Заказ отдельных клеток и Single зародышами в 3D конфайнмента: Новое устройство для высокого содержания скрининга

Резюме

Мы сообщаем устройство и новый способ для изучения клеток и эмбрионов. Отдельные клетки точно упорядочены в микрополости массивах. Их 3D заключение является шагом на пути к 3D-средах, встречающихся в физиологических условиях и позволяет ориентации органелл. Контролируя форму клетки, эта установка сводит к минимуму изменчивость сообщили в стандартных анализах.

Аннотация

Биологические клетки обычно наблюдаются на плоских (2D) поверхностей. Это условие не является физиологическим, и фенотипы и формы весьма разнообразны. Скрининг на основе клеток в таких средах, имеют поэтому серьезные ограничения: клеточные органеллы показывают крайние фенотипы, клеточные морфологию и размеры являются гетерогенными и / или специфических органелл клетки не могут быть должным образом визуализировать. Кроме того, клетки в естественных условиях находятся в 3D - среде; В этой ситуации, клетки показывают различные фенотипы в основном из-за их взаимодействия с окружающей внеклеточного матрикса ткани. Для того , чтобы стандартизировать и произвести заказ единичных клеток в физиологически соответствующей 3D - среде для клеточных анализов, мы сообщаем здесь микротехнологий и применения устройства для экстракорпорального 3D культуры клеток. Это устройство состоит из 2D - массив микрорезонаторами (обычно 10 ⁵ полостей / см ^2), каждый из которых заполнен одиночных клеток или эмбрионов. Cell позитивции, форма, полярность и внутренняя организация клеток становится затем нормализуется, показывающий 3D архитектуру. Мы использовали реплики формования с рисунком массив микрорезонаторах, 'eggcups', на тонкую полидиметилсилоксана (PDMS) слой придерживалась на покровное. Полости были покрыты фибронектином, чтобы облегчить адгезию. Клетки были вставлены с помощью центрифугирования. Начинка процент был оптимизирован для каждой системы, позволяющей до 80%. Клеток и эмбрионов жизнеспособность была подтверждена. Мы применили эту методику для визуализации клеточных органелл, таких как ядро ​​и Гольджи, а также изучить активные процессы, такие как закрытие cytokinetic кольца во время клеточного митоза. Это устройство позволило идентифицировать новые функции, такие как периодические накопления и неоднородности миозина и актина во время cytokinetic замыканию кольца и уплотненных фенотипов для Гольджи и ядра выравнивания. Мы охарактеризовали метод для клеток млекопитающих, делящихся дрожжей, многообещающий дрожжей, C. Элеганс шIth конкретных адаптации в каждом конкретном случае. Наконец, характеристики этого устройства делают его особенно интересным для скрининга лекарственных средств анализов и персонализированной медицины.

Введение

Ток в пробирке клеток на основе анализов являются двухмерными (2D). Эта конфигурация не является естественным для клеток млекопитающих и , следовательно, не является физиологически отношение ^1; клетки показывают разнообразие форм, размеров и гетерогенных фенотипов. Они представляют собой дополнительные серьезные ограничения при применении к скрининговых приложений, таких как неупорядоченного распределения в плоскости и экстремальных фенотипов клеточных органелл (стрессовых волокон, в частности). Это особенно важно в клинических исследованиях для тестирования на наркотики, где тратятся высокие бюджеты каждый год. Большинство из этих препаратов, хотя терпеть неудачу при применении к модели на животных из-за искусственного 2D условиях культивирования на ранних стадиях скрининга лекарственных средств. Кроме того, с помощью этого подхода, специфические клеточные органеллы могут не быть должным образом визуализировать, такие как cytokinetic актомиозиновом кольца во время клеточного митоза, и как правило, структуры, которые развиваются в плоскости, перпендикулярной к плоскости наблюдения. Некоторыеновые 2D анализы были предложены для того , чтобы преодолеть вышеупомянутые недостатки и важные идеи по организации цитоскелета были обнаружены ^2,3. Тем не менее, эти анализы до сих пор представляют одно серьезное ограничение: клетки показывают очень распространенное фенотип , в отличие от того , что наблюдается в естественных условиях, где клетки , присутствующие 3D - архитектуру. Эти артефакты , связанные с методом культивирования может вызвать не-физиологические особенности , такие как расширенные стрессовые волокна ^1,4,5.

Трехмерные анализы клеточных культур обеспечивают множество преимуществ по сравнению с 2D - среды ^6,7. Они являются физиологически более актуальной, и результаты поэтому имеет смысл. В качестве примера, клетки , встроенные в гидрогели показывают 3D-подобные структуры , но их морфологию отличаются от одной клетки к другой ^8,9. Тем не менее, их морфологию отличаются от одной клетки к другой, что затрудняет скрининговые приложений. Альтернативной стратегией является внедрение единогоКлетки в микроизготовленном полости ^10,11. Положение клеток, форма, полярность и внутренняя организация ячейка может затем стать нормализуется. Помимо обеспечения 3D-архитектуры , как к клеткам, микрорезонаторах также позволяет скрининговых исследований с высоким содержанием ^10,12-14; отдельные клетки можно заказать в микрочипов и клеточных органелл и их эволюции можно наблюдать параллельно. Эта закономерность дает хорошую статистику с низким числом клеток и улучшению временных / пространственным разрешением. Полезные соединения легче идентифицировать достоверно.

В данном исследовании мы покажем изготовление и применение нового 3D-как системы с одной клетки культуры для высокопроизводительных контента скрининга приложений ^10,12,13. Устройство состоит из массива эластомерных микрорезонаторах (10 ⁵ полостей / см ^2), придуманное 'eggcups' (ЕК). Размеры и общий объем ЕС в этой работе оптимизированы для типичного объема отдельных NIH3T3 и HeLa клетокво время клеточного деления. Морфология полостей - цилиндрической - выбирается так, чтобы правильно сориентировать формы клеток для визуализации активных процессов. Реплика литье используется для шаблона массив ЕС на тонкую полидиметилсилоксана (PDMS) слоя приклеена на стекло покровное ^15,16. Клетки вводятся в ЕС центрифугированием. Мы сообщаем о наблюдении и нормализации клеточных органелл (актиновых стрессовых волокон, аппарат Гольджи и ядро) в 3D (ЕС) по сравнению с теми же клетками на 2D (плоских) поверхностей. Мы также сообщаем о наблюдении активных динамических процессов , таких как закрытие cytokinetic актомиозинового кольца во время клеточного митоза ^17. Наконец, мы показываем результаты этой методологии на других системах с жесткими стенками, такими как многообещающий дрожжей, делящихся дрожжей и C. Элеганс эмбрионов что подтверждает применимость нашей методики к широкому спектру модельных систем.

Далее мы представляем подробный и исчерпывающий рrotocol для того, чтобы изготовить и применить 'eggcups' для 3D микротехнологий. Наш подход прост и не нуждается в чистой комнате. Мы ожидаем, что эта новая методика будет особенно интересен для скрининга лекарственных средств анализов и персонализированной медицины, в замене чашек Петри. И, наконец, наше устройство будет полезно для изучения распределения клеток реакций на внешние раздражители, например , при раке ¹⁸ или в области фундаментальных исследований ^19.

