JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Аннотация

Существенный прогресс был достигнут в определении механизма митохондриальной редактирования РНК в трипаносом. Точно так же, значительный прогресс был достигнут в выявлении компоненты editosome комплекса, которые катализируют редактирование РНК. Тем не менее, он по-прежнему не ясно, как эти белки работают вместе. Химические соединения, полученные с экрана высокой пропускной против editosome может блокировать или повлиять на один или более этапов в цикле редактирования. Таким образом, выявление новых химических соединений будет генерировать ценные молекулярные зонды для рассечения функцию editosome и сборку. В предыдущих исследованиях, в пробирке редактирования анализы проводились с использованием радиоактивно меченного РНК. Эти анализы требуют много времени, неэффективны и не подходят для целей высокой пропускной. Здесь, однородная флуоресценции основе "смешивать и измерения" молот рибозим в пробирке репортер анализа для мониторинга редактирование РНК, представлена. Только как следствие редактирования РНКмолот рибозим флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) олигорибонуклеотид субстрат подвергают расщеплению. Это в свою очередь приводит к разделению флуорофора от гасителя с получением таким образом сигнал. В противоположность этому, когда функция editosome ингибируется, сигнал флуоресценции будет гасили. Это очень чувствительный и простой анализ, который должны широко применяться для мониторинга в пробирке редактирования РНК или высокопроизводительного скрининга химических веществ, которые могут препятствовать функцию editosome.

Введение

Процесс редактирования РНК, пост-транскрипционного модификации мРНК, был впервые обнаружен в trypanosomatids 1. С тех пор, значительная работа была проведена в изучении механизма за редактирование РНК в Trypanosoma brucei 2,3. В серии ферментативных реакций, editosome, основной комплекс около 20 белков, создает зрелых митохондриальных мРНК для нескольких компонентов генерирующего энергию окислительного фосфорилирования системы. Порядок каталитических событий эндонуклеолитического декольте, uridylate (U) добавление или удаление, и перевязки, как это диктуется направляющих РНК (gRNAs) 4.

В дополнение к основным editosome сложных белков, ряд дополнительных факторов были также определены 5-7. Эти белки в основном видели сгруппированы в независимых комплексов. Тем не менее, порядок сборки белка в editosome комплекса основного и шаблоны взаимодействия основного комплекса с аксессуаркомплексы еще предстоит определить. Ориентация на процесс редактирования РНК в trypanosomatids может обеспечить химические Диссекторы, которые помогают в изучении сборку и функцию editosome комплекса. Кроме того, функциональные исследования на нескольких editosome белков показали существенности через разных этапах жизни, что свидетельствует об их потенциал как препарат нацелен 8-12. Таким образом, найдено ингибиторы editosome может также действовать в качестве ведущих соединений против trypanosomatids. Это своевременно, как имеющиеся в настоящее время препараты против заболеваний, вызванных trypanosomatid являются токсичными, неэффективной и дорогой 13,14.

Эффективным и удобным для анализа в пробирке необходимо исследовать химический вселенную для специфических ингибиторов, которые блокируют редактирование РНК. Три анализы были разработаны и используются для мониторинга editosome деятельности: (а) полный раунд в пробирке редактирования РНК анализа 15, (б) предварительно расщепляется в пробирке редактирования РНК анализа 16,17,й (с) молот рибозим (HHR) на основе анализа 18. Первые два анализы полагаться на прямой визуализации редактируемого продукта (АТФазы 6 мРНК) с помощью радиоактивности. HHR основе анализа использует модифицированную версию АТФазы 6 мРНК, что моделируется вести себя как рибозим при редактировании. Функциональная Рибозим затем специально расщепляет радиоактивной РНК субстрат, выступающей в качестве репортера. Недавно Moshiri соавт. Разработали 'смешивать и измерять' HHR основе в пробирке анализе репортерного контролировать редактирование РНК, где радиоактивно помеченных РНК-подложка заменяется переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET) подложки 19. Основными преимуществами данного анализа являются: (а) это быстрый и удобный смеси и мера тип анализа, как производство активного рибозима и подложки расщепления происходят одновременно в той же пробирке в малом объеме (т.е. 20 мкл), (б ) это позволяет избежать использования радиоактивно меченых материалов, (в) чувствительность то естьfforded с помощью флуоресцентной приборов в формате микро-титра пластины, и (г) высокое отношение сигнал-шум. С помощью этого анализа, эффект известными редактирование РНК лигазы ингибиторов против очищенного editosome было подтверждено 19. Этот эксперимент подтвердил правильность анализа для быстрой идентификации ингибиторов редактирования РНК, в первую очередь против целых editosomes от Т. brucei.

Рисунок 1 представляет собой подробное шаг за шагом схема флуоресценция основе в пробирке редактирования РНК анализа. Этот протокол может быть использован для мониторинга редактирование РНК в пробирке или быть легко адаптирована для скрининга библиотек соединений различных масштабов.

протокол

Протокол ниже описана процедура для выполнения флуоресценции на основе РНК-редактирования анализа. Анализ может быть выполнен в одной пробирке ПЦР, 96-луночный, или 384-луночных планшетах в зависимости от объема эксперимента. Впоследствии сигнал флуоресценции можно прочитать на соответствующей ПЦР в реальном времени системы обнаружения. Анализ описано здесь в контексте 384-луночных планшетах.

1. Культивирование Т. brucei Клетки

  1. Подготовьте питательную среду для Т. brucei проциклической формы клеток. Для 1 л среды:
    1. Растворите 25,4 г СДМ-79 порошок в 800 мл miliQ воды.
    2. Добавить 2 г NaHCO 3 и рН до 7,3 с помощью 10 М NaOH.
    3. Добавить NanoPure воду до конечного объема 900 мл, фильтр стерилизуют.
    4. Добавить фетальной бычьей сывороткой (FBS), пенициллин-стрептомицина и раствор Hemin (2,5 мг / мл) до конечных концентраций 10% (об / об), 100 Ед / мл и 7,5 мг / л соответственно.
  2. Вырастить 300 мл Т. brucei 1.7A дикого типа (проциклической форма) клеток при 28 ° С, тряску при 70 оборотах в минуту до плотности 1,5 х 10 7 клеток / мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно произвести 3 мл активного editosome с ~ 0,5 мг общего белка, достаточное для 600 реакций редактирования.
  3. Сбора клеток путем центрифугирования при 6000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  4. Промыть гранулу с 50 мл охлажденного буфера ПБСГ (10 мМ Na 2 HPO 4, 10 мМ NaH 2 PO 4, 145 мМ NaCl и 6 мМ глюкозы) и спин вниз клетки снова центрифугированием при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.

2. Выделение Crude Митохондрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены на льду или при температуре 4 ° С, чтобы сохранить editosome деятельность.

  1. Ресуспендируют собранных клеток в 30 мл DTE буфере (1 мМ Трис-HCl, рН 8,0 и 1 мМ ЭДТА). Используйте 40 мл стерильной Dounce гомогенизатора (предварительно охлажденной), чтобы сорвать клеточную мембрану поглаживая вверх и вниз, по крайней мере 10 раз на льду.
  2. Сразу же добавить 4,3 мл 60% сахарозы (в / о, т. е. 1,75 M) в гомогенате до конечной концентрации 0,25 М. центрифуге при 15800 х г в течение 10 мин при 4 ° С, предпочтительно, чтобы сбить митохондрии.
  3. Ресуспендируют осадок митохондрий в 4,6 мл STM буфера (20 мМ Трис-HCl рН 8,0, 250 мМ сахарозы и 2 мМ MgCl 2). Добавить 13,8 мкл 0,1 М CaCl 2 и 4 мкл РНКазы ДНКазы I до конечных концентраций 0,3 мМ и 9 ед / мл, соответственно. Выдержите смесь в течение 1 часа на льду.
  4. Добавить 4,6 мл STE буфера (20 мМ Трис-HCl рН 8,0, 250 мМ сахарозы и 2 мМ EDTA) для инактивации ДНКазы I. центрифуге при 15800 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  5. Ресуспендируют гранул в 400 мкл буфера для лизиса (10 мМ Трис-HCl рН 7,2, 10 мМ MgCl 2, 100 мМ KCl, 1 мкг / мл пепстатина, 1 мМ DTT, и 1x полное ЭДТА без ингибитора протеазы) и переход к пробирке.
  6. Добавить 10% Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% вй инкубировать лизата в течение 15 мин при 4 ° С на трубе ротатора.
  7. Очистка митохондриальной лизата центрифугированием дважды в 17000 х г в течение 15 мин при 4 ° С; сохраняя очищенной супернатант каждый раз.

