JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Аннотация

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Введение

Бактерия Clostridium ботулинического производит нейротоксин ботулизма, один из самых мощных биологических токсинов, известных человеку 1. Есть 7 различных ботулинического токсина серотипа (ботулинического токсина / AG). BoNT / A-Галль вызвать паралич в нервно-мышечном соединении из-за SNARE комплекса протеолиза 2,3. SNARE протеолиз предотвращает нейромедиатора везикул-слияние мембран и, следовательно, блоки нейротрансмиттеров экзоцитоз 4. Конкретный целевой SNARE, зависит от конкретного BoNT серотипа, вовлеченной в процесс интоксикации. BoNT / и BoNT / E расщепляют SNAP-25, тогда как BoNT / C расщепляет обе SNAP-25 и синтаксина 5. Остальные серотипов расщепляют синаптобревин (также называется везикул, ассоциированных мембранный белок (VAMP). BoNT / была выбрана для разработки анализа, как он отвечает за высокой долей природного ботулизма и имеет самую длинную продолжительность действия 6. Развитие малого молекулы терапевтические против BoNT / A является одной из основных целей длянаша программа открытие и использовал традиционные методы целевые основе выявить активные ингибиторы сайт протеолитические 7, 8-10. Тем не менее, создание активных ингибиторов сайта с действием широкого спектра против нескольких серотипов и эффективности постэкспозиционного, вероятно, будет сложным.

Поэтому мы внедрили инновационную фенотипическую наркотиков подход обнаружения, которая использует BoNT SNAP-25 расщепление в качестве функциональной конечной точки для определения малых молекул, которые могут блокировать BoNT-опосредованной двигательных нейронов интоксикации. SNAP-25 необходим для высвобождения нейротрансмиттеров, как деградация SNAP-25 является предиктором паралича и летальности в естественных условиях. Например, на основе клеток скрининг может привести к обнаружению новых модуляторов клеточных факторов, ответственных за токсин инактивации или ингибирования токсина путей внутри клеток-мишеней. Важным фактором в развитии фенотипической анализа является выбор физиологически соответствующих биологических моделей. Wе и другие описали мышиных эмбриональных стволовых (ES) клеток, полученных моторные нейроны, которые воспроизводят иммунологическую характер первичных двигательных нейронов, в том числе выражения SNAP-25 11- 13. Важно, что эти сотовые системы весьма чувствительны к BoNT / A интоксикации и демонстрируют зависимое от дозы расщепление SNAP-25 в ответ на увеличение концентрации токсина 11,12. Дифференцированные моторные нейроны производятся также в количествах, достаточных для анализа, основанного высокая пропускная пластины и разрешенных дизайн массив клеточных анализов.

Фенотипический анализ является методом иммунофлюоресценции с использованием двух различных антител для количественного расщепление эндогенно выразил полноразмерной SNAP-25 во время BoNT / A интоксикации мыши двигательных нейронов культуры. Карбоксильную терминал BoNT / расщепление чувствительных (BACS) антитело, которое распознает только полную длину SNAP-25 позволяет оценить BoNT / A опосредованного протеолиза SNAP-25выражение в двигателе мыши нейронов 10. Принципиальная схема анализа HCI изображен на рисунке 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Пластинчатые 20000 дифференцированы ЭС клеток мыши (MES) / лунку в 96-луночные Поли-D лизина покрытием пластин и поддерживать в двигательных нейронов терминал среде для дифференцировки в течение 5-7 дней.

1. Соединение Администрация и Интоксикация с BoNT / A

Выполните все следующие работы в BSL2 корпусе, обеспечивать соблюдение принципов CDC / NIH.

  1. Подготовка 10 мМ исходные растворы каждого библиотечного соединения в 100% ДМСО в полипропиленовые 96-луночных планшетах. Используйте 10 мМ маточного подготовить промежуточную пластину разбавления, которое в 10 раз больше, чем в желаемой концентрации скрининга. Подготовьте 100 мкМ промежуточную пластину с помощью дозирования 10 мМ маточного в 96-луночный планшет и разбавить его до 100 мкМ использованием питательных сред. Разлить по 10 мкл соединений на 90 мкл среды на клетки 11. Проверьте соединения на 10 мкм конечной концентрации и обеспечить окончательное процент ДМСО не превышает 0,5%.
  2. Выполните все шпильких годов, которые используют живые клетки и активный токсин под уровнем биобезопасности 2 условия. Заменить старые носители в 96-луночных планшетах с с 80 мкл свежей среде для дифференцировки терминал с помощью ручного пипетки 12 канала. Провести стремление и обойтись шаги по строкам, чтобы избежать воздействия клеток без СМИ в окружающий воздух.
  3. Предварительной обработки клеток с соединениями до применения токсина путем добавления 10 мкл 10х соединений из исходного пластины с помощью пипетки 12 канала, а затем перемешивали с помощью аспирации (два раза). Для каждого 96-луночного планшета, лечить две колонки 6 скважин с 10-кратным ДМСО, разведенного в средствах массовой информации, чтобы служить в качестве сигнала высокой и низкой контроля сигналов. Колонна без лечения ботулинического токсина наблюдается самый высокий уровень по всей длине SNAP-25 (высокая управления сигнал). Лечить другой столбец с BoNT одиночку (без каких-либо соединений) в качестве контроля низкого сигнала. Используйте низкий контроль наблюдать эффективность ботулинического токсина расщепления SNAP-25 и его обнаружения с антителом BACS (рисунок 2).
  4. Инкубируйте клетки с соединениями течение 30 мин при 37 ° С и 6% CO2 в инкубаторе для клеточных культур.
  5. Подготовьте A ботулинического нейротоксина от 1 мг / мл коммерческого источника в фосфатно-солевом буфере (PBS) до конечной 10-кратным рабочего запаса путем разбавления с терминальной дифференцировки массовой информации.
  6. Инициировать интоксикации добавлением 10 мкл 10х BoNT / фондовой в скважинах, предназначенных для лечения и низкий сигнал управления, используя многоканальную пипетку (рисунок 2). Лечить скважин, отнесенные высокой контроля с одних СМИ.
  7. Дезактивации все пластиковую посуду и другие одноразовые, что приходит в соприкосновение с BoNT / A в ходе исследования путем погружения в 0,825% раствора гипохлорита в воде в течение по крайней мере 20 мин. Выполните все процедуры в кабинетах биобезопасности и обеззараживания рабочие зоны до и после экспериментов с 5% моющего средства дезинфицирующим моющим средством, таких как раствор Microchem.
  8. Этикетка пластины четко обозначить использование токсина и incubели пластины обрабатывают 1 нМ / л BoNT / A в течение 4 ч при 37 ° С и 6% CO2 в инкубаторе для клеточных культур. Дисплей соответствующее обозначение сообщить коллегам, что токсин используется в лаборатории.
  9. Стоп BoNT / протеолитическое расщепление с помощью метанола фиксации. Удалить средах, содержащих токсин и соединений из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки и выбросить в 10% -ного раствора хлорной извести. Добавить ледяной метанола (100 мкл) непосредственно в каждую лунку.
  10. Инкубируйте пластин в течение 15 минут при комнатной температуре (RT), чтобы позволить происходить фиксации.
  11. После фиксации, безопасного обращения отброшенные реагентов (считается обезврежены) с 1 протоколов уровня биобезопасности и выбросить соответственно.
  12. Откажитесь метанола и использовать 100 мкл PBS, чтобы промыть клетки и увлажняет их до иммунной. Выполните два дополнительных промывок PBS.
  13. После последней промывки, не оставляют PBS в колодцы, уплотнительные пластины с микропланшет клейкой пленкой и хранить при температуре 4 ° С до анализа. Храните пластины при 4 ° С FOг несколько дней.

2. Иммуноокрашивание

Процедура иммуноокрашивание является трудоемким, многоступенчатая операция, которая включает в себя повторяющиеся реагентов циклов дозирования / набирая и обширный мытье плиты, которые могут привести к потенциальному введению значительной внутриплитного и межплитного изменчивости. Полуавтоматическое подход применяется, чтобы сохранить время лабораторного персонала, повысить анализа пропускной и минимизировать иммуноокрашивания изменчивость.

  1. Используйте автоматизированное рабочее место, оснащенный головкой 96-луночного способный переносить объемы до 250 мкл и интегрирован с роботизированной захвата рукой, чтобы переместить лабораторное оборудование в разных местах на модульной палубе (см Материал и оборудование) для этого протокола.
    1. Модульная палуба предназначена для размещения различных видов лабораторного оборудования и может поддерживать до 11 пунктов в любой момент времени. Автоматизированная обработчик микропланшет оснащен двойной журнала микропланшетного укладчика, чтобы удержать иманипулировать до 50 пластин в цикле.
    2. Автоматизированное рабочее место находится внутри шкафа класса II биобезопасности, предназначенного для оборудования автоматизации лабораторных обеспечить стерильность и безопасность. Для автоматизированного иммуноокрашивания, колода расположены, как показано на рисунке 3, чтобы обеспечить доступ реагентов по мере необходимости и без участия человека.
  2. Предварительная нагрузка плиты, содержащие фиксированные клетки в пластине журнала и передачи на палубу, сколько необходимо для операций с жидкостями. Используйте 96 пипетки голову, оснащенный 250 мкл советы для аспирации PBS из скважин до 10 мкл. Проницаемыми клеточные мембраны, чтобы облегчить связывания антитела с внутриклеточных мишеней с пермеабилизации буфера (0,1% Тритон Х-100). Разлить проницаемости буфер (100 мкл) в каждую лунку перед возвращением пластины ко второму хранения журнала в микропланшет-укладчика для 15-минутной инкубации при комнатной температуре (RT).
  3. Снимите буфер проницаемости и реrform пластины промывают PBS (дважды), как описано выше в шаге 1,13.
  4. После последней стадии промывки, удалить PBS буфера и обойтись 100 мкл блокирующего буфера, содержащего 1% лошадиной сыворотки и 0,1% Tween 20 в PBS в микропланшетах все перед их возвращением к пластине журнала в течение 1 часа инкубации при комнатной температуре.
  5. Использование двух первичных антител для иммунным окрашиванием: кроличьей поликлональной анти-мыши BACS антитела, для обнаружения полной длины SNAP-25 и мышиное моноклональное анти-III тубулина антитела для выявления нейронов (см материалы и оборудование). После 60 мин инкубации, удалить блокирующем буфере и выдачи 50 мкл 4ug / мл антитела БАКС и 0,5 мкг / мл III-тубулина в блокирующем буфере во все тарелки.
  6. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре удалить первичных антител и промыть 3 раза 100 мкл PBS, содержащим 0,05% Tween (PBST).
  7. Используйте IgG анти-мыши с надписью с Alexa Fluor 647 визуализировать -III тубулина и анти-кролик IgG с меткой Alexa Fluor 568 визуализировать антитела BACS. Подготовьте оба антитела, как разбавление / мл в 2 мкг в блокирующем буфере и выдачи 50 мкл смеси в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: вторичные антитела, отобранные для иммуноокрашивания помечены разными флуорофорами, чтобы обнаружить их, испускаемого флуоресцентного света на различных длинах волн, используя различные каналы в детекторе за высокого содержания Imager.
  8. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Аспирата вторичные антитела и промыть 3 раза 100 мкл PBST.
  9. После последней промывки, добавляют 100 мкл PBS, содержащего краситель Hoechst (32 мкМ), чтобы окрасить ДНК для обнаружения ядер.
  10. Уплотнение тарелки с легкой непроницаемой пленкой, чтобы защитить флуорофоры от фотообесцвечивания. Плиты можно хранить на 4   ° C в течение нескольких недель без значительной потери сигнала.

3. изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните сканирование изображения с помощью высокого содержания образами Sysма (См материалы и оборудование).

  1. Спецификация высоких Определения тепловизора контента:
    1. Выберите тип плиты, планировка, количество полей, цель: Greiner у ясно, 96 Формат хорошо, 16, 20Х воды соответственно.
    2. Выбор каналов: ядро ​​EX возбуждения: 405 нм, как канал 4; цитоплазма EX: 644 нм, как канал 2; антигенспецифичной канал антитела EX: 561 нм, как канал 3 и Настройка мощности возбуждения каждого лазера, установки эксперимент как 2 экспозиций, экспозиции 1 с одной возбуждения на 644 нм, экспозиция 2 с двумя возбуждений на длине волны 405 нм и 561 нм. Выберите биннинга как BIN2.
    3. Используйте высокие скважин управления для оптимизации экспозиции с максимальной интенсивностью, как SNAP-25 канал и низких скважин управления для минимальной интенсивности.
    4. Регулировка экспозиции, так что интенсивность каждого канала составляет около половины от уровня насыщения (2000-2500 относительных единицах).
    5. Определить оптимальный Z самолет на маски клеток канала с помощью дельта-скрипт коррекции. См Fiцифра 5 результатов после иммуноокрашивания и визуализации. Экспорт данных на сервер, где программное обеспечение для анализа изображения, проживающего.

4. Анализ изображения (рисунок 6)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают применение программных алгоритмов Коламбус.