протокол

1. микротехнологий из '' Eggcups

1. Изготовление мастера: микрорезонаторах Массив
   1. Нагреть 3 '' кремниевой пластины, а до 200 ° C, чтобы испарить любое присутствие влаги.
   2. Спин-пальто тонкий слой SU-8 фоторезиста. Регулировка громкости скорости смолы и прядения в зависимости от желаемой толщины и фоторезиста типа. Эта толщина будет диктовать глубину «eggcups» (ЕК). Для толстого слоя 30 мкм и SU-8 2025 года, спин-пальто при 2800 оборотах в минуту.
   3. Предварительно выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин (шаг 1 из 2) для толстого SU-8 2025 слоя 30 мкм. Адаптировать время, в зависимости от типа фоторезиста и желаемой толщины. Проверьте технический паспорт производителя для деталей.
   4. Предварительно выпекать пластины при 95 ° С в течение 3 мин (шаг 2 из 2) для толстого SU-8 2025 слоя 30 мкм. Адаптировать время, в зависимости от типа фоторезиста и желаемой толщины. Проверьте технический паспорт производителя для деталей.
   5. Загрузитена полупроводниковой пластине маски Aligner для УФ-облучения. Поместите маску фотолитографии на ней. Маска показывает картину круговых признаков (дисков) 20 мкм в диаметре. Обеспечить идеальный контакт друг между другом.
      Примечание: Разные производители предлагают фотолитографии маски. Пространственное разрешение будет определять окончательную стоимость. Ацетат маски обеспечивают приемлемое разрешение (≈10 мкм) при низких затратах. Хром маски обеспечивают более высокое разрешение, но являются более дорогими. Адаптации диаметры дисков (от маски фотолитографии) к объему клетки. Размеры дисков на маске будет определять диаметр полостей в устройстве. Малые диаметры приведет к низким наполнением; слишком большого диаметра не ограничится клеток. Для HeLa и NIH3T3 клетки, диаметры от 20 мкм до 25 мкм, предложены.
   6. Проверьте питание ультрафиолетовой лампы предварительного экспозиции и оптимизировать время экспозиции соответственно. Облучают (длина волны = 365 нм) в течение 41,5 сек (или оптимизированное время экспозиции) в250 мДж / см ^2.
      Примечание: SU-8 2025 является отрицательным фоторезиста, что означает, что облученные области к УФ будут вылечены. В этом случае, круговые характеристики были черными и прозрачными остальные. Положительная фоторезиста работа в обратном порядке: не подвергавшихся воздействию регионы излечиваются. Выберите фоторезиста соответствующим образом, в зависимости от конструкции и фото-маску.
      Примечание: Защита глаз от УФ-излучения с соответствующими защитными очками.
   7. Удалить осторожно маску из фоторезиста слоя.
   8. Пост-выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин (шаг 1 из 2) для толстого SU-8 2025 слоя 30 мкм. Пост-выпекать пластины при 95 ° С в течение 3 мин (шаг 2 из 2) для толстого SU-8 2025 слоя 30 мкм. Адаптировать время, в зависимости от типа фоторезиста и желаемой толщины. Проверьте технический паспорт производителя для деталей. После того, как после выпечки, охлаждения пластины до комнатной температуры на скамейке около 1 мин.
   9. Поместите пластину в спин-нанесения покрытий и падение несколько мм СУ-8 разработчика для покрытиявся область пластины. Разработка в течение 2 мин, а затем спин-пальто при 1000 оборотах в минуту в течение 30 сек. Повторите эту процедуру трижды.
   10. Полоскание с 2-пропанола, чтобы обеспечить полное удаление неразвитой SU-8. Появление белых областей является показателем неполного развития. Если это так, повторите шаг в развивающихся дополнительное время.
   11. Миндальная карамель пластины при 200 ° С, чтобы обеспечить надежность изготавливаемых микроструктур. Этот шаг является необязательным.
   12. Храните 3 '' облатку с микроструктур внутри 94 мм х 15 мм полистирола чашку Петри.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет необходимости для обработки поверхности, в частности силанизацией, для последующих шагов.
2. Изготовление полидиметилсилоксана (PDMS) Реплика: Столпы Массив
   1. Тщательно перемешать в соотношении 1:10 (вес / вес) сшивающего агента и форполимера в общей сложности 30 г внутрь 50 мл трубки.
      Примечание: Используя соотношение 1:10 (об / об) также работает.
   2. Центрифуга трубки на 1,800 мкг в течение 5 мин доудалить пузырьки воздуха.
   3. Отбросьте мягко на PDMS поверх микроструктур.
      Примечание: Если воздушные пузырьки появляются на этом этапе, Дега образец с использованием вакуумного насоса в течение 15-20 мин.
   4. Поместите образец в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 4 часов.
      Примечание: Время отверждения варьируется между пользователями и, вместе с сшивающего: форполимер пропорции. На этот раз будет диктовать жесткость PDMS. Рекомендуется, чтобы вылечить более 2 ч и придерживаться фиксированного времени отверждения.
   5. Используйте скальпель , чтобы аккуратно вырезать область интереса (штампом) около 1 см ² , который включает в себя около 10 ⁵ микрополостей или "eggcups".
      Примечание: Вырезать сначала PDMS, а затем, очистить его от нежно. Проверьте качество реплики PDMS с помощью оптического микроскопа.
3. Изготовление '' eggcups путем реплики формования. В дальнейшем две альтернативные стратегии для изготовления «eggcups» описаны. Оба протокола являются Симилар и обеспечивают одинаковые результаты:
   1. Стратегия 1
      1. Активируйте изготовленную PDMS штамп плазменной обработкой кислородом в течение 30 сек. Хранить временно активированные штампы в закрытой чашке Петри, чтобы предотвратить осаждение пыли.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время экспозиции при использовании других газов для плазмы.
      2. Поместите активированные ПДМС штамп вверх вверх (сторона со структурами) в чашке Петри рядом с крышкой трубки 15 мл. Заполните шапку с 200 мкл триметилхлорсилана (ТМЦ). Закройте чашку Петри и пусть гербовый silanize в течение 7 мин.
         Примечание: Некоторые временная деформация на штампе и / или изменения цвета (белого цвета) можно наблюдать. Марка будет восстанавливать свою первоначальную форму в короткие сроки и структуры, не будут затронуты.
         Примечание: ТМС вызывает острое ингаляционное и чрескожной токсичности, и легко воспламеняется (с ретроспекции зажигания, способного происходить на значительные расстояния). Следовательно, оно должно быть использовано в вытяжном шкафу вдали от источникаs зажигания.
      3. Поместите штамп PDMS на спин-для нанесения покрытий со структурами вверх вверх. Поместите небольшую каплю несколько микролитров (около 20 мкл) жидкого PDMS (1:10 вес / вес сшивающего агента: форполимер) на верхней части конструкции. Спин-пальто при 1500 оборотах в минуту в течение 30 секунд для нанесения тонким слоем PDMS поверх структур.
         Примечание: Если штамп не соответствует спин-Coater Chuck поместить штамп на вершине блюдо крышкой Петри с небольшим отверстием в центре.
      4. Поместите штамп в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 4 часов, чтобы вылечить осажденного спин-покрытием PDMS слой.
      5. Включите тонкий слой PDMS путем размещения PDMS штампа с ног вверх, вместе с покровным стеклом # 0 25 мм в диаметре, с использованием кислородной плазмы уборщика в течение 30 сек. быстро переходите к следующему шагу.
         Примечание: покровные с другими толщинами, формы и размеры могут быть использованы также. Тем не менее, некоторые клеточные структуры могут быть трудно визуализировать в зависимости от выбранной толщины покровного и цельувеличение и / или NA и / или рабочее расстояние. Проверьте объективный лист данных.
      6. Место в контакте штампа (сторона с тонким слоем спин-покрытием) с покровным стеклом. Пресс мягко по всей поверхности штампа с помощью пинцета, чтобы сделать «склеивание». И, наконец, поддержания постоянного давления на верхней части штампа около 10 сек.
      7. Через 30 минут аккуратно "кожуре" штамп из покровного для того , чтобы «освободить» «eggcups» (рисунок 1). Тщательно промыть этанолом и сушат. Если PDMS 'eggcups' не очень хорошо придерживалась на покровного стекла (т.е. они отделяют во время '' unpeeling шага), рассмотреть вопрос о корректировке параметров очистителя плазмы и перезапустить на этапе 1.3.1.5.
         Примечание: Этот шаг является деликатным. Обратите внимание, чтобы избежать поломки покровного стекла и / или отрыва тонкого слоя PDMS.
      8. Клей небольшой кусочек (ручка) излеченных PDMS 1 мм х 1мм х 3 мм в объеме на краю покровного стекла с небольшим каплю жидкости PDMS и вылечить PDMS, как и раньше. Это будет способствовать манипуляции образца после этого (см рисунок 1). Этот шаг является необязательным.
   2. Стратегия 2
      1. Гидрофилизации сфабрикованные PDMS штампы плазменной обработкой кислородом в течение 30 сек. Магазин временно активированные марки в закрытой чашке Петри, чтобы предотвратить осаждение пыли.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время экспозиции при использовании других газов для плазмы.
      2. Гидрофилизации 25 мм стекла диаметром покровные # 0 кислорода плазменной обработки при 15 Вт в течение 30 сек. быстро переходите к следующему шагу.
         Примечание: покровные с другими толщинами, формы и размеры могут быть использованы также. Тем не менее, клеточные структуры будет трудно визуализировать в зависимости от выбранной толщины покровного и объективных характеристик (см примечание выше).
      3. Спин-пальто небольшой капли PDMS (1:10 вес / вес поперечной сшивки: предварительно PolYmer) из нескольких микролитров на покровные стекла. Спин-пальто при 1500 оборотах в минуту в течение 30 секунд для окончательной толщины около 50 мкм.
      4. Клей небольшой кусок (ручка) излеченных PDMS от 1 мм х 1 мм х 3 мм в объеме на краю покровного стекла с небольшим каплю жидкости PDMS и вылечить PDMS, как и раньше. Это будет способствовать манипуляции образца после этого (см рисунок 1). Этот шаг является необязательным.
      5. Магазин временно покровные PDMS-покрытием на чистую протереть внутри чашки Петри для защиты от осаждения пыли.
      6. Поместите каплю реагента silanizing на вершине каждой марки и дайте ему испариться в течение 1-2 мин. Затем высушить их в потоке N _2.
         Примечание: На этом этапе может наблюдаться временная деформация штампа в процессе испарения. Марка будет восстанавливать свою первоначальную форму после сушки с N ₂ без остаточной деформации микроструктур.
      7. Отбросьте очень мягко Силанизированные печать поверхPDMS-спин покрытием покровного стекла, хранящуюся в чашке Петри. Убедитесь в том, что обе стороны полностью параллельно во время контакта. Избегайте нажатия или перемещения штампа после размещения его на покровное PDMS покрытием.
      8. Поместите чашку Петри с образцами в вакууме в течение 1-2 ч, чтобы удалить пузырьки воздуха.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что образцы полностью горизонтально, чтобы избежать смещения штампа. Избегайте также колебания, которые могут вызваны вакуумным насосом.
      9. Поместите образцы в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 4 часов.
      10. Осторожно, снимите отметку, чтобы выявить "eggcups". Тщательно промыть этанолом и сушат.
          Примечание: Практика в этот момент необходим. Обратите внимание избежать поломки покровное и / или отрыва тонкого слоя PDMS.

2. Введение в клетки в "Eggcups"

Для того чтобы ввести клетки млекопитающих внутри 'eggcups', PDMS поверхности перед дл функционализации с адгезионными белками внеклеточного матрикса. В этом примере используется фибронектин, но другие белки, представляющие интерес, такие как коллаген, можно было бы использовать.

1. Гидрофилизации 'eggcups' в кислородной плазме очистителя в течение 30 сек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация параметров, если это необходимо.
2. Приготовьте раствор в PBS 1x 20 мкг мл ^-1 фибронектин из источников говяжьи.
3. Стерилизовать "eggcups" с УФ в течение 5 мин. Перевод небольшой капли (около 20-50 мкл) раствора фибронектина, чтобы покрыть всю область 'eggcups' и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Защита образца от высыхания.
4. Полоскание мягко на '' eggcups с PBS 1x. Повторите 3 раза.
   Примечание: Образец готов немедленно или хранить использовать при температуре 4 ° С в темноте в течение нескольких недель.
5. Введем цилиндрическую заказные пластиковый лист 63 мм в высоту, 26 мм и внешним радиусом 7 мм внутренних размеров радиуса в 50 мл трубки (смРисунок 2) ²⁰
   ВНИМАНИЕ: Использование УФ-стерилизованные предметы или стерилизовать их перед использованием.
   Примечание: Эта часть может быть легко изготовлен в лабораторных условиях. или с помощью любого доступного машинного цеха.
6. Поместите 13 мл клеточной культуральной среды внутри трубки (таблица 1). Среда должна заполнить по крайней мере, на 2 см выше цилиндрической части, чтобы обеспечить полное погружение образца.
   Примечание: Для получения дополнительной информации о конкретных типах клеток и других модельных систем , таких как дрожжи или C. Элеганс эмбрионов, а соответствующая среда , используемая, смотрите раздел 5 и в таблице 1. Описанный протокол был оптимизирован для HeLa, клетки NIH3T3, и других линий клеток (таблица 1).
7. Введение очень осторожно анализировать "eggcups" внутри трубы и параллельно верхней стороне пластиковой части. Используйте острые щипчики для того чтобы держать образец, используя ручку PDMS. Нажмите мягко покровное, пока она лежит на верхней части верхней стороны пластмассовую деталь, ипсезам , он полностью погружен (рисунок 2).
   Примечание: Рекомендуется использовать острые и прямые пинцетом. С помощью пинцета изогнутыми, манипуляция образца затруднено и может привести к поломке.
8. Культуры клеток до 80-100% слияния в P60 Петри и собрать их трипсином.
   Примечание: клетки могут быть дикого типа, трансфицированные или обрабатывают любым препаратом, представляющей интерес.
   Примечание: Во избежание образования клеточных агрегатов, которые позволят избежать отдельных клеток, чтобы войти в "eggcups". Для оптимизации этого шага, пипетки вверх и вниз после того, как тщательно трипсином.
9. Повторное приостановить клеток в культуральной среде, 5 мл. Пипетировать 200 мкл клеток в верхней части "eggcups".
   Примечание: Отбросьте клетки, как по центру, как это возможно на вершине 'eggcups', но избежать физического контакта. Это позволит предотвратить поломки и / или повреждения образца.
10. Центрифуга при 1800 мкг в течение 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После первого центрифугирования, проверьте в микрофонroscope заправочной процент "eggcups".
11. Пипетка снова 200 мкл клеток в верхней части 'eggcups' и центрифуге при 1800 х г в течение 2 мин. Повторить в общей сложности три раза, чтобы оптимизировать процент заполнения.
    Примечание: После последнего центрифугирования, проверить с помощью микроскопа заправочной процент "eggcups". При необходимости, повторите наполняющего + центрифугирования шаги до достижения желаемого процентного заполнения.
12. Удалить образец из пробирки, используя острые щипчики, удерживающие ручку PDMS. Убедитесь в том , чтобы быть осторожным в не «возмущающих» клеток , которые проводятся в «eggcups» (рисунок 2).
13. Поместите образец в чашку Петри со средой. Ополосните, чтобы удалить избыток клеток, которые не являются в "eggcups 'пипетированием вверх и вниз три раза аккуратно рядом с каждой стороны (всего 4 стороны) массива микроструктурой.
    Примечание: Раскапывание слишком сильно может освободитьнекоторые клетки из 'eggcups'.
14. Замените среду свежей средой для удаления nonattached клеток.
    Примечание: На этом этапе можно добавить препарат интерес.
15. Fix клетки или подготовить их к покадровой стадии imaging.See 4.1.

3. Наблюдение активной клеточной динамики в «Eggcups»: Cytokinetic кольцо Закрытие

Примечание: В этом примере используются клетки HeLa, которые трансфицированы MYH10-GFP и Lifeact-mcherry для миозина и актина, соответственно, ключевые активные молекулы, участвующие в cytokinetic замыканию кольца во время клеточного митоза. Устройство готовят с микрополостях 25 мкм в диаметре. Для их наблюдения, был использован эпифлуоресцентной инвертированный микроскоп, оснащенный объективом масла 60X (1.40 NA, ДИК, Plan Apo) и GFP (миозин) и TxRed (актиновых) фильтры. В качестве альтернативы был использован в вертикальном положении конфокальный микроскоп, оснащенный 25X или цели L воды 63X НСХ ИК APO (0,95 NA). Для этого EXAmple, настоятельно рекомендуется синхронизировать клетки с помощью двойной блок тимидина, митотический блок или митотическую вытряхиваемого метод ^21-24.
Примечание: Толщина PDMS, используемых для «eggcups» позволяет использовать разнообразие целей как в перевернутой и вертикально расположенных микроскопов.

1. Место '' eggcups в держатель микроскопа и залейте его 1 мл 10% FCS L-15 наблюдений среды. Для того, чтобы избежать испарения, поместите стеклянную крышку на верхней части держателя или нанести тонкий слой минерального масла поверх medium.Select объектива 60X нефти.
   Примечание: L-15 среда является достаточным для не-СО ₂ атмосферы. Отметим также, что некоторые соединения DMEM являются авто- флуоресцентный. При использовании этой среды, рекомендуется photobleach флуоресцентные соединения, при освещении его с высокой лампой интенсивности в течение 1-2 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования пластиковых крышек при работе с изображениями DIC.
2. Поместите держатель с 'eggcups' и obserвации среда в микроскоп. Фокус осторожно с использованием светлого света до тех 'eggcups', и клетки находятся в одной плоскости наблюдения.
3. Откройте программное обеспечение и настроить параметры. Выберите фильтры TxRed и GFP для актина и миозина; отрегулировать время экспозиции для каждого канала. Типичная скорость приема составляет 5 сек для обоих каналов.
   Примечание: Время экспозиции, возможно, придется быть скорректирована в зависимости от настроек используемого красителя или других клеточных органелл, представляющих интерес.
4. Выберите интересующую область и искать для cytokinetic кольца, используя либо GFP или канал TxRed. Фокус точно.
   Примечание: Кольцо острее в миозина и легче распознать.
5. Запуск автоматического приобретения в обоих каналах, пока кольцо не будет полностью закрыта.
   Примечание: могут наблюдаться некоторые фотообесцвечивание. Отрегулируйте параметры микроскопа, чтобы уменьшить его.

4. Наблюдение стационарных клеточных органелл в "Eggcups"

Этот шаг может быть выполнена до или после того, как шаг # 3. Клетки могут быть непосредственно фиксированной после стадии центрифугирования и окрашивают для органеллы интереса или после наблюдения в микроскоп. Этот пример показывает окрашивание Гольджи, ядра и актиновых волокон на NIH3T3 фибробластов в "eggcups".

1. Фиксацию клеток в "Eggcups"
   1. Подготовьте 3% параформальдегида (PFA) и теплым при температуре 37 ° C. Удалить образец '' eggcups из 50 мл трубки (или держатель микроскопа) и поместите его внутри P35 Петри. Полоскание один раз с PBS 1X.
      Примечание: Протоколы для подготовки 3% параформальдегидом широко доступны в другом месте.
      ВНИМАНИЕ: во время подготовки PFA Используйте нитриловые перчатки и защитные очки.
   2. Удалить полностью в PBS и падение 1 мл 3% PFA и инкубировать в течение 17 мин. Удалите PFA и дважды промыть 1 мл PBS 1X. Клетки проницаемыми с использованием 1 мл 0,5% Тритв течение 3 мин и мыть два раза с PBS 1X в течение 5 мин.
2. Окрашивание клеток в "Eggcups"
   1. Инкубируйте клетки для Гольджи окрашивания с первичным антителом кроличьей поликлональной анти-Giantin в разведении 1: 500 в PBS. Поместите каплю 100 мкл раствора антитела на пластиковый пленочный лист и инкубировать ячейки внутри "eggcups" вверх дном в течение 45 мин.
      Примечание: Защита образца с крышкой для предотвращения высыхания.
   2. Осторожно освободите "Eggcups" и поместить их в P35 Петри. Промыть 3 раза, 5 мин каждый, с PBS 1x.
   3. Готовят коктейль в PBS с вторичным антителом Су3 козы к антителам кролика (1: 1000), а также с фаллоидином Alexa Fluor 488 (1: 200) для окрашивания актиновых стрессовых волокон.
   4. Инкубируйте клетки с каплей 100 мкл раствора антитела на пластиковый пленочный лист и инкубировать клетки внутри "eggcups" вверх дном в течение 45 мин.
   5. Выпуск тщательно 'eggcвзлетов "и поместить их в P35 Петри. Промыть 3 раза, 5 мин каждый, с PBS 1x.
   6. Инкубируйте клетки для ядра окрашиванием размещения капли 100 мкл 1 мкг мл ^-1 DAPI в PBS на пластиковый пленочный лист и инкубировать клетки внутри "eggcups" вверх дном в течение 45 мин. Этот шаг может быть выполнен с шагом 4.2.3.
   7. Осторожно освободите "eggcups" и поместить их в P35 Петри. Промыть 3 раза, 5 мин каждый, с PBS 1x.
   8. Клетки Mount, используя 15 мкл глицерина PBS (1: 1 об / об) на стандартном микроскопа стекло и уплотнение образца с лаком для ногтей, чтобы избежать высыхания.
      Примечание: В зависимости от толщины 'eggcups', монтаж может быть затруднено. Рекомендуется хранить затем образец в P35 Петри в PBS, защищенном от высыхания.
3. Микроскоп Наблюдение
   Примечание: В данном примере используется в вертикальном положении конфокальный микроскоп, оснащенный PMT и гибридных детекторов. 25X или 63 Цель л воды X НСХ ИК APO (0,95 NA) был выбран, чтобы обеспечить широкое поле образца и показать применимость устройства для высокого содержания скрининга приложений.
   1. Выбор цели в 25X или 63X воды.
      Примечание: Различные цели могут быть использованы в зависимости от применения и сигнала. Но рекомендуется использование высоких целей числовой апертуры.
   2. Поместите установленного образца с «eggcups» и сосредоточиться осторожно, используя свет светлого (фазового контраста или DIC) до '' eggcups и клетки находятся в плоскости наблюдения.
   3. Откройте программное обеспечение и настроить параметры. Выберите фильтры GFP, Cy3 и DAPI для актина, Гольджи и ядро ​​наблюдения, соответственно; отрегулировать время экспозиции для всех каналов.
      Примечание: Время экспозиции, возможно, придется быть скорректированы в зависимости от настройки.
   4. Выберите и сфокусировать интересующую область; начать захват изображения (смотри рисунок 3).

TLE "> 5. Адаптация для наблюдения дрожжевых клеток и C. Элеганс эмбрионов

1. Деление и почкованием клетки дрожжей
   Примечание: В этом примере используются дрожжевые клетки деления, которые помечены RLC1-mcherry и КБС-GFP для миозина и актина, соответственно. Бутонизации дрожжевые клетки не флуоресцентную метку здесь. Для наблюдения делящихся дрожжей использовали перевернутый вращающийся диск конфокальной микроскопии. Объектив масла 100X HCX PL APO CS (1.4 NA) использовался для всех приобретений. В качестве альтернативы, клетки также наблюдали с использованием инвертированного фазового контрастного микроскопа оснащенную объективом 20X фазовым контрастом воздуха LCPlanFl (0,4 NA). В этом примере, протокол идентичен для обоих типов клеток.
   1. Подготовьте поверхность 'eggcups', как описано выше. Для деления и многообещающий дрожжевых клеток, подготовить полости 5 мкм в диаметре (см таблицу 1). В этом случае поверхность не должна быть функционализированные с адгезионными белками.
      Примечание: Наполнение чап быть оптимизированы с помощью конических 'eggcups'. Эта форма захватывает и удерживает клетки, избегая высвобождения во время полоскания стадии после центрифугирования. Заполнение процент оптимумом около 80%. Эти конические 'eggcups' могут быть изготовлены с помощью глубокой реактивное ионное травление ^13.
   2. Культура клеток дрожжей в надлежащей культуральной среде (см таблицу 1) до достижения оптической плотности (OD) в диапазоне от 0,2 до 0,8. Разрушать ультразвуком культуры клеток дрожжей для удаления агрегатов.
   3. Вставьте дрожжевые клетки в «eggcups» путем центрифугирования. Для центрифугирования, 4 мл культивируемых клеток в соответствующей OD добавляется на трубку с 'eggcups'. После первого центрифугирования, осторожно встряхните пробирку, чтобы повторно приостанавливать клетки, которые не находятся в «eggcups», в то время как клетки в «eggcups» не нарушается. Не открывая трубки, центрифуга снова и повторить этот шаг дважды. Это обеспечивает осаждениеклеток из культуры в пустые микрополости и увеличит процент заполнения.
      Примечание: При работе с дрожжами, рекомендуется предварительно нагревать центрифуга до рабочей температуры во время экспериментов
      Примечание: Протокол может быть приостановлена ​​здесь и продолжалось до 12 часов позже. В этом случае, хранить образцы при рабочей температуре и покрыть ее, чтобы предотвратить испарение.
   4. Place 'eggcups' в держателе микроскопа и заполнить держатель с фильтром стерилизовать среды для работы с изображениями. Теперь промойте клетки с той же среде, пока клетки дрожжей, плавающие не будут удалены эффективно. Позаботьтесь, чтобы не нарушить клетки в "eggcups" во время процесса промывки.
   5. Выберите цель 100X масла и тщательно сосредоточиться. Откройте программное обеспечение и настроить параметры. Для получения делящихся дрожжей, выберите фильтры GFP и TxRed для актина и миозина и регулировать время экспозиции для обоих каналов. Типичная скорость приема составляет 3 сек.
      Примечание: В зависимости отфлуорофор, тип мечения и настройки, время экспозиции изменяется для других систем.
2. C. Элеганс Эмбрион
   Примечание: В этом примере используется C. Элеганс эмбрионов шириной 25-30 мкм и длиной 50-55 мкм. Эмбрионы культивируют , как указано в ^25. Простой визуальный протокол , как манипулировать C. Элеганс можно найти в ^26. Наблюдение проводилось с использованием инвертированного фазово-контрастный микроскоп, оборудованный объективом воздуха 40X 0,55 NA.
   1. Подготовьте поверхность 'eggcups' , как описано выше , и 25 мкм в диаметре (см таблицу 1). В этом случае поверхность не должна быть функционализированные с адгезионными белками.
   2. Культура C. Элеганс эмбрионов в надлежащей культуральной среде (таблица 1).
   3. Вставьте эмбрионов в "eggcups" путем центрифугирования, как описано выше (смотри раздел 2.6 2.12) с использованием сверхчистой воды в качестве культуральной среды.
      Примечание: Эмбрионы "себя", как правило, в сверхчистой воде в течение всего срока эксперимента. В качестве альтернативы используют физиологический буфер М9 для долгосрочных экспериментов.
   4. Промыть образец, как описано выше (смотри раздел 2.14). Поместите 'eggcups' в держатель микроскопа. Выберите цель 40X воздуха и тщательно сосредоточиться. Откройте программное обеспечение и настроить параметры. Выберите скорость приема 3 сек.

Результаты

В '' eggcups (ЭК) являются новая методология высокое содержание-скрининг, который позволяет визуализировать ориентированных клеток и эмбрионов в среде 3D. Кроме того, некоторые клеточные процессы, которые трудно наблюдать в стандартных 2D (плоских) культур, можно наблюдать с помощью этог...

Обсуждение

Реплика формования используется для того, чтобы изготовить "eggcups. Процесс изготовления не нуждается в чистой комнате; это легко и просто, хотя некоторые из них практика может потребоваться. В частности, выпустив PDMS штампа является наиболее важным шагом для получения большой площади ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ddH20 (ultrapure)	Millipore	-	Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)	Bemis	PM-999	Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask	Selba	-	http://www.selba.ch
Silicon wafer	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist	MicroChem	2000 series	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Chlorotrimethylsilane (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0	Knittel glass	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin	Abcam	ab24586	1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
rabbit anti-anillin	Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).		1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine	Transduction Lab	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR
1 mg/ml for 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells	-	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells	ATCC	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast	-	-	For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms	-	-	For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging	MP Biomedicals	4110-012	For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2