3. Editosome Очистка

  1. Налейте 10 мл 10% -30% (объем / объем) линейный градиент глицерин (табл. 1) в ультрацентрифужную пробирку с помощью 2x HHE градиента буфера (40 мМ HEPES рН 7,9, 20 мМ Mg (OAc) 2, 100 мМ KCl, и 2 мМ ЭДТА) и градиент производитель, следуя инструкции по эксплуатации.
  2. Осторожно удалить 500 мкл раствора из верхней части глицеринового градиента и осторожно загрузить 500 мкл очищенной митохондриальной лизата. Вращение на 178 000 х г в течение 6 ч при 4 ° С с использованием ультрацентрифуги.
  3. Сбор 500 мкл фракции последовательно от верхней к нижней части градиента при 4 ° С. Тогда оснастки заморозить фракций не используя жидкий азот и хранят при -80 ° С до использования.

4. Получение РНК

  1. Отжиг соответствующий шаблон ДНК, содержащую последовательность, комплементарную последовательности промотора Т7 (таблица 2) с промотором Т7 олигонуклеотида (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') в молярном соотношении 1:1 при нагревании при 90 ° С в течение 3 мин и охлаждения при комнатной температуре по крайней мере, 10 мин.
  2. Расшифруйте РНК с использованием набора в пробирке транскрипции, следуя инструкции по эксплуатации.
  3. Остановить реакцию транскрипции, добавив равный объем 7 М мочевины красителя (7 М мочевины, 0,05% Ксилол Cynol, и 0,05% Бромфенол синий). Запустите на фильтре стерилизованного 9% денатурирующих полиакриламидном геле (9% акриламида, 7 М мочевину, 1x КЭ).
  4. Используйте ультрафиолетового (УФ) слежку с коротковолновой ультрафиолетовой лампой, чтобы найти и акцизного соответствующей РНК. Поместите гель вырезали кусок в пробирке и добавить 400 мкл буфера для элюции гель (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 250 мМ NaOAc, 1 мМ ЭДТА и 0,25% SDS). Элюции ночи при комнатной температуре на трубке ротатора.
  5. Precipitate элюированного РНК путем добавления 1 мл холодного 100% этанола и инкубировали либо при -80 ° С в течение 30 мин или от -20 ° C в течение ночи.
  6. Центрифуга при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° С, для осаждения вниз РНК.
  7. Вымойте гранул с 1 мл 75% этанола. Центрифуга при 16000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
  8. Ресуспендируют осадок РНК надлежащим образом в РНКазы свободной воды, чтобы достичь желаемых концентраций, как показано в таблице 2.

Флуоресценции основе анализа 5. РНК Редактирование

  1. Для одного реакции, смешайте 1 пмоль (1 мкл) preA6Rbz и 2,5 пмоль (1 мкл) gA6Rbz (1:2,5 молярное отношение) в пробирке, инкубировать при 70 ° С в течение 3 мин и оставьте при комнатной температуре в течение по крайней не менее 10 мин.
  2. Между тем приготовить основной смеси, используя таблицу 3, без preA6Rbz и gA6Rbz, для реакции редактирования, содержащего 1x HHE буфера (25 мМ HEPES рН 7,9, 10 мМ Mg (OAc) 2, 50 мМ KCl и 10 мМ ЭДТА), 1 мМАТФ, 5 мМ CaCl 2, 16 нг / мкл дрожжевой РНК Torula, 0,1% Тритон Х-100, и очищенный editosome.
  3. Добавить отожженная preA6Rbz и gA6Rbz для завершения основной смеси.
  4. Внесите 18 мкл мастер-микса (табл. 3) в лунки, содержащие либо 2 мкл РНКазы свободной воды (скважина без каких-либо соединений) или 2 мкл 200 мкМ химических соединений и включают контрольные образцы в пластине в соответствии с рисунком 5.
  5. Уплотнение тарелку с заклеивания планшетов и спин тарелку, чтобы удалить пузырьки воздуха. Инкубировать при 28 ° С в течение 4 часов.
  6. Добавить 25 пмоль (2 мкл) gA6Rbz конкурента в каждую лунку. Наведите свежий герметик, спина тарелку и положите его на ПЦР в реальном времени машины. Программирование следующий эксперимент:
    Шаг 1: 85 ° C в течение 5 мин; Шаг 2: 24 ° C в течение 10 мин; Шаг 3: Стоп.
  7. Добавить 15 пмоль (1 мкл) FRET субстрата в каждую лунку в конечном объеме 23 мкл. Уплотнение тарелку со свежим герметиком.Быстро вращать тарелку и поместить его обратно на ПЦР в реальном времени машины.
  8. Программирование новый эксперимент, выполнив следующие действия:
    Шаг 1: 37 ° C в течение 1 мин; Шаг 2: Ознакомьтесь; Шаг 3: Перейдите к этапу 1, 40 раз; Шаг 4: Стоп.
  9. Настройка тарелку, выбрав все колодцы, которые требуют чтения и выбрать FAM фильтр. Объем Входной как 23 мкл и начать работать.
  10. Рассчитать наклон значений, полученных из каждой лунки / образец для получения кинетической измерения путем построения склоны в виде столбика для анализа. ПРИМЕЧАНИЕ: кинетическая чтения улучшает отношение сигнал-шум между образцом и на заднем плане; как фон образец будет иметь наклон, близкий к нулю. Точка чтения конец имеет более высокий фоновый шум.

Результаты

Чтобы продемонстрировать необходимые шаги, необходимые для создания экрана масштабную, рис 2-5 представлены типичные контрольные эксперименты, связанные с качеством анализа. Это необходимые контрольные эксперименты для последовательного анализа в течение нескольких дней с?...

Обсуждение

Роман высокой пропускной метод скрининга для идентификации ингибиторов против редактирования комплекса РНК трипаносом был представлен, обеспечивая новый инструмент для открытия новых лекарств для борьбы заболеваний, вызванных trypanosomatids. FRET основе Рибозим анализ широко используется ...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
SDM-79 MediumGibco by Life Technologies
Fetal Bovine SerumLife Technologies12483-020heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%SigmaH5533-10G
Penicillin-Streptomycin SollutionFisher ScientificMT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free Roche4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production systemPromegaP1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders  Fisher ScientificK885300-0040  
Gradient Master, ver 5.25 Biocomp107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 mlBeckman Coulter344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge Beckman Coulter392052
SW 41 Ti ROTORBeckman Coulter331336
MicroSeal 'B' Seal, SealsBioradMSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection SystemBiorad185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)Bio BasicA0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kgLife TechnologiesAM9902

Ссылки

  1. Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
  2. Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
  3. Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
  4. Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
  5. Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
  6. Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
  7. Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
  8. Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
  9. Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
  10. Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
  11. Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
  12. Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
  13. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
  14. Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
  15. Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
  16. Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
  17. Igo, R. P., et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
  18. Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
  19. Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
  20. Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
  21. Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
  22. Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
  23. Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
  24. Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
  25. Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

89Trypanosoma bruceiEditosomeHammerhead HHRFRET

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены