с шага 1.5 в донорского сердца и ориентировать сердечный клапан.
2. Закрепите PV с стежка на правой стороне клапана, используя 10-0 мононити швов на конических игл и начать сшивать непрерывно с 5-6 Stiches от другой стороны PV.
3. После окончания переднюю сторону, повернуть сердце горизонтально и начать сшивать заднюю сторону ФВ на донорского сердца.
4. Хранить сердце в холодном стерильного раствора гепарин / физиологического раствора. Примечание: донорское сердце может храниться в растворе в течение двух часов перед имплантацией к мыши-реципиента.

4. Гетеротопическая Трансплантация сердца на Получателю Mouse

1. 6-8 недельных самок C57BL / 6 мышей использовали в качестве RECIpient. Удалить мыши из клетки и взвешивают его, а затем анестезировали кетамином / ксилазина коктейль (кетамин, 100 мг / кг и ксилазина 10 мг / кг). Кетопрофен (5 мг / кг) используют в качестве предварительных мероприятий по наркозу анальгетик.
2. После проверки уровня седации хвостом щипать, обрезать брюшного пресса и волосы на груди. Смажьте глаза стерильной глазной мази, и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Лечить живот бетадином и алкогольной колодки. Затем накрыть мышь с стерильной драпировки и разоблачить область разреза только.
3. Сделайте срединный лапаротомии разрез от ниже xyphoid к надлобковой области, и вставить самостоятельно стопорное втягивающим. Оберните кишечник в солевом смоченной марлей. Грубо определить инфраренальной аорту и полую вену.
4. Поместите два 6-0 шелковые швы проксимально и дистально вокруг аорты и нижней полой вены сдерживать кровообращение.
5. Поместите донорского сердца на правой стороне брюшной аорты и покрыть ее стерильной Гауге. Увлажнение его физиологическим раствором.
6. Сделать aortotomy в брюшной аорты с использованием 30 г иглы и расширить отверстие с помощью ножниц до размера доноров аорты.
7. Выполните конца в сторону анастомоза с использованием стерильных 10-0 мононити швов на конических игл. Безопасность донорской аорты с одним швом на проксимальном конце отверстие в брюшной аорты и начинают шов непрерывно с 4-5 Stiches от дистального конца брюшной аорты.
8. Флип сердце с левой стороны, покрыть ее солевым придают марли, и начинают шов непрерывно с 4-5 Stiches от дистального конца брюшной аорты.
9. Сделайте венотомия в НПВ, используя 30 г иглы и расширить отверстие до размеров доноров легочной артерии.
10. Выполните конец в сторону анастомоза с использованием стерильных 10-0 мононити швов на конических игл. Безопасный донор ПА с одним швом на проксимальном конце отверстие в нижней полой вены и начинают шов непрерывно с 4-5 Stiches издистальный конец нижней полой вены. На этот раз, потому что аорта находится в пути, убедитесь, ушивание левой стене ПА донора находится на внутренней нижней полой вены.
11. Флеш просвет IVC с гепарином и солевым раствором (100 единиц / мл). Закройте правую стену доноров ПА и получателя IVC сшиванием их постоянно к дальнему концу.
12. Удалить дистального лигатуры и контролировать кровотечение, применяя актуальные рассасывающиеся стерильную кровоостанавливающего средства. Когда кровотечение останавливается полностью, удалить проксимального шва и контролировать кровотечение так же.
13. Вернуться кишечник и закрыть брюшную мускулатуру и кожу в два слоя с использованием 6-0 черный полиамид мононити шов.
14. Введите 0,5 мл физиологического раствора подкожно и поместите курсор в восстановление клетке на потепление площадку, пока мышь не является полностью мобильным. После восстановления, возвращения мышь на новую клетку с бумажной постельные принадлежности. Дайте обезболивающее (ибупрофен, 30 мг / кг, питьевой воды) в течение 48 часов. Делатьне возвращать животное, которое претерпела операцию по компании других животных, пока полностью не выздоровел.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1 показаны схемы клапана трансплантации модели сердца с помощью гетеротопической трансплантации сердца. Клапана сердца собирали из донорского сердца и имплантируют в сердце из второго мыши-донора. Затем сердце с новым сердечного клапана имплантировали в брюшную п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Смертность этой процедуры близка к 20%, что в основном вызванной кровотечением в месте трансплантации PV и анастомоза на донорской аорты получателю брюшной аорты. В большинстве случаев, смертность значительно снижает 48 ч после операции. Мыши выживания показал сильные удары сердца и кров...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14190-144
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine Sterile Solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Sientific	23-400-118
Fine Scissor	FST	14028-10
Micro-Adson Forcep	FST	11018-12
Clamp Applying Forcep	FST	00072-14
S&T Vascular Clamp	FST	00396-01
Spring Scissors	FST	15008-08
Colibri Retractors	FST	17000-04
Dumont #5 Forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - Fine Forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 Forceps	FST	11251-35
Tish Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For sutureing the graft
Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non Woven Sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1 1/2 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in., Needle	BD	305125
30 G 1 in., Needle	BD	305106
Warm Water Recircultor	Gaymar	TP-700
Warming Pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500
VEVO2100 High Frequency Ultrasound	VisualSonics	http://www.visualsonics.com/vevo2100	The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives.
Ultrasound transmission gel	Parker Laboratories, INC.	01-02
Table Top Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip, INC.	901806
Isoflurane	Baxter	1001936060