Real-Time Сопротивление на основе Cell Analyzer как инструмент, чтобы очертить молекулярных путей, участвующих в нейротоксичности и Нейропротекция в клеточной линии нейронов

Резюме

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Аннотация

Многие мозговые нарушения, связанные с есть гибель нейронов, участвующих в их патофизиологии. Улучшенная в моделях пробирке изучать нейропротекторные или нейротоксическое действие препаратов и вниз по течению путей, участвующих поможет разобраться в молекулярных механизмах нейропротекции / нейротоксичности и потенциально может способствовать развитию наркотиков. Тем не менее, многие существующие анализы токсичности в пробирке иметь серьезные ограничения - наиболее оценить нейротоксичность и нейропротекцию в одной точке времени, не позволяя наблюдать во времени процесса и кинетики эффекта. Кроме того, возможность для сбора информации о последующих сигнальных путей, участвующих в нейропротекции в реальном времени будет иметь большое значение. В текущем протоколе мы опишем использование в режиме реального времени импеданса на основе анализатора клеток, чтобы определить нейропротекторные эффекты серотонина 2А (5-HT _2A) агонистов рецепторов в нейронной клеточной линии под этикеткой без и в режиме реального времени Кондитионы с помощью измерения импеданса. Кроме того, показано, что ингибиторы второго путей мессенджеров может быть использован, чтобы очертить ниже по течению молекул, участвующих в нейропротекторного эффекта. Мы также описываем полезность этого метода, чтобы определить, способствует ли действие на пролиферацию клеток к наблюдаемому нейропротекторного эффекта. Система использует специальные микроэлектронных пластин, называемых Е-листы, содержащие чередующихся золото микроэлектродов массивы на нижней поверхности лунок, выступающей в качестве датчиков клеток. Импеданс считывания изменяется по количеству прикрепленных клеток, жизнеспособность клеток, морфологии и адгезии. Безразмерный параметр называется сотовый Индекс получают из измерения электрического сопротивления и используется для представления состояния клеток. В целом, в реальном времени сопротивление основе анализатор клеток позволяет в режиме реального времени, без наклеек оценки нейропротекции и нейротоксичности, и оценки второй участия посыльного путей, способствуя болееПодробное и высокой пропускной оценка потенциальных нейропротекторами в пробирке, для выбора терапевтических кандидатов.

Введение

Гибели нейронов играет важную роль в патофизиологии многих мозга расстройств, связанных с ^1. Наличие надежной и высокой пропускной в пробирке анализов токсичности имеет решающее значение для достичь лучшего понимания тонкостей механизмов нейротоксичности и помогут при выборе нейропротекторные молекулы в качестве терапевтических кандидатов в разработке лекарственных средств ^2. Тем не менее, существует множество ограничений, чтобы наиболее широко используемые в пробирке нейротоксичности assays.They оценить поражение нервной / нейропротекцию в одной временной точке, не позволяя кинетическую разрешение; часто используют этикетку или зонд, который может вмешиваться в сигнальных путей и ограничить дополнительные исследования в той же популяции клеток, и часто трудоемкий, и во многих случаях не обеспечивают механистический понимание. В настоящем исследовании мы показали полезность в режиме реального времени импеданса на основе анализатора клеток, чтобы определить, нейротоксичность и нейропротекцию в нейронной клеточной линии в режиме реального времени и под этикеткой бесплатноусловия и обеспечить понимание последующих механизмов, с помощью анализа второго путей мессенджеров, участвующих в эффекте.

Предыдущие исследования подтвердили обоснованность анализатора в режиме реального времени клеток, чтобы определить цитотоксичность, а также воздействие на пролиферацию клеток в линии клеток по сравнению со стандартными методиками ^3,4,5,6. Например, хорошая корреляция наблюдалась между показаниями стандартного жизнеспособность клеток WST-1 анализа и ценностей Сотовые Индекс в нескольких временных точках под базальных условиях распространения и после двух различных токсичных парадигм в HeLa клеток ^3. В A549 и MDA-MB-231 клеток пролиферации и цитотоксичности, спровоцированной с микротрубочками стабилизатора паклитаксела показали очень близкие значения, когда оценивали путем измерения индекса клеток и стандартно используется сульфородамина В (SRB) анализ ^4. В нейронной клеточной линии увековечены нейронов гиппокампа НТ-22 Сотовые измерения индекса были подтверждены на их способность тO обнаружить пролиферацию клеток, цитотоксичность и глутамата цитопротекцию против широко используемого 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) 2,5-дифенилтетразоли-бромид (МТТ) ^5. В том же исследовании Результаты анализа МТТ и измерения Указатель Сотовый также хорошо коррелирует измерения нейронов пролиферацию клеток-предшественников, цитотоксичность после факторов роста лишения и спасения цитотоксичности по пан-ингибитор каспазы QVD ^5. Цитотоксичность индуцированных в клетках NIH 3Т3 по Vandetanib (роста эндотелия сосудов рецептора фактора и ингибитора рецептора эпидермального фактора роста) показали сходные результаты измеренных значений индекса с клеткой или поглощение нейтрального красного анализа ^6.

Недавно мы использовали систему анализатора клеток в реальном времени для оценки нейропротекторное действие серотонина 2A агонист рецептора _(2A 5-НТ) (±) -2,5-диметокси-4-iodoamphetamine гидрохлорид (DOI) в нейрональной клеточной линии ( SK-N-SH клетки) и скрининг для вовлечения СЕКОой посыльного пути через контроль эффективности их химического ингибирования на наблюдаемой нейропротекции ^7. Интересно, что 5-HT _2A рецепторов имеет как галлюциногенные и nonhallucinogenic агонистов (как DOI и лизурид, соответственно), которые могут активировать как общие и различные вторичного мессенджера пути ^8.

Преимущества представленной техники в том, что она позволяет собирать информацию о выживаемости клеток в реальном времени в ходе дней, чтобы очертить участие второго посыльного пути, чтобы оценить возможный вклад распространения эффектов нейропротекции, и выбрать оптимальное время Для дополнительных конечных точек исследований по той же клеточной популяции. Принципиальная схема рабочего процесса в текущем протоколе представлена ​​на рисунке 1.

протокол

1 Подготовка

1. Поместите станцию ​​в реальном времени анализатора клетки в культуре ткани инкубатор при 37 ° С и 5% СО _2. Выполняйте все обращения для культивирования клеток и фармакологические методы лечения в капот культуры ткани в стерильных условиях.
2. ПРИМЕЧАНИЕ: нейронов клеточные линии, требующие различные настройки температуры по сравнению со стандартными условиями для культуры, должны быть соответствующим образом скорректированы. Для слабо прилипшие клеточных линий, использовать покрывающие агенты, чтобы облегчить взаимодействие клеток с золотыми микроэлектродов в нижней части лунки Е-плиты 96.
3. Подготовка 1,000X исходные растворы фармакологических соединений для лечения клеточной культуры (нейропротекторов и второй ингибиторы мессенджеров путей в соответствующем растворителе - диметилсульфоксид или стерильной воды) и хранить их при -20 ° С. Используйте растворитель, как автомобиль в следующих процедур.
4. Культура человеческого нейробластомы SK-N-SH клетки в DMEM / F12, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (среда) пролиферацию клеток в культуральных колбах с 175 см ² поверхности с плотностью около 75%. Держите количество проход клеток в диапазоне (около 10 проходов), чтобы установить соответствие между экспериментов с точки зрения скорости пролиферации клеток и ответ на цитотоксичность. Предпочтительны низкие значения прохождение.
5. Промыть клейкий слой SK-N-SH клеток с PBS, и Trypsinize с 0,05% раствором трипсина-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С. Центрифуга клетки при 170 × г в течение 5 мин для удаления трипсин. Ресуспендируют клеток в 10 мл пролиферации среды. Граф клеток с прилавка скипетр клеток и регулировать количество клеток в 300 000 клеток / мл, разбавляя клетки с распространением среды.

2 Покрытие и размножение SK-N-SH клеток

1. Добавить 100 мкл распространения среды в каждую лунку по E-плиты 96 и оставить его на 30 минут в капот культуры ткани при комнатной температуре, чтобы уравновесить. Вставьте E-PLAТе 96 в режиме реального времени анализатора клеток станции в СО _{2-инкубаторе} при 37 ° С.
2. Запустите программу анализатора клеток в реальном времени. На странице Макет выберите скважины включены в эксперименте и введите в поля ввода информации о типе клеток, количества клеток, имен и концентраций химических соединений, используемых для лечения клеток.
   Примечание: Для целей данного протокола по крайней мере, 4 повтора рекомендуются для каждой обработки.
3. На странице программного Расписание определить «Шаги», включенный в эксперименте, выбрав количество зачисток измерительной ячейки Index и интервал между рабочими циклами для каждого шага. Поскольку Шаг 1 предопределено для измерения фона, выберите "Добавить шаг" и установите Шаг 2 для измерения индекса ячейки каждые 15 мин в течение 96 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для лечения, в котором, как ожидается, эффекты с быстрой кинетики, установить зачисток на более короткие промежутки времени.
4. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать автоматически заданную Шаг 1и измерить фоновый импеданс СМИ. Это значение автоматически вычитают с помощью программного обеспечения в каждой точке данных, как только клетки добавляли в лунки.
5. С помощью ранее полученного на стадии 1.5) клеточной суспензии из 300000 клеток / мл в среде распространения. 30000 клеток / лунку для клеточной токсичности / нейропротекция исследований и 15000 клеток / лунку для исследований клеточной пролиферации. Выньте E-Plate и добавить 100 мкл клеточной суспензии на лунку для клеток токсичности / нейропротекция исследований и добавить клеточной суспензии 50 мкл и 50 мкл распространения среду на лунку для исследований клеточной пролиферации. Количество посеянных клеток на лунку должно быть оптимизировано для каждой клеточной линии эмпирически.
6. Аккуратно вихревой E-Plate 96 даже для обшивки клеток. Оставьте E-Пластина 96 в течение 30 мин в капот культуры ткани при комнатной температуре, чтобы позволить решить эти клетки равномерно на дне лунки.
7. Вставьте E-Plate 96 в режиме реального времени анализатора клеток станции и начать Шаг 2 на графике рвозраст. Монитор величины индекса сотовый в течение всего эксперимента, просмотрев кривые клеток на странице участка и исходных данных индекса сотовый на Cell Index странице программного обеспечения.