  1. Выберите подходящий алгоритм для сегмента первичные объекты (ядра). При необходимости, отрегулируйте фона порог и параметры контрастности. Программное обеспечение Колумб обеспечивает 4 методы обнаружения ядра. Выберите метод, который сегмент ядра точно по визуальном осмотре сегментированные ядра (в F метода igure 6а М выбран).
  2. Выберите алгоритм аксонов (CSIRO нейритов Analysis 2) в сегмент нейриты При необходимости отрегулировать фон пороговые и контрастные параметры, чтобы удалить фон. Смотрите рисунок 6b для параметров, используемых для обнаружения нейриты.
  3. Определить нейрита регионы (сегменты нейритов) басред на вторичных объектов (невриты), используя -3 расширение пикселя тубулина канала β-III (Alexa муки 640) как маски (рис 6в).
  4. Рассчитать интенсивность сигнала каналов (SNAP-25, (Alexa Мука 568) для региона невриты и тубулина канала β-III (рис 6d и 6е).
  5. Выберите необходимые параметры для экспорта, такие как длина аксонов, средних интенсивностей SNAP-25, β-III тубулина, номер ядер, невритного номера сегмента и т.д. (рис 6f).
  6. Передача плиты из листоукладчики использованием робота и загрузить в высокое содержание тепловизора для получения изображения.

5. Анализ данных:

Для оценки надежности проектируемого анализа, рассчитать следующие параметры из эксперимента пластины основе.

  1. Сигнал (S) для фона (B): S / B = средняя интенсивность высокой контроля сигнала) / средняя интенсивность низкой контроля сигнала
  2. Коэффициент вариации (КВ) сигнала и фона (для измерения равномерности конкретного сигнала): CV = (стандартное отклонение (SD) / среднее образца) * 100 (%), чтобы определить изменчивость в жидкой обработки, реагентов и т.д.
  3. Сигнал-шум: S = (средняя интенсивность сигнала - средняя интенсивность низкой контроля сигнала) / SD низкого контроля
    1. Рассчитать коэффициент в Z 'с опьянением половины 96-луночного планшета в и макет опьянения другой половины. Z '= 1 - 3 * (SD высокой контроля сигнала + SD низкого сигнала управления) / (имею в виду высокого контроля сигнала - среднее низкой контроля сигнала). Для дальнейшего анализа данных скрининга, нормализуют некоторые из основных исходных параметров на пластине основе, чтобы позволить сравнение между пластинами и между различными экспериментами дней.
  4. Процент расщепления, что свидетельствует о снижении сигнала, связанного с полной длины SNAP-25 обнаружено специфических антител (БАКС): Расщепление% = 100% * (MEAн интенсивность высокой контроля сигнала - интенсивность образца) / средняя интенсивность высокой контроля сигнала.
  5. Процент ингибирования расщепления:% ингибирования = 100% * (интенсивности образца - значит, интенсивность низкого сигнала управления) / (средняя интенсивность высокой контроля сигнала - средняя интенсивность низкой контроля сигнала).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Данные из высоких и низких управления создали две различные популяции с разницей в два медианы более 3 стандартных отклонения (7А). Цель процесса отбора является найти соединений в пределах выборки населения со значениями ближе к положительной контрольной популяции, предпола?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Высокая эффективность ботулинического нейротоксина и относительной легкости их милитаризации привело их отнесения к категориям А (самый высокий приоритет) biothreat агентов по Центров США по контролю и профилактике заболеваний. К сожалению, не существует FDA не утвердил терапевтические п?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Krishna P Kota is an employee of Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, that produces instruments and software used in this manuscript. The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the U.S. Department of Health and Human Services, the U.S. Department of Defense, the U.S. Department of the Army, or the institutions and companies affiliated with the authors.

Благодарности

Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Botulinum neurotoxin A MetabiologicsNANo catalog number
Microtitre platesGreiner 655946Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibodyLampire BiologicalNA
MicrochemNational 0255
MethanolThermo ScientificA412-20
FormaldehydeThermo Scientific28908
Horse serumInvitrogen16050
PE JANUS MDT Mini Automated WorkstationPerkin ElmerAJMDT01
OperaPerkin ElmerOP-QEHS-01
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
BIII tubulin antibodyR&D SystemsBAM1195
Tween 20SigmaP1379-1L
Hoechst 33342dye Invitrogen3570
Antimouse IgGInvitrogenA21236
Anti rabbit IgGInvitrogenA10042
Columbus Image analysis softwarePerkin ElmerVer 2.4
SpotfirePerkin ElmerVer 5.5
Clorox bleachFisher Scientific18-861-284
PlateStack

Ссылки

  1. Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
  2. Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
  3. Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
  4. Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
  5. Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
  6. Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
  7. Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
  8. Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
  9. Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
  10. Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
  11. Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
  12. Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
  13. McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
  14. Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience93Clostridium

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены