Метод микроинъекции<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Зиготы

Резюме

Методы, которые производят morphant эмбрионов необходимы для изучения механизмов развития и генных регуляторных сетей. Морская звезда Patiria miniata является новым модельной системой для этих исследований. Здесь мы приводим протокол для получения гаметы, производство культур эмбрионов, и быстрое микроинъекции зигот от этого вида.

Аннотация

Иглокожие уже давно любимая модель системы для исследований воспроизводства и развития, а в последнее время для изучения регуляции генов и эволюции процессов развития. Морская звезда, Patiria miniata, набирает распространенность в качестве модельной системы для этих типов исследований, которые ранее выполнялись почти исключительно в морских ежей, Strongylocentrotus purpuratus и Lytechinus variegatus. Преимущество этих модельных систем является простота получения модифицированных эмбрионов, в которых определенный ген вверх или подавляется, назвав группу клеток, или введения гена-репортера. Один метод микроинъекции способен создавать большое разнообразие таких модифицированных эмбрионов. Здесь мы представляем метод для получения гаметы из P. miniata, производя зиготы, и введения возмущающие реагентов через микроинъекции. Здоровые morphant эмбрионы затем выделяют для количественных и качественных исследований общеФункция пе. Получение геномных и транскриптом данных для этого организма возросла типы исследований, которые выполняются и легкости их выполнения.

Введение

Морская звезда, Patiria miniata, (широко известный как летучая мышь звезды) становится как интересный и универсальный модельной системы для различных сотовой ^{1- 3,} развития ^4,5, эволюционной ^{6 8} и экологических исследований ^{9- 11.} Взрослый П. miniata распределены вдоль тихоокеанского побережья от Ситка, штат Аляска в Baja, Калифорния ¹² и легко поддерживается в морских аквариумах. Яйцеклетки могут быть получены круглый год и каждая самка может пролить десятки тысяч яиц. Яйцеклетки легко созрел и оплодотворенная внешне ^13. Полученные эмбрионы являются прозрачными позволяет легко наблюдения; они развиваются синхронно, и требуют только морскую воду для развития. Всего в сборе генома и несколько transcriptomes также доступны для P. miniata ( Echinobase.org ). Такие преимущества делают их идеальными для диапазона исследованийи учебных целей.

В последние годы П. miniata стала модель системы для генной развития регулирующей сети анализирует ^14-16. Цель таких исследований является выявление весь комплимент регуляторных генов и определения сети их взаимодействий. Большая часть этой работы влечет за собой возмущающее экспрессию генов путем внедрения антисмысловых олигонуклеотидов или в пробирке синтезированы мРНК. Кроме того, цис нормативные анализы используются для характеристики функции регулирующего ДНК ^15. Эти анализы требуют введение возмущения реагентов и / или репортер конструкции ДНК в эмбрионы. Кроме того, для характеристики вниз по течению этих возмущений, необходимо анализе много эмбрионов изменения в экспрессии генов потенциальных мишеней. Методы микроинъекции многих сотен зиготы являются центральными для этой работы.

Иглокожие, в том числе P. miniata , требуют много месяцев, чтобы достичь половой зрелости. В связи с этим, как правило, не практично, чтобы создать и поддерживать трансгенных линий этих животных для экспериментов. Поэтому разведение трансгенных взрослых может не эффективно создавать модифицированные эмбрионы. Вместо этого, возмущение должно произойти заново через микроинъекции. Микроинъекция предлагает возможность изменять эмбрионов с реагентами, которые не проникающий в клетку. Следующий протокол описывает способ для введения ДНК, мРНК, сотовые индикаторов и морфолино антисмысловых олигонуклеотидов в сотни оплодотворенных яиц в одной 2-3 ч сидит через микроинъекции. Это дает достаточно материала для различных последующих экспериментах в том числе, но не ограничиваясь этим, количественной ПЦР, гибридизация, РНК-Seq, и вестерн-блоттинга.

протокол

Храните все с морской водой или искусственный морской воды (SW), взрослых животных, и культуры при 15 ° С, насколько это практично. Обеспечить яйца и зиготы которые погружают в SW.

Коммерчески подготовленные морские соли восстановленные дистиллированной или обратного осмоса вода служит также источником SW. Проверьте соленость, используя ареометр и настроить соли или воды для достижения оптимальных уровней. Держите определенные уровни гравитации между 1,020 до 1,025. Храните все изделия из стекла и Пластик отдельно от всех других лабораторного оборудования, чтобы избежать любого загрязнения химическими веществами. Чистый эмбриона класса лабораторное промывкой деионизированной водой или случайного замачивания в разбавленной гипохлорита натрия с последующей промывкой несколько раз в воде.

1 Получение и созревания Половые клетки от Patiria miniata взрослых

1. Выберите животное акцизным половые железы. Определите секс после удаления, глядя на наличие яичников или яичек, потому что P. miniata не себеxually диморфизм.
2. Вырезать небольшое отверстие, размером не более 1 см, вдоль стороне морской звезды руку с лезвием скальпеля (Рисунок 1А). Использование малых затупляли щипцы отступить края разреза для доступа к гонад ткани и потяните гонад ткани через разрез.
   Примечание: Избегайте вытягивания ткани кишечника, которая является свободным серый или коричневый ткани (Фигура 1В). Яичники, как правило, оранжевый, желтый, или светло-коричневый (Рисунок 1C), в то время как яички белые или бежевые и когда нарушается вызовет морскую воду, чтобы стать молочно или облачно с виду (Рисунок 1D).
3. Вернуться самок к аквариумах. Изолировать самцов в течение часа или два в емкость с SW с напряжением от обработки может вызвать нерест. Животные исцелить вдоль разреза и впредь оказывать гаметы в течение нескольких месяцев.
4. Собирают семенники в 1,5 мл пробирку Эппендорфа с минимальным SW, насколько это возможно, и не хранить на льду до использования. Храните все яички не будемред в день сбора при 4 ° С на срок до недели.
5. Соберите яичники в маленьком стакане блюдо культуры через несколько миллилитров SW. Чтобы освободить ооциты из яичников ткани, дразнить друг от друга ткани с двумя парами щипцов до никаких больших листа не остались.
   Примечание: Оптимально, большинство ооцитов полностью развит. Такие ооциты большие, круглые, и прозрачный желтый или светло-коричневый с отчетливым зародышевого пузырька в ооцитов (фиг.2А), по сравнению с подмножеством неразвитые ооцитов, которые меньше, коричневый, зернистым, и непрозрачные (фиг.2В). Если больше, чем около 25% ооцитов имеют неразвитого разнообразия, выберите другую самку, чтобы получить ооциты.
6. Налейте ооциты и оставшиеся ткани через чашку фильтра сетка с размером пор 200 мкм и собирать течь через. Это будет содержать все разновидности ооцитов, но удалить ткани яичника. Выбить оставшиеся ооцитов из ткани улавливаются фильтром путем распыления жIth SW из бутылки шприц. Фильтр чашки выполнены с использованием 50 мл коническую трубку (3А-A ').
7. Налейте поток через 1,6 с шага через сетчатый фильтр чашки 100 мкм. Откажитесь небольшие ооцитов в проточной. Большие полностью разработанные ооциты, которые готовы к созревания останется на фильтре. Промыть ооциты в чистую 200 мл химический стакан.
8. Добавить 95 мл SW в стеклянный стакан 200 мл ооцитов. Добавляют 5 мл 200 мкМ 1-метиладенина для конечной концентрации 10 мкМ.
9. Перенесите ооциты в большой мелкой тарелки культуры и месте при температуре 15 ° C. Высокой площади поверхности к объему чашки для культивирования позволяет кислородного обмена. Яйцеклетки не созревают или не может хорошо развиваться, если они переполнены в течение этого созревания фазы. Разделить на несколько блюд SW плюс 10 мкМ 1-methlyadenine пока культура не меньше 200 ооциты / мл.
10. Разрешить ооциты, чтобы созреть для 45-90 мин, но не более, так как это будет оказывать ооциты не в состоянии быть еertilized. Чтобы определить, созревание завершено, посмотрите на ооцитов под рассекает сферу. Зародышевого пузырька движется к и сливается с клеточной мембраной во время созревания. Затем он ломается, и поэтому больше не видны в зрелых ооцитов (Рисунок 2C).

2 Оплодотворение зрелых ооцитов

1. Выбрал небольшую группу ткани яичка, примерно с горошину, и фарш в небольшом стекло блюдо культуры с примерно 1 мл SW.
2. С помощью пипетки Пастера перенести 2-3 капли полученного молочного морской воды примерно до 100 мл зрелых ооцитов и вихревой культуры блюдо перемешать. Избегайте передачи части ткани яичка. Избегайте добавления большего количества спермы, так как это может привести к полиспермии и последующего плохого развития.
3. Через несколько минут наблюдать ооциты с помощью препаровальной лупы. Оплодотворенные яйца, или зиготы, есть оплодотворения конверт, который является прозрачным плафоном, который поднимается от КВЖДл мембрана (Рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не приступайте к культуре, если меньше около 90% яиц оплодотворить поскольку бедные частота оплодотворения являются показателем нездоровой культуры, которые также могут не развиваться хорошо.
4. После оплодотворения завершена, изменить SW на зиготы путем заливки через сетчатый фильтр 100 мкм и промывки в культуральной чашке со свежим SW. Важно, чтобы удалить лишнюю сперму, чтобы предотвратить кислородное голодание. Место культуры блюдо в 15 ° С в течение 15-30 мин.

3 Де-jellying и гребли оплодотворенных яйцеклеток

1. Подготовка инъекций блюда, принимая крышку от 60 х 15 мм чашки Петри из полистирола.
   1. Нарисуйте постоянную линию маркером пера на задней панели блюдо, вокруг области, которая соответствует поле зрения на микроинъекции микроскопом. Это гарантирует, что все эмбрионы гребли в поле зрения микроскопа.
   2. Используйте стекло пипетки Пастера забить линию через круг, рreferably в стороне от круга (фиг.3В). Используйте эту линию позже сломать инъекционных игл (шаг 4,5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты обычно используется придерживаться эмбрионов ежа на море, например, протамин сульфат или поли-L лизин, являются необходимыми. Де-холодец П. miniata зиготы придерживаться очень хорошо, чтобы без покрытия пластика. Обратите внимание, что они не прилипают и к стеклянной посуды.
2. Добавить приблизительно 10 мл SW в каждую чашку таким образом, что поверхность покрыта, но вода не будет чрезмерно всплеск в чашке, так как это может возмущать гребли эмбрионов.
3. Снимите P. miniata зигота желе пальто с кислотой SW до гребле. Это желе пальто является более обширным, чем это наблюдается для модели морских видов ежей.
   1. Подготовьте кислоты SW в диапазоне рН 4,0-4,2. РН имеет решающее значение для обеспечения эффективного удаления студенистой оболочки, разрешая нормальное развитие.
   2. Однодневное капель 1 N (1 М) HCl в юго-запада на 1 л запаса SW. Разрешить каждая капля смешивать полностьюи контролировать рН перед добавлением больше HCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один в нескольких мл результатов HCl в соответствующем рН, но не добавляйте весь объем сразу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка 1 N HCl в вытяжной шкаф с ПО и 12 N (12 М) HCl.
   3. Удалить SW на зигот при заливке их на сетчатый фильтр 100 мкм. Промыть в мл химический стакан в наименьшее количество возможных SW (примерно 10 мл) 200. Заполните мензурку до 150 мл с кислой SW (рН 4,0) и позволяют зиготы сидеть в кислой SW в течение 3 мин.
4. Полоса желе слой от зиготы путем заливки их назад и вперед между двумя 200 мл стаканы, каждый раз, проходя зиготы через сетчатый фильтр 200 мкм. Вылейте зиготы через фильтр вокруг 5-10 раз над о временном окне 2 мин.
5. Удалить кислоты SW путем заливки зигот на сетчатый фильтр 100 мкм. Промыть зиготы в небольшой стеклянной блюдо культуры с SW. Де-заливные зиготы может прилипнуть к пластиковой посуды. Эмбрионы строка, расположенная непосредственно; они начинают производить больше JЭлли пальто, которое приводит к плохой адгезии к пластиковой посуды в течение долгого времени.
6. Используйте рот пипеткой (3С-С '), чтобы забрать зиготы из культуральной блюдо стекла и поместить их в прямых на инжекторных блюд. Расплава в центр тонкой стороне пипетки Пастера над пламенем, пока стекло не является мягким. Быстро потяните за концы стекло на части, чтобы произвести очень тонкую участок стекла. Как только стекло прохладно, разорвать маленький конец пипетки Пастера (для получения дополнительной информации по подготовке рот пипеткой см Вессель и др. 2004 ¹⁷ или Сладкий и др. 2004 ^18).
   1. Сделать гребной пипетки так, что диаметр просто больше, чем диаметр эмбрионов, так что только один зиготы будет входить и выходить из пипетки в то время. Это позволит однорядные с образованием. Пипетки меньшего диаметра могут лишить оплодотворения конверт и сорвать зиготы как P. miniata зиготы не имеют гиалиновых мембран Aй довольно мягкая.
   2. Если зиготы не прилипают к пластиковой блюдо, сохранить их для дополнительного времени в кислой SW (до более нескольких минут). В качестве альтернативы меньше диаметра пипетки может помочь в удалении желе слой, чтобы позволить зиготы, чтобы более эффективно придерживаться.
   3. В зиготы слегка положительную плавучесть, и, как правило, плавать или зависать чуть выше дна тарелки. В этом случае, установите гребной пипетку так, чтобы зиготы мягко прижимается к поверхности чашки, как они выходят из пипетки (Рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ:. Допускается, чтобы соответствовать много строк на этих блюд П. miniata эмбриональные мембраны не станет более трудно проникнуть в течение долгого времени и, следовательно, можно вводить сотни зигот на одной тарелке.

4 Инъекция зиготы

1. Подготовьте инъекционные растворы с соответствующими концентрациями морфолино антисмысловых олигонуклеотидов (мазо), мРНК, или ДНК в конечном концentration 200 мМ KCl. 400-800 мкМ MASO и 2,5 нг / мкл ДНК имеют тенденцию производить morphant фенотипы при минимизации токсичности. Конечная концентрация в яйце будет ^1/125-й начальной концентрации ^14. Для инъекционных растворов, содержащих Masos, тепла до 65 ° С в течение 5 мин, непосредственно перед использованием, а затем хранить при комнатной температуре.
   1. Для простоты сортировки инъекционные эмбрионов, добавить родамин декстран Tracer в инъекционного раствора, чтобы получить концентрацию 0,1%.
2. Подготовка инъекционных игл, потянув стеклянной капиллярной трубки (1,0 мм OD х 0,75 мм ID, 100 мм длина) в игле потянув инструмент в соответствии с инструкциями изготовителя. Иглы, пригодные для инъекций в морских ежей также хорошо работать для морских звезд, так что используйте аналогичные показатели ^19.
3. Загрузите около 2 мкл раствора для инъекций в инъекционной иглой с использованием чаевые microloader пипетки.
4. Вставьте тупой конец иглы в мanipulator. Установите picospritzer до 100 мс импульса и давление воздуха 40 PSI.
5. Поставьте блюдо Погреб эмбрионов на столике микроскопа и получить эмбрионы в поле зрения. Ориентировать антенну таким образом, что набрал линии на стороне, ближайшей к игле. Поместите иглу при приблизительно 60 ° углом, таким образом наконечник находится вблизи середины линии, и как раз над поверхностью воды.
6. Сосредоточьтесь на отмеченной линии и опустить иглу пока наконечник находится в фокусе. Опустите кончик немного больше и разорвать его открытым, запустив его нежно в хребтах надреза. Поднимите носок от поверхности чашки и расположить его в верхней части первой строке зиготы и сосредоточиться на зиготы.
7. Опустите кончик таким образом, что это будет пронзить центр зиготы, поступающие из вокруг углом 60 °. Игла легко проникает P. miniata зиготы. Шаг на педаль (или других средств вынуждает материал из инъекционной иглы) ввести болюс Injeводств решение в эмбрион.
8. Стремитесь к болюса, что на 20-30% диаметр эмбриона, или между 25 и 80 пл. Если болюс больше или меньше, чем это, настроить длительность впрыска на picospritzer и ввести следующий эмбрион. Продолжайте регулировать продолжительность, чтобы получить нужный размер болюса. Начало в 100 мсек. Re-сломать иглу, если больше, чем около 200 мс необходимо ввести соответствующий болюс. Выбросьте иглу и подготовить новый, если менее 15-20 мсек требуется получить этот размер болюса как размер иглы слишком велик и может нарушить нормальное развитие.
9. Продолжать вводить оставшиеся зиготы впрыска блюдо. Эмбрионы легко не может быть введен, пока не начнется расщепления и в отдельных бластомеров после первого деления дробления. Периодически поднимать иглу над поверхностью воды, чтобы удалить зиготы, которые торчат на иглу. При необходимости повторно сломать кончик иглы или загрузить новую иглу, если блокировка происходит.

5. Коллекционирование Введенный эмбрионов для Downstream анализа

1. Разрешить эмбрионы развивать при 15 ° С в SW. Поддержание высокой площади поверхности к объему в культурах, чтобы обеспечить обмен кислорода. Убедитесь, эмбрионы не переполнены; держать культур на уровне или ниже 200 эмбрионов / мл. В зависимости от желаемой стадии эмбриона, планируют собрать инъекционные эмбрионов в пределах 20-24 ч после оплодотворения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это часто идеальное время для сортировки и сбора и потому обычно развивающиеся эмбрионы легко отличить морфологически, но еще не плавание.
2. Если эмбрионы вылупились, мягко соль шок для предотвращения плавание. Добавить 200 мкл 5 М NaCl в 10 мл SW в инъекции блюдо, осторожно вращая SW. Через несколько минут, эмбрионы упадет на дно тарелки. Соберите их и переместить их в нормальном солености SW.
3. Сбор инъекционные эмбрионов в рамках соответствующего флуоресцентного источника света, совместимом с индикатора, используемого в injectiна решения. Если не использовали трассирующими, вроде эмбрионы, чтобы выбрать для нормальной морфологией.
4. Использование рот пипеткой, рисовать флуоресцирующих эмбрионов с минимальным количеством SW и удар их в небольшую чашку для культивирования, наполненной SW. Идеальное пипетки рот есть достаточно большое отверстие для эмбрионов потянуться в и не повреждая их, но не настолько большой, что нежелательные эмбрионы и посторонний SW также подъехал.
5. После того, как все желаемые эмбрионов были собраны в новую посуду, соблюдать эмбрионов под флуоресцентным светом и удалить все ип впрыском эмбрионов или плохо разработанных эмбрионов.
6. Культура сортируются эмбрионов в желаемых этапов в инкубаторе и заполните изображений или других желаемых протоколов.

Результаты

Целью этого протокола является введение реагентов в эмбрионы. Показана эффективность протокола путем введения ДНК репортерной конструкцией, что запускает экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP). Введенный эмбрионы выразить GFP в клоновых патчей (Рисунок 4A-B), как включа?...

Обсуждение

Есть два важных шагов, которые трудно для начинающих пользователей этой техники, но имеют важное значение для успешного создания morphant эмбрионов. Первый заключается в выборе здорового ооцитов, что созреет и оплодотворяют правильно. Процент нормального развития в культуре, в зависимост...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Methyladenine	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Capillary tubing	FHC, Inc	30-30-0	For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller	Sutter Instruments	P-97
Dextran, Rhodamine Green	Life Technologies	D7163	If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Also available in many pet stores
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003