3 Сыворотка Лишение

1. 24 часа в сутки после посева клеток, приостановить эксперимент, и снимите E-Plate 96 от реального времени анализатора клеток станции. Развести второй ингибиторы посланник запасов 1,000X с DMEM / F12 сыворотки среде - до 200 × конечной концентрации. Лечить клетки с 1 мкл ингибиторы второго путей мессенджеров для проверки на их участии в нейротоксичности / нейропротекции 30 мин до начала цитотоксичность, ингибирует соответствующие пути. Верните E-Plate 96 на станцию ​​и возобновить экспериментальные измерения Индекса сотовый.
2. Через 30 мин пауза эксперимент снова. Осторожно снимите распространения среду полностью от E-Plate 96 лунок с пипеткой (или многоканального пипетки), стараясь не нарушить клейкий слой клетокнаправляя край пипетки в угол скважины. Добавить 200 мкл / лунку бессывороточной DMEM / F12 среду (лишение среднего сыворотки). Обеспечить быстрый обмен клеточной культуральной среде, чтобы свести к минимуму механическое перемешивание клеток.
3. Развести соединения должны быть проверены на их нейропротективных эффектов от 1,000X складе с бессывороточной DMEM / F12, до 200 × конечной концентрации. Добавить 1 мкл соединения должны быть проверены на их нейропротективных эффектов и 1 мкл ингибиторов второй путей мессенджеров в отдельных скважин в соответствии с экспериментальной плана.
4. В клетках для исследований распространения не изменить среду. Развести тестируемых соединений с 1,000X складе 200 × конечной концентрации в среде распространения, лечения с 1 мкл на лунку и продолжают культуры в среде распространения.
5. Резюме эксперимент продолжать Сотовые измерений индекса каждые 15 мин в течение 96 ч, как ранее установлено.

4 Данныенализ

1. Для нейротоксичности / данные Нейропротекция нормализовать Cell Index к последней точке времени до медикаментозного лечения или смены среды для уменьшения различия между экспериментами, выбрав "нормализованное Cell Index" и "нормализовать Время" на странице участка.
2. Выделите скважин на странице участка для экспериментальных условиях интерес и нажмите кнопку "Добавить", чтобы построить нормированные кривые Индекс сотовый. Обратите внимание на кинетику нейротоксического / нейропротекторного эффекта или вторичных мессенджеров торможения в виде нормализованных кривых Индекс клетки как функцию времени.
3. Заметим, кривые Индекс ячейка для тестируемых лекарственной терапии в среде распространения в зависимости от времени, чтобы оценить, насколько действие на пролиферацию участвует в нейропротекторного / нейротоксического эффекта.
4. Экспорт экспериментальную информацию для всех форумов сотовый временных точках из клетки странице программного Index в файл Excel, чтобы начать статистическую оценку результатов
   Примечание: В качестве первого шага в статистическом анализе набор модифицированных программ MATLAB, которые используют Т-теста в Уэлча, с р-значение нанесены semilogarithmically, использовать перевернутую ось против временной шкале (при условии, в качестве дополнительных файлов кода). Эти программы позволяют обнаружить р-значений по времени процессе всего эксперимента анализатора клеток в реальном времени, и, таким образом, упрощения выбора моментов времени для более детального статистического анализа. Смотрите дополнительные материалы для получения подробной информации о программах.
5. Для статистического анализа различий в значениях Сотовые Индекс в различных условиях лечения в определенные моменты времени, выберите значения индекса сотовый в соответствующих временных точках из экспортированного файла Excel. Анализ значений индекса сотовый для выбранных временных точках с односторонним или двусторонним анализа дисперсии (ANOVA) с последующим тестом после специальной использованием статистического программного обеспечения.

Результаты

Сыворотка лишение приводит к снижению значений Сотовые индекс, который можно контролировать непрерывно с анализатором в режиме реального времени мобильный

Нейротоксические стимулы к клеткам привести к снижению значений Сотовые индекс, который можно конт...

Обсуждение

Текущий протокол представляет утилиту анализатора в реальном времени клеток для оценки непрерывно и под этикеток без условий Нейрозащитные / нейротоксическое действие соединений в нервных клеточных линий и, чтобы получить представление о втором пути мессенджеров, участвующих в эффе...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate