Радио-телеметрическая система для мониторинга сердечно-сосудистой системы у крыс с спинного мозга Перерезка и эмбриональной нервной стволовой клетки трансплантатов

Резюме

Мы приводим протокол за использование радио-телеметрическая система для записи сердечно-сосудистых параметров в Т4 спинного мозга перерезанных крыс через восемь недель после эмбрионального ствола мозга нервной стволовой клетки прививки в месте повреждения. Телеметрия продвинутая техника, чтобы точно оценить сердечно-сосудистую функцию в сознательных свободно движущихся с повреждением спинного мозга крыс.

Аннотация

Высокое грудной или шейки травмы спинного мозга (SCI) может привести к сердечно-сосудистой дисфункции. Чтобы контролировать параметры сердечно-сосудистой системы, мы имплантировали катетер, соединенный с радиопередатчиком в бедренную артерию крыс, что была проведена T4 спинного мозга рассечение с или без прививки эмбриональных стволовых полученных нервных стволовых клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок. По сравнению с другими методами, такими как вставки канюли или хвост манжеты, телеметрии выгодно постоянно контролировать артериальное давление и частоту сердечных сокращений в свободно движущихся животных. Он также способен долгосрочных нескольких поглощений данных. В повреждением спинного мозга крыс, базальные сердечно-сосудистые данных под безудержной состояния и вегетативной дисрефлексии в ответ на колоректального живота были успешно записаны. Кроме того, сердечно-сосудистые параметры до и после ТСМ можно сравнить в том же крысы, если передатчик имплантируют перед спинного мозга рассечения. Одним из ограничений описанного telemetПроцедура ры является то, что имплантация в бедренную артерию может повлиять на кровоснабжение ипсилатеральном задней конечности.

Введение

Сердечно-сосудистая дисфункция возникает после травмы спинного мозга (SCI) на высоких уровнях. Это проявляется в неупорядоченной артериального давления и частоты сердечных сокращений в состоянии покоя, ортостатической гипотензии, вызванной физической нагрузкой гипотония и вегетативной дисрефлексии характеризуется эпизодами гипертензии и барорефлекторной опосредованного брадикардии в ответ на сенсорные стимулы ниже уровня травмы ^1,2. Эти симптомы вмешиваться в повседневной жизни спинальных больных мозга ранения. Таким образом, важно создать эффективные инструменты для исследования сердечно-сосудистых изменений у животных с ТСМ и экспериментальных методов лечения.

Для исследования сердечно-сосудистой системы у животных, несколько методов, которые были использованы для мониторинга артериального давления и частоты сердечных сокращений. Центральные сердечно-сосудистые параметры могут быть записаны с помощью вставки канюли и телеметрии, в то время как неинвазивные хвост-манжеты могут быть использованы для измерения периферической крови давление ^3. По сравнению с другими методами, телеметрия имеет главное преимущество, что она позволяет для непрерывной записи в свободно движущихся животных и долгосрочного мониторинга сердечно-сосудистой функции ^4. В моделях с повреждением спинного мозга животных, изменения в периферической крови давления после экспериментальной стимуляции не может быть достаточно большим, чтобы быть обнаружены. Соответственно, подходящая методика кардиоконтроля должны быть выбраны для животных с ТСМ.

В настоящем исследовании, система радиотелеметрическими был введен для контроля сердечно-сосудистой системы у взрослых крыс после полной перерезки спинного мозга. Крысы получил трансплантацию сингенными крысы эмбриональных день 14 (E14) ствола мозга, полученных нервные стволовые клетки (BS-НСК) в месте повреждения. Крысы с травмой и не трансплантации и наивных, неповрежденной крыс были контрольной группой. Порядок телеметрии включает стерилизацию передатчика и имплантации (рисунок 1), запись базальной сердечно-сосудистой параметра, колоректальный живота, вызванного ответов и очистку передатчика ихранения.

протокол

Все протоколы животных были утверждены уходу и использованию комитета за животными (IACUC) по. NIH руководящие принципы для ухода за лабораторными животными и безопасности строго соблюдаются. Животные с хирургическими процедурами были адекватное лечение для минимизации боли и дискомфорта.

1 спинного мозга Curgery и сотовый Прививка

1. Автоклав хирургические инструменты Предыдущие всем операций. Используйте Hot бисера стерилизатор (Fine Наука Tools), чтобы удалить болезнетворные микроорганизмы и микробные загрязнения из инструментов между процедурами на различных животных. Используйте стерильные хирургические перчатки, халат и шторы во время операции. Применять асептический хирургическую технику для каждого хирургического вмешательства.
2. Женский Обезболить Фишеру 344 крыс с комбинацией (2 мл / кг) кетамина (25 мг / мл), ксилазина (1,3 мг / мл), и ацепромазина (0,25 мг / мл) вводили через внутрибрюшинной инъекции (IP).
3. Бритье тыл и очистить кожу неоднократно бетадином и этанола.
4. Разрежьте кожу с помощью # 10 лезвие и тупо рассекают мышцы слоев. Используйте скальпель, чтобы изолировать позвонков, подвергайте T3 позвонок, и выполнить спинной ламинэктомию используя остроконечный кусачек.
5. Надрезать твердую мозговую оболочку в продольном направлении и секут спинной мозг на уровне Т4, используя комбинацию иридэктомия ножницами и микроаспирацией создать рострокаудальных разрыв примерно 1 мм от спинного пней мозга.
6. Подождите около 1 - 2 мин, пока кровотечение полностью останавливается, тогда шовных мышц с 3-0 Vycril и закрыть кожу раны клипов.
7. Введите Рингер-лактата (5 мл), бупренорфин (0,035 мг / кг), и ампициллин (33 мг / кг) подкожно сразу после операции и не поддерживают крыс в теплой инкубаторе до проснулся.
8. Введите Рингера и раствор ампициллин один раз в день до 10 дней, и бупренорфин два раза в день в течение 3 дней или до признаки боли и страданий исчезают. Не вернуть животное к компании других животных, пока FУлли восстановлены.
9. Вручную опорожнить мочевой пузырь два раза в день в течение приблизительно двух недель до установления рефлекторной опорожнения мочевого пузыря, а затем опорожнить мочевой пузырь раз в день на протяжении выживания при необходимости.
10. Через две недели вновь анестезию SCI крыс, как описано выше, и повторно подвергать спинного мозга сайт поражения. Держите твердую мозговую оболочку закрыт сохранить имплантированных клеток в месте повреждения.
11. Введите 10 мкл раствора клеток (3,5 × 10 ⁵ мкл), собранной из E14 повсеместно GFP эмбрионов трансгенных крыс и встроенного в фибриногена и тромбина ^5,6, в эпицентре полости поражения и ростральной и хвостового интерфейса поражения с распределенным впрыском сайтов, с использованием вытащил стеклянный микропипетки с внутренним диаметром 40 мкм, подключенного к шприца Гамильтона.
12. Шовный мышечные слои и закрыть кожу раневых клипов.
13. Действия после инъекции хирургии и ухода мочевого пузыря, как описано в шагах 1,6 - 1,8.
14. Неделю бытьпередние перфузии, вводят 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 мл в дистиллированной воде) внутрибрюшинно к ретроградно этикеток симпатических преганглионарных нейронов в спинном мозге ^7.

2 Передатчик Имплантация

1. Замачивание transmittersin 2% раствор глутарового альдегида (4 мл 50% glutaraldhyde в 96 мл дистиллированной воды) в течение по крайней мере 1 - 2 часов (до 10 ч) при комнатной температуре в течение стерилизации.
2. Промыть тщательно передатчиков стерильной 0,9% физиологического раствора 3 раза, и не хранить их в физиологическом растворе до использования (не более 1 часа).
3. Через восемь недель после трансплантации клеток E14 (10 недель после травмы), reanesthetize крыс, которые прошли в SCI с или без клеток прививки и наивных контрольных крыс.
4. Бритье области живота и задних конечностей. Очистите кожу с Бетадин. Поместите крысу на операционном столе в положении лежа на спине.
5. Надрезать кожу на брюшной живота и внутренней поверхности бедра на правой стороне с помощью # 15 лезвие.
6. Вырезать через хubcutaneous соединительные ткани, чтобы разоблачить связку бедренных сосудов и нервов, используя маленькие ножницы.
7. Отделите бедренную артерию от вены и нерва, используя тонкий пинцет с загнутыми кончиками.
8. Положите три шелковых швов под артерии и сделать свободный узел в каждой шва.
9. Применение 0,1 мл Лидокаин (2%) с поверхностью артерии, чтобы вызвать расширение кровеносных сосудов для последующей катетеризации.
10. Закрепите судно дистально с постоянным шелковой узлом и временного блока проксимально, растягивая свободную шелковой нитью.
11. Прокол артерии с помощью 20 калибра изогнутую иглу и вставьте кончик телеметрической катетера (длиной 8 см), используя инструмент ввода катетера.
12. Вставьте катетер рострально до 4 см, таким образом помещая кончик в грудной аорты.
13. Закрепите катетер в сосуде, связывая три шелковых швов вокруг бедренной артерии.
14. Сделайте подкожный карман вдоль фланга между хвостового края грудной клетки и Тон наиболее черепно расширение диапазона колена с тупыми ножницами.
15. Вставьте корпус датчик в карман и швом к соединительной ткани, окружающей передатчик, чтобы избежать чрезмерного движения.
16. Шовный кожу под № 6 шелковой нитью.
17. Введите Рингер-лактата (5 мл), бупренорфин (0,035 мг / кг), и ампициллин (33 мг / кг) подкожно сразу после операции и не поддерживают крыс в теплой инкубаторе до проснулся.

3 базальной Среднее артериальное давление (САД) и частоты сердечных сокращений (HR) Запись

1. Еще в один день следующей передатчика имплантации, поставить одного животного на приемнике площадку и включить передатчик. Подождите примерно 10 - 15 мин, чтобы приучить животное и стабилизировать сердечно-сосудистых параметров.
2. Запись отдыха MAP и HR, которые являются производными от импульсов артериального давления с компьютеризированной системой сбора данных, по крайней мере 1 часа. Сбор данных каждые 5 секунд.
3. Монитор Анimals непрерывно и удаления точек данных во время появления видимых судорог. Для каждого животного, средние точки данных для получения средних значений.

4 Колоректальный Вздутие вызванной автономная дисрефлексия

1. Задержите NSC-привитые или управления SCI крыс в полотенце, поставляемой с пищевыми гранул внутри на ресивере передатчика. Обычно крысы могут остаться совместно во время процедуры.
2. Вставьте воздушный шар латекса наконечником катетера в прямую кишку в течение примерно 2 см и закрепите его в хвост с лентой ^8.
3. Включить передатчик и дождитесь 10 - 15 мин позволяя кровяное давление, чтобы вернуться к preinsertion базовой линии.
4. Вызвать колоректального растяжение надуванием баллона медленно в течение 10 сек с 1,4 мл воздуха в течение 1 мин, чтобы генерировать давление от примерно 30 мм рт.
5. Запись MAP и HR 1 мин до 1 мин во время, и 1 мин после колоректального живота; выборочные данные каждые 3 сек во время процедуры 3 мин.
6. Выполните 2 - 3 испытания на животных, по крайней мере 15 мин восстановления промежутке между двумя испытаний.
7. Передозировка животные (IP) с двойным комбинации доза анестезии, описанной выше, если не дальнейшей оценки. Заливать животных с физиологическим раствором с последующим 4% параформальдегидом.
8. Для каждого животного, средние значения до и во время колоректального растяжения соответственно; вычислить разницу между исходным и вздутие-индуцированное отображение и HR изменений для каждого испытания; среднем за 2 - 3 испытаний для получения средних значений.

5 передатчик для очистки

1. Снимите передатчик от тела животного после анестезии, но до перфузии. Замочите сразу в стакан не с дистиллированной водой до очистки; избежать сушку телеметрической устройства.
2. Передача дальномер до 1% Terg--Zyme моющим раствором ферментативную (10 г / л воды) в течение 24 ч при комнатной температуре.
3. REGEL кончик передатчика катетера с тупым 30 иглыподключен к REGEL шприца.
4. Тщательно высушите передатчик используя сложенную мягкую ткань и хранить его в оригинальной пластиковый лоток.

Результаты

Используя описанную выше технику телеметрии, мы успешно записаны сердечно-сосудистых параметров в с повреждением спинного мозга животных. У животных с только ТСМ, MAP был значительно сокращен в то время как HR увеличилась по сравнению с наивными животных, в соответствии с предыдущими до?...

Обсуждение

Традиционно, наполненной жидкостью полая игла вставлена ​​в артерию и соединен с датчиком давления для записи параметров сердечно-сосудистой системы в качестве терминального снимка в каждом животном ^11. Чтобы постоянно следить сердечно-сосудистой производительность в течение...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension