Мышь плода Всего кишка Культура Система для<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Манипуляция сигнальных путей и трехмерных живых изображений развития ворсинки

Резюме

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Аннотация

Большинство морфогенетические процессы в кишечнике плода были выведены из тонких срезов фиксированных тканей, обеспечивая снимки изменений более стадиях развития. Трехмерная информация из тонких серийных срезов может быть сложным для интерпретации в связи с трудностями восстановления серийных срезов прекрасно и поддержание правильной ориентации ткани над серийных срезов. Недавние открытия, сделанные Grosse др., 2011 подчеркивают важность трехмерной информации в понимании морфогенез развивающихся ворсинок кишечника ^1. Трехмерная реконструкция однократно меченных клеток кишечника показали, что большинство из эпителиальных клеток кишечника связаться оба апикальных и базальных поверхностей. Кроме того, трехмерная реконструкция цитоскелета на апикальной поверхности эпителия показали, что просвет кишечника непрерывна и что вторичные люмен являются артефактом сectioning. Эти две точки, наряду с демонстрацией interkinetic атомной миграции в кишечном эпителии, определяется развивающийся кишечный эпителий как многорядный эпителий, а не расслаивается, как считалось ранее ^1. Возможность наблюдать эпителия трехмерно был семенных к демонстрации этой точки и переосмысление эпителиальных морфогенез в плода кишечника. С развитием многофотонной технологии визуализации и трехмерного программного обеспечения реконструкции, способность визуализировать нетронутыми, разработки органы быстро улучшается. Двухфотонного возбуждения позволяет менее вредны проникновение вглубь тканей с высоким разрешением. Двухфотонное изображений и 3D реконструкция целых плода кишечника мыши в Уолтон и др., 2012 помог определить структуру ворсинок вырост ^2. Здесь мы опишем всю систему органной культуре, которая позволяет экс естественных развитие ворсинок и расширений этой системы культуры, чтобы позволитькишечник, чтобы быть трехмерно отображаемого в процессе их развития.

Введение

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши были обработаны гуманно, используя протоколы, утвержденные Мичиганского университета Медицинской школы Unit лабораторных животных медицины и в соответствии с руководящими принципами Комитета университета по использованию и уходу за животными.

1 целая система Органная культура

1. Подготовка информации и культуры пластин
   1. В капюшоне культуры ткани, удалить 5 мл BGJb СМИ с фондового бутылки и добавляют 5 мл пен / стреп. Подготовьте рабочую запас СМИ в 50 мл коническую трубку, путем добавления 1 мл 5 мг / мл аскорбиновой кислоты в 49 мл BGJb СМИ (с пен / стреп).
   2. Подготовка культуры пластины 6 также путем добавления 1 мл под каждой из transwells.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если все 6 transwells не используются, двигаться дополнительные transwells в свежем стерильной 6-луночного планшета для последующего использования. Добавить 3 мл рабочего BGJb СМИ, чтобы каждый из трех 10 см стерильные чашки Петри.
2. Подготовка для вскрытия
   1. Замочите рассекает инструменты в 70% этанольннол и не забудьте сохранить инструменты чистыми во время работы.
   2. Настройте рассекает центр с большим ведром льда и поместите культуры пластину 6 а и 10 см чашки Петри с BGJb СМИ на льду. Работа на льду, насколько это возможно, а рассечения и подготовки кишечника к культуре.
   3. Обезболить взрослых самок мышей в камере с изофлуораном (100 мкл) до euthanization смещением шейных позвонков для сбора плода кишечника.
   4. После сбора плоды от своей матери, поставить друг плод тщательно в соответствии с Theiler постановка диаграмму ^13. Не полагайтесь на дней после полового акта, чтобы определить возраст каждого плода как вариаций до 24 часов в стадии развития регулярно наблюдается в пределах одного помета.
3. Рассечение плода кишечника
   1. Усыпить плоды от обезглавливания перед удалением кишечника.
   2. Рассеките каждый кишечник в 1X Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS), а затем PLAв.п. его в 10 см чашку Петри с работы BGJb СМИ.
   3. Осторожно снимите селезенки из желудка и поджелудочной железы от живота и верхней двенадцатиперстной кишки.
   4. Аккуратно отделить сальник заботясь, чтобы оставить сальника, прикрепленный как можно больше и разделения соединений только достаточно, чтобы позволить кишечник, чтобы быть выпрямлены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для кишечник старше E14.5 или тех, которые культивировали дольше, чем 24 часов, мягко отделить кишечник на 3 равные части, чтобы обеспечить просвета содержание течь через кишечник и быть исключен из обрезанными концами. Тем не менее, для культур начала до E13.5, ждать, пока после 24 ч культивирования перед отделением 3 сегменты кишечника, чтобы позволить серозной расти должным образом по всей длине кишечника.
   5. Используйте рот пипеткой перенести кишечную штук на transwells культуральной пластины (1.1.2).
   6. Осторожно переместить кишечник по мере необходимости так, что они прямо через transwelл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как кишечник начинают двигаться просвета содержимое через трубку, либо перегибы в кишечнике вызовет резервного копирования и повреждения кишечника.
4. Культура и лечение
   1. Выньте материал из под Transwell, добавить 700 мкл лечения СМИ (Рабочая среда с добавлением рекомбинантных белков или фармакологических ингибиторов) под Transwell.
   2. Добавить 300 мкл лечение СМИ каплям сверху кишечнике и дайте ему впитаться через Transwell. Повторно кишечник по мере необходимости.
   3. Изменение обработки медиа по крайней мере, один раз в день или чаще, в зависимости от периода полураспада реагента лечения.
5. Подготовка белковых замачивают агарозы для локализованного источника лечения реагента
   1. Ресуспендируют агарозном бисером в их контейнере для хранения и передачи 100 мкл агарозы в 1,5 мл пробирке.
   2. Заполните оставшееся объем трубки стерильной 1x Phosphate-солевой буфер (PBS) и смешать шарики, чтобы вымыть их. Поместите пробирке в стойку в течение нескольких минут, чтобы позволить шарики оседают на дно, а затем пипеткой от PBS от сверху бисером. Заполните пробирке стерильным 1x PBS и повторить процесс стирки в два раза больше.
   3. Подготовьте интерес белок в два раза больше требуемой концентрации для лечения.
   4. Смешайте 5 мкл промытых агарозы с 5 мкл белка складе 2x и аккуратно перемешивать шарики в белке. Поместите пробирку на льду в течение 1 ч, перемешивание аккуратно каждые 10-15 минут.
   5. Промыть бусы кратко в стерильной 1x PBS до размещения бусинки на кишечнике.
6. Размещение агарозы
   1. Аккуратно поместить агарозном бисером в верхней части кишечника с помощью пипетки с рот тянут капиллярных игл. Поместите шарики с особой осторожностью, так как небрежное обращение может привести к повреждению кишечника и предотвратить развитие ворсинок в травмированной области.
   2. Поместите в два раза больше бусины, которые необходимы для анализа, так как кишечник будет пройти перистальтических движений и около половины шариков, помещенных сойдет кишечника за время культивирования.
7. Фиксация культивируемых кишечника
   1. Осторожно снимите лечения СМИ снизу Transwell и позволяют кишечник высохнуть на воздухе в течение 3 мин.
   2. Добавить 1 мл фиксатора под Transwell в течение 2 мин, затем покрыть верхнюю часть кишечника с 2 мл фиксатора на оставшуюся часть времени фиксации. Закрепить 4% параформальдегидом O / N при 4 ° С или в течение 2 ч при комнатной температуре.

2 Визуализация основных кишок

1. Wholemount изображений
   1. Поместите целые кишечник (с эндогенной флуоресценции) на слайде с 100 мкл 1х DPBS. Используйте пинцет, чтобы аккуратно организовать кишечник.
   2. Используйте лаборатории ткань осторожно снимите DPBS и сразу добавить 100 мкл 70% глицерина, чтобы сделать ткани моповторно прозрачным и увеличить возможную глубину изображения.
      Примечание: Если дальнейшее проникновение кишечника желательно, вместо монтажа в кишечник в 70% глицерине, замочить в кишечник в течение нескольких капель раствора фокусировки Ясно в течение 10-30 мин. Внесите от решения Фокус Ясно и смонтировать кишечник с горы дожди.
   3. Опустите каждый из четырех углов покровного в пластилина и забрать небольшое количество глины для использования в качестве прокладок между горкой и покровного держать покровное от уплощение кишечник.
   4. Печать покровное на слайд с растопленным VALAP прикладной ватным тампоном.
   5. Изображение кишечник по обе вертикальном или перевернутом конфокальной микроскопии. Пожалуйста, обратитесь к дискуссии для более подробной информации.
2. Vibratome секционирования основных кишечника (для поперечного сечения зрения кишечных структур)
   1. Код для вставки кишечник в 7% агарозы в небольших пластиковых форм (10 х 10 х 15 мм) и позволить агарозные блоки востыть и затвердеть.
   2. Удалить агарозные блоки из пластиковых форм и клей агарозные блоков в стадии сбора vibratome с мгновенным клеем.
   3. Заполните этап сбора ледяной 1x DPBS.
   4. Сокращение секции при толщине между 100-150 мкм. Для более толстые участки использовать клиринговые решения (описанный в разделе 2.1.2), чтобы визуализировать глубже в поперечном сечении.
   5. Налейте vibratome секции от стадии сбора в лунку 6-луночного планшета для хранения при 4 ° С.
3. Иммунофлуоресцентное окрашивание фиксированных, vibratome секционного тканей
   1. Поместите 5-12 vibratome секции на лунку в 24-луночный планшет с 1x DPBS.
   2. Удалить 1x DPBS и добавить 500 мкл пермеабилизации решения на лунку. Осторожно образцы в течение 25 мин при комнатной температуре.
   3. После проницаемости, мыть образцы 3 раза 1x PBS.
   4. Блок образцы, по крайней мере 30 минут в 500 мкл блокирующего раствора.
   5. После блокировки, еXCHANGE блокирующий раствор с 500 мкл первичных антител разводят в блокирующем растворе и поддерживать образцов при 4 ° CO / N.
      ПРИМЕЧАНИЕ: разведения первичных антител, которые хорошо работают на замороженных и парафиновых срезах как правило, работают хорошо на vibratome секций тоже, однако антитела требуя извлечение ядерного антигена как правило, не работают хорошо с этим протоколом (например, BrdU).
   6. На следующий день, мыть образцы 3 раза в течение 15 мин каждый раз с блокирующим раствором.
   7. После промывки применяют 500 мкл вторичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе. Оберните пластину 24-а в алюминиевую фольгу для защиты флуорофоры от света и рок образцы в течение 45 мин до 2 ч при комнатной температуре.
   8. Вымойте образцы 3 раза 1x PBS в течение 15 мин каждого и смонтировать vibratome разделы на слайдах, как описано в разделе 2.4.
4. Монтаж vibratome разделы
   1. Подготовить слайды для vibratome монтажа за счет сокращения тонкие ломтики дважды ИПППск ленты и размещение их вдоль длинных сторон слайдов.
   2. Осторожно поместите 5-10 vibratome разделы между двойной палки лентой на слайдах в капле 100 мкл 1x PBS.
   3. Открываются все разделы и разложил их в один слой по стеклу.
   4. Удалите излишки агарозы или неровные кусочки, которые препятствовали бы покровное от сидения плоским.
   5. Осторожно использовать лабораторную ткани, чтобы впитать лишнюю 1x PBS со всего секциях vibratome.
   6. Добавить каплю водной среде монтажа на верхней части секций vibratome а затем покровное.
   7. Печать покровные на слайдах с растаял VALAP применяется с помощью ватного тампона.
   8. Изображение в vibratome разделы по обе вертикальном или перевернутом конфокальной микроскопии. Пожалуйста, обратитесь к дискуссии для получения более подробной информации по выбору системы формирования изображения.

3 Живая съемка Whole кишок

Кишечник собирают из fetuseс после E12.5, с подключенный сальник остаются нетронутыми, успешно развиваться ворсинки в культуре с использованием вышеуказанного систему. Таким образом, этот экс виво система допускает захват живых Z-секции изображений развивающихся кишечника, которые могут быть восстановлены для трехмерного зрения морфогенеза с течением времени.

1. Настройка живого изображения
   1. Используйте мгновенный клей придерживаться индивидуального поликарбоната мембраны к экрану мелкой сеткой. Это обеспечивает поддержку эшафот провести кишечник в месте ниже погружения хрусталика вертикальном конфокальной микроскопии. Пожалуйста, обратитесь к разделу обсуждения для получения более подробной информации по выбору живых микроскопов изображений.
   2. Поместите сито в центре лунку планшета для культуры.
   3. Поместите расчлененный кишечник на поликарбонатную мембрану и добавить каплю моментального клея на обоих концах. Используйте только достаточно клея, чтобы прикрепить кишечник, но не пальто это!
   4. Добавить питательных сред бесплатно из фенола красного ниже поликарбонатаМембрана в центре скважины из культурального планшета.
   5. Добавьте воду к внешнему краю пластины культуры, чтобы обеспечить влажность.
   6. Поскольку плода кишечник подвергается перистальтический-как волны сжатия в культуре, добавить 100 мкл 1: 5 решения ксилазина в 1x PBS до 3 мл СМИ контролировать движение кишечника то время визуализации. Эта доза будет контролировать кишечных движений для около 8-10 часов без ущерба для развития ворсин.
   7. Для поперечной зрения кишечника, вставлять живые кишечник в 3-4% раствором агарозы и сократить толстые секции (150-500 мкм) на vibratome. Подходим жесткость агарозы с жесткостью кишечника сокращаются и эмпирически определили этап развития. Как правило, 3% раствор агарозы хорошо работает для кишечника в возрасте до E14.5 и 4% раствор хорошо работает для кишечника E15-E16.
   8. Клей vibratome разделы на поликарбонатную мембрану, проставленный на сито (как в разделе 3.1.1) икультура, как описано в разделе 3.1.2-3.1.6.
   9. Проведите живого изображения с использованием двухфотонного конфокальной флуоресцентной микроскопии (лазерный возбуждения между 690-1,040 нм) на вертикальном стенде с перестраиваемой таблице.
   10. Двухфотонное лазер настроен на 900 нм обеспечивает глубокое проникновение с наилучшим разрешением для GFP сигналов. Это уменьшает повреждение тканей во время визуализации. Кроме того, установив мощность лазера до минимально возможного выброса уменьшает повреждение тканей. Как правило, чтобы получить хороший возбуждение GFP, использовать 12% мощности на двухфотонного лазера.

Результаты

Культура целых эксплантатах плода кишечника позволяет анализов расположения, распределения и продолжительности сигнальных молекул, которые координируют кишечного развитие, так как эта система позволяет манипулировать сигнализации с фармакологических реагентов или рекомбинантных...

Обсуждение

Динамичный характер и сложные ткани взаимодействия развивающегося кишечника требуется 3D визуализацию, чтобы иметь полную оценку этих морфогенетических событий. С развивается технология визуализации, способность изучать ворсинок морфогенез подробно разрабатывает / улучшение и с ни?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416