Создание<em&gt; Enterobacter</em&gt; Зр. ЕГУ ауксотрофов Использование транспозонный мутагенез

Резюме

Enterobacter зр. ЕГУ растет в глюкозе минимальную солевую среду. Ауксотрофов генерируются путем преобразования его с transposome которые случайно вставляет себя в геном хозяина. Мутанты найден реплик из сложной среды в минимальной среде. Прерванный гены обозначаются гена спасения и секвенирования.

Аннотация

Прототрофных бактерии растут на М-9 минимальную солевую среду, дополненную глюкозы (М-9 среде), который используется в качестве источника углерода и энергии. Ауксотрофов могут быть получены с использованием transposome. Коммерчески доступны, Tn 5 -derived transposome используется в данном протоколе состоит из линейного сегмента ДНК, содержащей γ начала репликации R6K, ген устойчивости к канамицину и две мозаики последовательности концах, которые служат в качестве сайтов связывания транспозазу. Transposome, предоставляется в качестве белкового комплекса ДНК / транспозазы, вводится путем электропорации в прототрофных в штамме Enterobacter, уд. ЕГУ, и случайным образом включает себя в геном этого хозяина. Трансформанты реплика была помещена на Лурии-Бертани агаром, содержащих канамицин, (LB-KAN) и с агаром, М-9-среды, содержащей канамицин (M-9-KAN). Трансформанты, которые растут на LB-кан пластин, но не на M-9-кан пластин считаются ауксотрофы. Очищенная геномнаяДНК из ауксотроф частично переваривается, лигирована и преобразован в PIR ⁺ кишечной палочки (E.coli) штамма. Репликация Происхождение R6Kγ позволяет плазмиды повторить в PIR ⁺ E. штаммы кишечной палочки, а также резистентность к канамицину маркер позволяет выбрать плазмиды. Каждый трансформант обладает новую плазмиду, содержащую транспозона фланкированную прерванного хромосомной области. Сэнгер секвенирования и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) предложить предполагаемый личность прерванной гена. Есть три преимущества использования этой transposome стратегию мутагенеза. Во-первых, она не зависит от экспрессии гена транспозазы хостом. Во-вторых, transposome вводится в целевом узле путем электропорации, а не путем конъюгации или трансдукции и, следовательно, является более эффективным. В-третьих, репликация происхождение R6Kγ позволяет легко идентифицировать мутантный ген, который частично восстановлены в рекомбинантной плазмиде. Этот метод может быть использован, чтобы исследовать гены, участвующие в других характеристик Enterobacter SP. ЕГУ или более разнообразных бактериальных штаммов.

Введение

Прототрофных бактерии растут в М-9 минимальную солевую среду, содержащую глюкозу (М-9 среде), превращение глюкозы через центральные путей метаболизма углерода генерировать предшественники, такие как аминокислот, нуклеиновых кислот и витамины, для биосинтеза ^1. М-9 среда содержит хлорид аммония в качестве источника азота, натрия и фосфат калия в качестве буфера и источника фосфора, сульфата магния в качестве источника серы и глюкозы в качестве источника углерода и энергии. Лурия-Bertani (LB) среда богата аминокислотами из триптона и в витаминах и ростовых факторов из дрожжевого экстракта. Он поддерживает рост ауксотрофов, что не может синтезировать аминокислоты, витамины и другие факторы роста, необходимые для роста на М-9 среде. Таким образом, прототрофов вырастет в LB и М-9 среде, в то время как ауксотрофы вырастет в LB среде, но не в М-9 среде. Вводя мутации в прототрофным популяции бактерий и идентификации мутантных генов, которые вызывают ауксотрофные фенотипы, это роssible, чтобы получить лучшее представление о метаболизме в бактериальном штамме.

Транспозонов мутагенез может быть использован для идентификации многих генов, необходимых для роста на глюкозе в М-9 среде. Транспозоны включить себя случайно в геном хозяина ^2. К пятнистость транспозона трансформантов на LB чашках с агаром и их реплик на М-9 средних чашках с агаром, можно показать на экране для ауксотрофов. Прерванный гены идентифицированы через гена спасения. Это исследование использует имеющиеся в продаже Tn 5 -derived transposome который поставляется в качестве решения линейного сегмента транспозонов ДНК смешивается с транспозазы белка. Сегмент ДНК отсутствует ген транспозазы, но содержит ген устойчивости к канамицину, на γ начала репликации R6K и две мозаичные мотивы, которые Последовательности ДНК для связывания транспозазы на каждом конце сегмента ^3,4. Поскольку белок транспозаза добавляют непосредственно к ДНК, ДНК-фрагмента в одиночкуопределяется как транспозона, и белковый комплекс ДНК / транспозаза определяется как transposome. Transposome преобразуется путем электропорации в ⁵ чувствительного к канамицину хоста (фиг.1А). Колонии, которые растут на чашках с агаром LB, содержащей канамицин (LB-кан) имеют транспозона вставок (рис 1б), и реплики покрытием трансформантов, которые не расти на М-9 средних пластин агара, содержащей канамицин (М-9-кан) являются ауксотрофы (Figire 1С). Геномную ДНК из мутанта очищают и частично переваривают с 4-щелочного рестрикции эндонуклеазы резки, BFU CI (рис 1D). Сшита ДНК трансформируют в штамм Escherichia coli (E.coli), который содержит ген PIR (рис 1E). Этот ген позволяет новую плазмиду, содержащую транспозона и фланговые области хромосомы хозяина для репликации в E. палочка ^6. Ген устойчивости к канамицину служит в качествеelectable маркер для новой плазмиды. Наконец, секвенирования с использованием праймеров, комплементарных каждом конце транспозонов и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) анализа ^7,8 полученной последовательности используются для определения идентичности прерванной генов.

Эта стратегия transposome мутагенеза обеспечивает три преимущества ^3. Во-первых, так как этот белок связывается транспозаза непосредственно к транспозона, вставка не зависит от экспрессии гена транспозазы в хосте. После того, как транспозона включает себя в геном хозяина, транспозаза ухудшается, предотвращая дополнительное движение транспозона. Однако, дополнительное движение не может быть предотвращено, если хост имеет эндогенный Tn 5 транспозиционные элемент. Во-вторых, введение transposome путем электропорации дает возможность использовать его в различных хостов. Это также устраняет необходимость введения транспозон бактериальной конъюгации или В.И.RAL инфекция. Оба процесса требуют восприимчивость хозяина. В-третьих, включение гена устойчивости к канамицину и γ репликации происхождения R6K в transposome делает его легче идентифицировать прерванный ген. Транспозона-прерывается регионы могут быть сохранены и секвенировали как плазмиды, устраняя необходимость использования обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации генов.

Протокол, представленные в этом видео описывается каждый шаг для транспозонов мутагенеза Enterobacter зр. ЕГУ ⁹ использованием transposome от его введения в бактериальных клеток к идентификации предполагаемого гена он прервал. В дополнение к ранее опубликованным протоколам ^3,4,10, подробные способы использования реплик для скрининга ауксотрофов представлены. Эта техника мутагенеза может быть использован для исследования других фенотипы, например, антибиотиков и металлических сопротивлений, в различных видов бактерий, для идентifying минимальное число генов, необходимых для роста при определенных условиях культивирования в синтетических исследований биологии, или для обучения лабораторный компонентом генетики или микробной физиологии конечно.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Электропорация компетентных клеток ^5,11

1. Развести в O / N LB культуру Enterobacter зр. ЕГУ 1/20 в 50 мл свежей LB среде и расти при встряхивании при 120 оборотах в минуту и ​​30 ° C до оптической плотности (600 нм) между 0,4 и 0,6. При желании, растут другие бактериальные штаммы в их оптимальной температуре роста.
2. Холод клетки на льду в течение 5 мин и центрифугируют при 4 ° С и 7000 х г в течение 5 мин.
3. Жидкость над осадком сливают, ресуспендирования клеток в 50 мл стерильной ледяной водой и центрифугируют при 4 ° С и 7000 мкг в течение 5 мин. Повторите этот шаг.
4. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в объеме ледяной воды, равном объему осадка клеток. Для длительного хранения, промыть клетки с 10 мл охлажденного льдом 10% (об / об) глицерина, ресуспендируют в равном объеме гранул охлажденного льдом 10% (объем / объем) глицерин, хранить при температуре -80 ° С, и оттепели на льду до электропорации.
5. Добавить 0,5 мкл transposome 40 мклклетки. Коммерчески доступный раствор transposome подается в концентрации ДНК 0,33 мкг / мкл. Хотя 0,33 мкг рекомендуется, 0,165 мкг ДНК достаточна.
6. Поместите клеток / transposome смеси на ледяной холод, 0,2 мм, кювету для электропорации и нажмите смесь на дно кюветы. Удар клетки при 25 мкФ, 200 Ω, и 2,5 кВ. Чтобы убедиться, что клетки остаются охлажденными, хранить электропорации кюветы в -20 ° C морозильнике до использования.
7. Сразу, добавить 960 мкл фильтр стерилизованные супер оптимальный отвар с катаболитной репрессии (SOC) среды. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз, и передавать клеткам стерильным 1,5 мл пробирке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: клетки начинают умирать после шока, но соль в SOC среды позволяет восстановить их. Чтобы сэкономить, не стоит добавлять transposome или шокировать негативные контрольные клетки. Просто добавьте 960 мкл стерильной SOC среды к нему.
8. Инкубируйте клетки при 30 ° C Fили 45-60 мин при встряхивании при 120 оборотах в минуту. Это обеспечивает время для transposome рекомбинировать с геномом хозяина и для клеток, чтобы выразить устойчивость к канамицину.
9. Spread 100 мкл клеток на LB-агаром кан и инкубируйте O / N при 30 ° С. Храните оставшуюся смесь трансформации в холодильнике при температуре 4 ° С. Спред дополнительные суммы на более поздний срок до 2-х недель после первоначального электропорации при необходимости.

2. Гридинг трансформантов

1. Лента сетки к крышке пустой 100 х 15 мм чашки Петри. Скопируйте сетку из "Краткого курса в бактериальной генетики" ^12.
2. Нарисуйте линию на дне чашки с агаром LB-кан. Используйте небольшой кусочек ленты привязать его к координатной привязкой крышкой так, что сетка видна через агар. Убедитесь, что линия на нижней пластине совмещена с верхней, центральной части сетки. Закрепление пластины с лентой держит его от скольжения, что позволяет даже гриддинга, Линия облегчает идентификацию колоний после реплик.
3. Pick одну трансформанта с стерильной зубочисткой и обнаружить его в центре квадрата в сетке. Просто нажмите на колонию и место. Не рой зубочистку в агар. Во избежание загрязнения пластину, обрабатывать зубочистку только на одном конце.
4. Найди еще трансформанту в соседней площади, как в шаге 2.3. Когда пластина заполнена, инкубировать ее O / N при 30 ° С. Это мастер пластины.

3. Копия Покрытие для Определите ауксотроф фенотип ¹²

1. Для каждой пластины, которая была с сеткой, чтобы стек три свежих чашках с агаром пронумерованных от одного до трех: один для LB-кан, два для М-9-кан и три для LB-кан. Сушат пластины вверх дном, O / N, при 37 ° С перед использованием.
2. Нарисовать линию на верхней части каждой пластины, как на стадии 2.2.
3. Протрите реплик инструмент с 70% этанола, разместить стерильный вельвет квадрат в верхней части реплик вол и зажать вельвет квадрат вниз. Руки кишат микробы даже после мытья их. Предотвратить введение загрязняющих микробов путем обработки вельвет квадрат по его краю.
4. Выравнивание линии на основной матрицы с линией, проведенной на зажиме и поместите пластину на верхней части вельвета площади. Нежный давление передать бактерии от пластины к вельвета площади. Будьте осторожны, чтобы не размазать бактерии. Снимите главный пластину из вельвета площади.
5. Совместите линию, проведенную на пластине номер один с линии на зажим и поместите его в верхней части вельвета площади. Слегка надавливайте на передачу бактерий от вельвета площади к плите. Снимите пластину номер один.
6. Откажитесь от вельвет площадь в стакан воды и поместите чистую, стерильную вельвет квадрат на инструмент реплик, как в шаге 3.3. Этот шаг позволяет более-прививки, которая вызывает рост прорыв и ложноположительные результаты.
7. СовместитеЛиния на пластине номер один с линии на зажим и поместите его поверх нового вельвета площади. Слегка надавливайте на передачу бактерий от пластины номер один в вельвета площади. Снимите пластину номер один.
8. Совместите линию, проведенную на пластине номер два с линии на зажим и поместите его в верхней части вельвета площади. Слегка надавливайте на передачу бактерий от вельвета площади для плиты номер два. Снимите пластину номер два.
9. Повторите шаг 3.8 для пластины номер три. Третий пластина управления для полного перевода из основной матрицы от двух других пластин. Откажитесь от вельвет площадь в стакан воды. Для повторного использования вельветовые квадраты, автоклав стакан, содержащий загрязненные вельветовые квадраты, мыть их, высушите их, обернуть их в алюминиевую фольгу и вновь автоклав их.
10. Инкубируйте пластин при 30 ° CO / N. Колонии, которые растут на обеих LB-кан чашках с агаром, но не растут на М-9-кан пластин считаются ауксотрофы ( Рисунок 2).
11. Подряд из ауксотрофы от пластины номер один на свежем LB-кан агаром и инкубировать пластины при температуре 30 ° CO / N.
12. Серия для изоляции 3 колоний от разводов пластины в шаге 3.11 на свежем LB-кан пластины. Инкубируйте планшет при 30 ° CO / N. Это гарантирует, что мутант хорошо изолирована. Разделите тарелку на три части и серию из каждой колонии в одном разделе.
13. Точечные колонии от полосатых из колоний, полученных из шага 3,12 на свежем LB-кан пластины, чтобы сформировать сетку, как на этапах 2.1-2.4. Каждый мутант повторного испытания в трех экземплярах.
14. Репликация пластину снова, как в шагах 3.1-3.10 для подтверждения фенотип ауксотроф.

4. Джин Rescue

1. Вырастить 3 мл O / N культуру изолированной мутанта колонии с шага 3,13 в жидком LB-кан среде при температуре 30 ° C. Очищают геномной ДНК из 1 мл культуры с использованием коммерчески доступного набора для очистки геномной ДНК.
2. Настройте смесь 0,025 UBFU ДИ эндонуклеазы рестрикции и в 14 мкл 1 мкг / мкл геномной ДНК в 20 мкл реакционной смеси на льду. Так как BFU ДИ разрезает транспозона на двенадцати различных сайтах, это может быть более эффективным в использовании эндонуклеазы рестрикции, БФА I или Hae III, который режет транспозона в двух и трех различных участков, соответственно.
3. Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 25 мин, а затем при 80 ° С в течение 20 мин, чтобы инактивировать фермент. Анализ 3 мкл частично переваренной ДНК в 0,8% агарозном геле (рис 3). А успешные промежуточные результаты пищеварения в мазке из выше 10 кб вниз к нижней части геля.
4. Лигировать 15 мкл частично переваренной геномной ДНК с использованием 800 единиц ДНК-лигазы Т4 в 500 мкл реакции. Выдержите реакция O / N в 4 ° C. Большой объем реакционной смеси максимизирует лигирование отдельных фрагментов с собой и сводит к минимуму взаимодействие между двумя или более фрагментов ДНК.
5. PrecipitaТе лигируют ДНК путем добавления 50 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,5, и 1 мл 95% этанола и инкубирование ее при -20 ° С в течение 20 мин.
6. ДНК микроцентрифуге при 4 ° С и 13500 х г в течение 10 мин, промыть осадок с 70% -ным этанолом, сушат его в вакуумной центробежного концентратора, и ресуспендируют его в 10 мкл нуклеазы свободной воды. Альтернативно, ДНК может быть сушили на воздухе при комнатной температуре в течение 15 мин.
7. Используйте 4 мкл ресуспендированного ДНК для трансформации E. Штамм ECD100D пир или ECD100D pir116 путем электропорации, как в разделе 1. R6k γ инициации репликации требуется бактериальный штамм с геном ПИР повторить ^6. Результаты деформации пир в низких плазмид копирования и штамм pir116 содержит ПИР мутантный ген, который приводит к высоким плазмид копирования. Каждый трансформант содержит новую плазмиду с транспозона и область прерванного хромосоме (рис 1E).
8. Inoculели 5 мл LB-среды с кан одной колонии, вырастить его O / N при встряхивании при 120 оборотах в минуту и ​​температуре 37 ° С и очищают плазмиду ДНК из всей O / N культуры с использованием коммерческого набора.
9. Дайджест 14 мкл плазмиды с помощью рестрикции Xho I. Убедитесь, что конечный объем реакции 20 мкл. Этот фермент распознает участок в середине транспозона на 5'-конце гена устойчивости к канамицину. Анализ 10 мкл непереваренной и переваривается плазмиды на 0,8% агарозном геле (рис 3). Плазмида состоит из 2 кб транспозонов плюс фланкирующей ДНК хозяина.

Секвенирование 5. ДНК

1. Последовательность этой плазмиды с использованием коммерчески доступного набора для секвенирования, праймеры, которые гомологичны каждом конце транспозона и систему анализа капиллярной секвенирования. С другой стороны, плазмиды могут быть отправлены на внешний учреждения для секвенирования.
2. Используйте молекулярную стандарт веса (1 кб лестница) вГель, чтобы оценить размер плазмиды. Тогда, оценить количество нг (нг) плазмиды, что требуется для 50 фМоль.
3. Измерение концентрации плазмидной ДНК с использованием спектрофотометра при длине волны 260 нм ₍₂₆₀₎ и 280 нм _(280). Убедитесь, длина пути света через кювету 1 см. Определить концентрацию путем умножения оптическую плотность при 260 нм с помощью 50 нг / мкл. Высокое качество ДНК плазмиды будет иметь ₂₆₀ / A ₂₈₀ соотношение между 1,8 и 2,0.
4. Объем ДНК, необходимого для каждой реакции секвенирования это количество, необходимое для нг 50 фмоль деленное на концентрации плазмиды. Смешайте объем требуемой плазмиды с водой, чтобы довести общий объем до 10 мкл.
5. Плазмидную ДНК / смесь воды теплоемкость при 96 ° С в течение 1 мин, а затем охлаждают ее до комнатной температуры.
6. Добавить 8 мкл мастер микс из комплекта секвенирования и 2 мкл 1,6 мкМ одного из секвенирования праймеров.
7. Фолнизкий протокол от секвенирования комплект для программы термоциклера и реакции очистки.
8. Анализ каждого образца с помощью системы анализа капиллярной ДНК.
9. Используйте имеющийся в продаже программный пакет для просмотра последовательности ДНК. Поиск последовательности ", 5'-GAGACAG-3 ',", который является последним 7 пар оснований транспозонов (рисунок 4). Последовательность перед 5'-конца этого отрезка 7 п.о. принадлежит транспозона. Последовательность после 3'-конца этого отрезка 7 п.о. принадлежит к прерванному гена.
10. Определите возможные функции прерванной гена с помощью Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) ^7,8. Используйте следующие link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Вставить последовательность прерыванияген ред в строке запроса, выберите «других» в рамках базы данных и нажмите на кнопку "BLAST" в нижней части страницы. Когда появится результат, прокрутить страницу вниз, чтобы просмотреть результаты выравнивания (рисунок 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Трансформация Enterobacter зр. ЕГУ путем электропорации с transposome инициирован случайную вставку генома в геном хозяина (рис 1а, б). Успешный электропорации дали несколько тысяч трансформантов, которые росли на LB-кан пластин. Чтобы получить 300-400, хорошо разнесены колоний на чашку, ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Транспозонов мутагенеза, используя transposome является эффективным инструментом для создания ауксотрофов в Enterobacter зр. ЕГУ и других видов грамотрицательных и грамположительных бактерий ^3,4. Процесс был инициирован введения Tn ​​5 -derived transposome в хозяина путем электропорации. Д...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentre (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate	Amresco, Inc.	0408-25G	When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate	Amresco, Inc.	0643-1KG
Yeast Extract	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium			0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I	NEB	R0636S	Partial digestion of genomic DNA
Xho I	NEB	R0146S	Plasmid digestion
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Nuclease Free Water	Amresco, Inc.	E476-1L	For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Promega	A1460	Plasmid purification
Replica Plating Block	Thermo Fisher	09-718-1
Velveteen Squares	Thermo Fisher	09-718-2	Replica plating
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grid for replica plating
Petri Dishes	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator	Labconco	7970010	Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System	Beckman Coulter		DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	DNA sequence analysis