Tissue-моделирования Фантомы для оценки потенциального ближней инфракрасной флуоресценции визуализации приложений в хирургии рака молочной железы

Резюме

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Аннотация

Неточности в интраоперационной локализации и оценки хирургического результате статус маржа в неоптимальной исход с сохранением молочной железы хирургии (BCS) опухоли. Оптический изображений, в частности в ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) изображений, может уменьшить частоту положительного хирургического края следующую БКС, предоставляя хирургу инструмент для предварительного и интраоперационного локализации опухоли в режиме реального времени. В текущем исследовании, потенциал NIRF-управляемой БКС оценивается с помощью ткани-моделирования груди фантомы по соображениям стандартизации и учебных целей.

Грудь фантомы с оптическими характеристиками, сравнимыми с теми, нормальной ткани молочной железы, были использованы для имитации груди сохранения хирургии. Опухоль-моделирования включений, содержащие флуоресцентный краситель индоцианина зеленого (ICG) были включены в призраков в предопределенных местах и ​​отображаемого для предварительного и интраоперационная локализация опухоли, в режиме реального времени NIRF наведением резекция опухоли, NIRF наведениемоценка от степени хирургии, и послеоперационная оценка хирургического края. Настроены NIRF камеры был использован в качестве клинического прототипа для целей отображения.

Грудь фантомы, содержащие опухолевые-моделирования включений предлагают простой, недорогой, и универсальный инструмент для моделирования и оценки интраоперационной визуализации опухоли. В желатиновых фантомы имеют упругие свойства, аналогичные ткани человека, и могут быть сокращены с использованием обычных хирургических инструментов. Кроме того, фантомы содержат гемоглобин и Интралипид для имитации поглощение и рассеяние фотонов, соответственно, создания единых оптические свойства, аналогичные ткани молочной железы человека. Основным недостатком изображений NIRF является ограниченная глубина проникновения фотонов при распространении через ткани, что затрудняет (неинвазивный) визуализации глубинных опухолей со стратегиями эпи-освещения.

Введение

С сохранением молочной железы хирургия (BCS) с последующей лучевой терапией является стандартом лечения для больных раком молочной железы с Т ₁ -T ₂ карциномы молочной железы ^1,2. Неточности в интраоперационной оценки степени результате операции в положительного хирургического края в 20 до 40% пациентов, перенесших БКС, требуя дополнительного хирургического вмешательства или лучевой терапии ^3,4,5. Хотя обширная резекция прилегающей здоровой ткани молочной могут уменьшить частоту положительного хирургического края, это также будет препятствовать косметический результат и увеличить коморбидности ^6,7. Новые методы Поэтому требуются обеспечить интраоперационной обратную связь на месте первичной опухоли и степени хирургии. Оптический изображений, в частности в ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) изображений, может уменьшить частоту положительного хирургического края следующих БКС, предоставляя хирургу инструмент для предварительного и интраоперационного локализации опухоли в гEAL времени. В последнее время наша группа сообщила о первом в-человеческие суда над опухолью целевой флуоресцентных изображений в больных раком яичников, показывая возможности этой техники для обнаружения первичных опухолей и метастазов интраперитонеальные с высокой чувствительностью ^8. Прежде чем приступить к клинических исследований у пациентов с раком молочной железы, однако, возможность различных NIRF приложений обработки изображений опухолевых-мишенью в БКС может уже быть оценены доклинического использованием фантомов.

Следующий протокол исследования описывает использование изображений NIRF в ткани-моделирования груди фантомов, содержащих флуоресцентные опухолевых-моделирования включений ^9. Призраки обеспечить недорогой и универсальный инструмент для моделирования до и интраоперационная локализация опухоли, в режиме реального времени NIRF наведением резекция опухоли, оценку состоянии хирургического края, и обнаружение остаточного заболевания. В желатиновых фантомы имеют упругие свойства, аналогичные ткани человека, и могут быть сокращены с использованием обычного Surgical инструменты. В моделируемой хирургической процедуры, хирург ориентируется на тактильной информации (в случае пальпируемых включений) и визуального осмотра на операционном поле. Кроме того, изображения NIRF применяется, чтобы обеспечить хирургу в режиме реального времени интраоперационной обратной связи о масштабах операции.

Следует подчеркнуть, что изображения NIRF требуется использование флуоресцентных красителей. В идеале, флуоресцентные красители должны быть использованы, что испускают фотоны в ближней инфракрасной области спектра (650 - 900 нм), чтобы свести к минимуму поглощение и рассеяние фотонов молекул физиологически обильными в тканях (например, гемоглобин, липиды, эластин, коллаген, и вода) ^10,11. Кроме того, аутофлюоресценция (т.е. собственная флуоресценция активность в тканях за счет биохимических реакций в живых клетках) сводится к минимуму в ближней инфракрасной области спектра, в результате чего оптимальных соотношениях опухоли до-фоне ^11. По конъюгации NIRF красители для опухоли-щитомTed фрагменты (например, моноклональные антитела), направленной доставки флуоресцентных красителей могут быть получены для применения интраоперационной визуализации.

Как человеческий глаз нечувствителен к свету в ближней инфракрасной области спектра, высокочувствительным камеры требуется устройство для работы с изображениями NIRF. Несколько системы визуализации NIRF для интраоперационной использования были разработаны до сих пор ^12. В текущем исследовании, мы использовали обычай строить систему формирования изображения NIRF, который был разработан для интраоперационной применения в сотрудничестве с Техническим университетом Мюнхена. Система позволяет одновременно приобретение цветных изображений и флуоресценции изображений. Для повышения точности флуоресценции изображений, схема коррекции реализуется для изменения интенсивности света в ткани. Подробное описание обеспечивается Themelis соавт. ¹³

протокол

1 Создать Силиконовые формы для опухолевых-моделирования включений

1. Сбор твердых предметы нужной формы и размера, которые могут служить в качестве моделей для опухолевых-моделирования включений, например, бисером или мрамора.
2. Тщательно очистите моделей опухолей. Чтобы обеспечить легкое удаление из силиконовые формы, модели опухоли могут быть распылены с антипригарным спреем или покрытые тонким слоем вазелина или пчелиный воск.
3. Поместите каждую модель в отдельном тонкостенных квадратного (пластиковую) коробки с гладкой поверхностью. При необходимости зафиксировать модель на дне коробки, чтобы держать его на месте. Используйте коробку, которая немного больше, чем модели опухоли самого, чтобы не тратить чрезмерное количество силикона.
4. Налейте необходимое количество силиконового компонента А в миске и добавить силикон компонент В в соотношении 10: 1 по весу. Смешайте оба компонента тщательно. По желанию, вакуумный насос может быть использован, чтобы удалить пузырьки воздуха из силиконовой смеси.
5. Аккуратно роур силиконовую смесь в пластиковой коробке, чтобы предотвратить образования пузырьков. Силиконовая смесь должна быть обработана в течение 45 мин для получения оптимальных результатов.
6. Пусть силиконовой смеси затвердеть в течение по крайней мере 6 часов перед резкой формы и удаление модели опухоли. Необязательно, силиконовые формы может быть сокращена в зигзагообразным образом, чтобы позволить ему, чтобы соответствовать вместе чисто. Максимальная сила силикона получается через 3 дня.

2 Создание трис-буферный солевой раствор

1. Создание трис-буферный солевой раствор (TBS) раствор путем добавления 6,1 г (50 ммоль) Трис и 8,8 г (150 мМ NaCl) до 800 мл деионизированной воды.
2. Добавить 1,0 г (15 ммоль) NaN _3, чтобы блокировать кислородом гемоглобина (шаг 3.3 и 4.4) и ингибировать рост бактерий. ВНИМАНИЕ: NaN ₃ является сильный яд. Это может быть смертельным при контакте с кожей или проглатывании. Токсичность этого соединения сравнима с растворимых щелочных цианидов и летальной дозы для взрослого человекасоставляет около 0,7 г. Всегда следуйте инструкции по технике безопасности, как это предусмотрено заводом-изготовителем.
3. Отрегулируйте рН до 7,4 и довести объем до 1000 мл деионизованной воды.

3 Создание Флуоресцентные включений

1. Добавить 2 г агарозы 50 мл TBS с шага 2 выше точки плавления агарозы по сравнению с желатином (шаг 4.2) будет препятствовать включений из растворения и утечка флуоресцентный краситель при размещении в топленом желатина. Дополнительно, количество добавленного агарозы может быть изменена до 1 или 3 г, чтобы получить более мягкие или ощутимые включений опухолевые, соответственно.
2. Нагреть агарозном суспензии с использованием микроволновой печью, пока температура кипения не будет достигнута. Тщательно перемешайте, пока агарозном полностью не растворится.
3. Добавить 1,1 г (17 мкмоль) гемоглобин и 5 мл 20% Intralipid, растворенного в 50 мл TBS в агарозном смеси при постоянном перемешивании, чтобы походить на оптические характеристики окружающей ткани молочной железы фантомным (этап 4).
4. Добавить 20,0 мг (250,8 мкмоль) флуоресцентным красителем индоцианина зеленого в 83,8 мл деионизированной воды. Убедитесь, что краситель полностью не растворится.
5. Внесите 5,0 мл от этого решения и добавить его в агарозном смеси с получением конечной концентрации 14 мкМ. При желании, другие флуоресцентные красители, чем МКГ может быть использован при желании с их собственной оптимальной концентрации.
6. Аккуратно заполнить силиконовые формы, созданные на шаге 1 с горячей агарозном смеси с помощью шприца (рисунок 1А). Повторите этот процесс, пока все формы не заполнены.
7. Пусть флуоресцентные включений затвердеть при комнатной температуре в течение приблизительно одного часа. Защитите включений из света, покрывая всю форму алюминиевой фольгой.
8. После застывания, аккуратно откройте форму и выдавите включение (Рисунок 1В). При желании, использовать наконечник шприца для применения небольших капель расплавленного агарозном смеси на поверхности включения. Повторяя эту процедуру несколько раз на том же месте, небольшой туMor шпоры могут быть созданы для имитации инфильтративные опухоли.
9. Защитите агарозном включений из света и обезвоживания, обернув их в алюминиевую фольгу и храните их во влажной контейнер для хранения при 4 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование концентрации более низкой или высокой флуоресцентного красителя, чем известные оптимальная концентрация будет как приведет к снижению интенсивности флуоресцентного сигнала. Казалось бы противоречит здравому смыслу уменьшение интенсивности сигнала при увеличении концентрации красителя выше оптимальной концентрации флуоресцентного красителя обусловлено явление, известное как закалки. При оценке максимальной глубину проникновения флуоресцентного красителя в призраков, используя оптимальную концентрацию является обязательным.

4 Создание Груди Фантомы

1. Получить чашеобразную форму, чтобы создать груди фантомы нужного размера и объема, например, стеклянной или пластиковой миске. Пресс-форма должна иметь гладкую поверхность, чтобы предотвратить желатин форму прилипшей к пресс-форме. Плесень Volumе 500 мл создаст груди фантомы достаточного размера.
2. Чтобы создать молочной фантом с объемом 500 мл, добавляют 50 г желатина 250 цвету до 500 мл TBS (шаг 2). Нагреть желатин суспензии до 50 ° С при постоянном перемешивании.
3. После того, как желатин полностью не растворится, пусть желатин смесь постепенно остыть и поддерживать его при постоянной температуре 35 ° С с использованием горячей водяной бане.
4. При постоянном перемешивании, добавить 5,5 г (85 ммоль) бычьего гемоглобина и 25 мл интралипида 20% для имитации поглощение и рассеяние фотонов в ткани, соответственно.
5. Prechill в чашеобразную форму при 4 ° С в течение по меньшей мере 1 часа. Далее, заливают смесь желатина в кристаллизаторе до уровня, который соответствует заранее определенной глубине в агарозном опухоли-имитации включения (рисунок 1С). Пусть желатин смесь затвердевает при 4 ° С в течение 30 мин до одного часа.
6. После затвердевания, позиционировать опухоли-моделирования флуоресцентный агарозном включение на поверхности призрак и временно фиксируют включение с тонкой иглы. До максимум трех опухолевых-моделирования флуоресцентных включений могут быть включены в один фантом молочной железы. Достаточно места (по крайней мере, 5 см) должны храниться между отдельными опухолевых-моделирования включений (Рисунок 1D).
7. Налейте остаток теплого желатина смеси в остальной объем пресс-формы, обеспечивая сцепление обоих слоев не создавая преломления артефакты. Отметьте местоположение флуоресцентных опухолевых-моделирования включений на форму. Пусть призрак укрепить O / N при 4 ° С.
8. После того, как затвердевший, удалить иглы, используемые для временной фиксации включений и осторожно удалите молочной фантом от его формы (Рисунок 1E). Защитите молочной фантом от света и обезвоживания, обернув его в алюминиевую фольгу и хранить его в увлажненной контейнер для хранения при 4 ° С.

Юр 1 "FO: контент-ширина =" 5 дюймов "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1 последовательные стадии создания молочной железы фантомы, содержащих люминесцентные опухолевые-моделирования включений. После создания силиконовые формы на желаемой формы и размера, формы заполнены расплавленным агарозном смеси с помощью шприца (A). Опухолевые-моделирования включения различного размера и формы были произведены в текущем исследовании (B). Далее, тонкий слой расплавленного желатина смеси заливают в заказной покрытием из дерева молочной пресс-формы (С). После затвердевания, опухолевые-имитации включения расположены, временно фиксироваться, и покрыт другим слоем расплавленного желатина смеси (D). После затвердевания, молочной фантомное осторожно удаляют из формы (E). Призрак может применяться для моделирования различных NIRF приложений обработки изображений (F).ссылка = "/ файлы / ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5 Установите камеры системы NIRF

1. Система камеры NIRF для интраоперационной применения требуется для моделирования целевой визуализации NIRF в хирургии рака молочной железы. Несколько системы визуализации NIRF для реального времени изображений интраоперационная NIRF в настоящее время доступны для исследуемого использования. Хотя некоторые различия между этими устройствами существует, все они содержат источник света возбуждения (для возбуждения флуоресцентных включений опухолевых) и высокочувствительный изображений устройство для обнаружения испускаемых фотонов.
2. Убедитесь использовать источник света возбуждения достаточного волны. Для опухолевых-моделирования включений, содержащих МКГ, использовать возбуждения источника света (например, лазерный), который излучает фотоны между 750 и 800 нм. Если используется альтернативный флуоресцентный краситель, длина волны возбуждения должна быть скорректирована соответствовать мА Инструкция nufacturer в.
3. В случае, если система камеры NIRF содержит фильтр выбросов отфильтровать нежелательные фоновые сигналы, убедитесь, что правильно фильтр используется. Для опухолевых-моделирования включений, содержащих МКГ, использовать фильтр выбросов между 800 и 850 нм. Альтернативные флуоресцентные красители могут потребоваться различные фильтры выбросов, в зависимости от инструкции производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что есть без перекрытия между возбуждением и длиной волны излучения по предотвращению пересыщенных изображения. Кроме того, время захвата изображений, возможно, придется быть отрегулирована, чтобы получить оптимальные флуоресцентные изображения. В случае глубинных люминесцентных включений или слабых флуоресцентных сигналов, время захвата изображений может быть увеличена до нескольких сек до минимальной. В случае поверхностных включений или сильных флуоресцентных сигналов, время обнаружения может быть уменьшена до нескольких миллисекунд, чтобы обеспечить видео-курса флуоресценции изображений в реальном времени.

е "> 6. Моделирование NIRF визуализации приложений в хирургии рака молочной железы

1. Возьмите ткани-моделирования груди фантом от своего контейнера и поместите его на ровную нефлуоресцентный поверхности. Далее, установите устройство обработки изображений NIRF над молочной фантома, оставляя достаточное рабочее расстояние для иссечения опухоли-моделирования включений.
2. Локализации опухоли-моделирования флуоресцентный включение используя NIRF изображений и / или пальпация фантомного груди. В случае, если нет флуоресцентный сигнал не может быть обнаружен, включение либо расположены слишком глубоко в фантоме для обнаружения или время захвата изображения должно быть увеличено.
3. После того, как включение локализован, надрезать фантомное грудь и удалить опухоль имитации включение под реального времени NIRF-руководством, используя обычные хирургические инструменты. С другой стороны, включение можно вырезать руководствоваться исключительно путем осмотра и пальпации молочной фантома для имитации стандарт оказания медицинской помощи.
4. Непосредственно после удаленияопухолевой-моделирования включения, изображение хирургическое полости для любого оставшегося флуоресцентного деятельности с указанием неадекватное удаление.
5. В случае любого оставшегося флуоресцентного деятельности, вырезать включение остаток при прямом NIRF руководством пока не флуоресцентный сигнал не осталось.
6. Изображение Исключены фрагменты фантомные имитировать NIRF наведением оценку макроскопического состояния маржи. К этому, нарезать фантомное ткани в 3 - 5 мм бляшек и изображения бляшки соответственно. Флуоресценции сигнал, достигающий в хирургических краев указывает на существование положительного хирургического края.

Результаты

Результаты этого исследования были ранее зарегистрированы в других местах ^9.

Наши данные показывают, что изображения NIRF может применяться для обнаружения люминесцентных опухолевых-моделирования включений в ткани-моделирования груди фантомов, имитируя NIRF наведе...

Обсуждение

Мы моделировали возможные клинического применения NIRF-управляемых БКС с помощью грудных в форме фантомов с интегрированными опухолевых-моделирования включений. Интраоперационная локализация опухоли, NIRF наведением резекция опухоли, оценка от степени хирургии, и послеоперационная оц?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine hemoglobin	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	H2500	Simulates absorption of photons in tissue
Intralipid 20%	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	I141	Simulates scattering of photons in tissue
Silicone A translucent 40 (2-components poly-addition silicone)	NedForm, Geleen, The Netherlands		Package consists of components A and B, that should be mixed one on one (A:B=10:1).  Link to manufacturers page: http://tinyurl.com/ncjq7jx
Gelatine 250 Bloom	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	48724	Construction of breast-shaped phantoms
Agarose	Hispanagar, Burgos, Spain		Construction of tumor-simulating inclusions
Tris	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	T1503
HCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	258148
NaCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	S9888
NaN3	Merck, Darmstadt, Germany	822335	CAUTION: severe poison. The toxicity of this compound is comparable to that of soluble alkali cyanides and the lethal dose for an adult human is about 0.7 grams.
Examples of NIRF imaging devices for intraoperative application:
T2 NIRF imaging platform	SurgVision BV, Heerenveen, The Netherlands		Customized NIRF imaging system used in the current study. More details available at www.surgvision.com
Photodynamic Eye	Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH, Herrsching am Ammersee, Germany	PC6100	www.iht-ltd.com
FLARE imaging system kit	The FLARE Foundation Inc, Wayland, MA, USA		www.theflarefoundation.org
Fluobeam	Fluoptics, Grenoble, France		www.fluoptics.com
Artemis handheld camera	Quest Medical Imaging BV, Middenmeer, the Netherlands		www.quest-mi.com
Examples of NIRF fluorescent dyes for intraoperative application:
Indocyanine green	ICG-PULSION,  Feldkirchen, Germany	PICG0025DE	Clinical grade fluorescent dye for NIRF imaging used in the current study. More details available at www.pulsion.com
IRDye 800CW NHS Ester	LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA	929-70021	www.licor.com