Эмболические средней мозговой артерии Окклюзия (MCAO) для ишемического инсульта с гомологичными сгустки крови у крыс

Резюме

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Аннотация

Клинически, тромболитическая терапия с использованием рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (ТАП) остается наиболее эффективным средством для лечения острого ишемического инсульта. Тем не менее, использование ТАП ограничивается его узким терапевтическим окном и с повышенным риском геморрагической трансформации. Существует настоятельная необходимость в разработке подходящих моделей инсульта изучать новые тромболитических препаратов и стратегий для лечения ишемического инсульта. В настоящее время, два основных типа ишемических моделей инсульта были разработаны в крыс и мышей: внутрипросветной шовного MCAO и эмболии MCAO. Хотя модели MCAO через внутрипросветной техники шва широко используются в механизме управляемой исследований инсульта, эти модели шовные не имитировать клиническую ситуацию и не подходят для тромболитических исследований. Среди этих моделей, эмболии модель MCAO точно имитирует ишемический инсульт человека и подходит для доклинических исследования тромболитической терапии. Эта модель эмболии была впервые разработана в крыс О.В.ergaard др. ¹ в 1992 году и далее характеризовали Zhang и соавт. в 1997 году ^2. Несмотря на то, эмболии MCAO приобрела все большее внимание, есть технические проблемы, с которыми сталкиваются многие лаборатории. Для удовлетворения растущих потребностей в тромболитической исследований, мы представляем хорошо воспроизводимый модель эмболии MCAO на крысах, которые могут развиваться предсказуемый объем инфаркта в пределах территории MCA. Вкратце, модифицированный трубки ПЭ-50 слегка расширенный от наружной сонной артерии (ECA) в просвет внутренней сонной артерии (ВСА) до кончика катетера достигает происхождение MCA. Через катетер, один гомологичны тромб находится в начале координат МСА. Чтобы определить успех окклюзии СМА, региональный церебральный кровоток контролировали, неврологические расстройства и объемы инфаркта были измерены. Методы, представленные в этой статье, должны помочь следователям по преодолению технических проблем для создания этой модели для исследования инсульта. </ P>

Введение

Инсульт является третьей ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах, но варианты лечения острого инсульта оставаться ограниченным. В настоящее время внутривенное вливание рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (ТАП), чтобы растворить тромбы является наиболее эффективным для лечения острого ишемического инсульта. Тем не менее, использование ТАП ограничивается его узким терапевтическим окном и с повышенным риском внутримозгового кровоизлияния. Поэтому модель инсульта подходящей для тромболитической исследования является насущной потребностью.

Средней мозговой артерии (МСА) является артерии окклюзии, чаще всего в инсульта у человека. Основное внимание на этой артерии, были созданы многие животные модели ишемического инсульта. В настоящее время, два основных типа грызунов фокусное моделей ишемии по окклюзии MCA были разработаны: шов MCAO модели и эмболии МСАО модель. Хотя модели MCAO через внутрипросветного техники шва были широко использованы в механизме приводом исследований инсульта, эти модели шовные неимитировать человеческое инсульт, а до 80% от ударов человека вызваны тромбоза или эмболии. Тем не менее, эмболии модель удара с использованием тромбов точно имитирует человеческую инсульт и считается подходящим для тромболитической исследования. Эта модель эмболии была впервые разработана в крыс Overgaard соавт. ¹ в 1992 году и далее характеризовали Чжан соавт. В 1997 году ² и ДиНаполи соавт. В 2006 году ^3. Несмотря на то, эмболии MCAO приобрела все большее внимание, есть технические проблемы, с которыми сталкиваются многими лабораториями.

В этой статье мы покажем, стандартный способ получения эмболической MCAO с гомологичными тромбов в взрослой крысы, которые могут развиваться предсказуемый миокарда в пределах территории MCA. Методы, представленные в этой статье, должны помочь исследователям преодолеть технические проблемы для установления эту модель для исследования инсульта.

протокол

О себе Этика: Мужской взрослых Спрэг Доули (весом 330-380 г) были использованы в данном протоколе. Этот протокол был одобрен уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в ЛГУ Health Science Center-Шривпорте по и в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных" (восьмое издание, Национальной академии наук, 2011 ).

1 Получение модифицированной трубки ПЭ-50

1. Держите 30 см длиной трубки ПЭ-50 выше газовой плитой руками, постепенно смягчить трубку. Осторожно потяните трубку.
2. Выберите точку на растянутой трубки с использованием цифрового суппорта (рисунок 1), пометьте его, и сократить измененный трубки ПЭ-50 в 25 см длиной сегмента в с длиной 1 см чаевых (внешний диаметр: 0.30-0.34 мм).

2 Получение гомологичных тромбов

1. Обезболить крысу с изофлураном (5% для индукции, 2-3% для технического обслуживания) в 70% N ₂ O и 30% O <суб> 2 на лицевой маски в донорстве. Подтвердите анестезией забой крайнем случае.
2. Выполнение бедренной артерии катетеризации донора крысы с опубликованным методом ⁴ и передавать бедренной артерии кровь непосредственно в 20 см длиной трубки ПЭ-50. Поместите пробирку в течение 2 ч при комнатной температуре для свертывания крови, а затем сохранить трубку в течение 22 ч при 4 ° С. Примечание: канюли осуществляется с помощью асептической техники, как описано на стадии 3.1. Донор крысы извлекают для дальнейшего отбора.
3. Отрежьте трубки ПЭ-50 в 50 сегментах мм и промойте сгусток из трубки в стерильную чашку Петри, содержащую физиологический раствор.
4. Трансфер 50 мм длинный сгусток в длинный 60 мм ПЭ-10 трубки и подключить каждый конец PE-10 трубки к длинной 20 см трубки ПЭ-50, подключенный к 1 мл шприц, содержащий физиологический раствор с 23 G иглы (Рисунок 2) .
5. Сдвиг тромб путем непрерывного переменного движения из одного шприца в другой в течение 5 мин, которые можно удалить из клеток кровисгусток и минимизировать хрупкий из внесосудистой свернувшейся сгустка, не нарушая при этом ядро ​​фибрина.
6. Обрежьте сгусток в 40 мм с длинной сегмента и передают сегмент сгустка в модифицированный ПЭ-50 катетера, как описано в шаге 1.2 в асептических условиях. Примечание: Все PE трубки стерилизуют с этиленоксидом.

3 Эмболические средней мозговой артерии окклюзии (3А, Б)

1. Стерилизацию всех хирургических инструментов в автоклаве (минимум 121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 мин). Sanitize таблицу хирургии и связанного хирургического оборудования, используя 70% этанола.
2. Обезболить крысу с изофлураном как описано в шаге 2.1. Проверьте глубину анестезии, выполняя ног щепотку на обоих задних ног, и любая наблюдается движение (снятия лапу) указывает, что животное не достаточно наркозом делать операцию. Нанесите небольшое количество ветеринарной мази на оба глаза, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. Бритье мех на брюшной шеи и головы реобласти как с электрическими ножницами, чтобы разоблачить участки кожи.
3. Поместите крысу в положении лежа на спине на грелку. Вставьте ректальный зонд, контроль и поддержание температуры тела между 36.5-37.5 ° С с использованием теплокровного блок управления одеяло.
4. Лечить бритая кожей и окружающей мех с 10% повидон-йода с последующим 70% этанола.
5. Сделайте 2-см длиной срединный разрез на шее под микроскопом рассекает. Используйте втягивающие выставить операционного поля и рассекают правая общая сонная артерия (CCA), наружной сонной артерии (ЭКА), внутренней сонной артерии (ВСА), и крыловидно артерии (PPA) бесплатно от окружающих нервов и фасции (рисунок 3А). Примечание: Перед операцией, изменить стерильные перчатки, если не помощник помогает подготовить животное.
6. Проанализируйте CCA бесплатно от окружающих нервов (без ущерба для блуждающего нерва) и поместите стерильный 5-0 шелковой нити под артерии. Свяжите узел промаха (# 1) и понять шов с помощью небольшого Hemosтат и тянуть учил к телу.
7. Проанализируйте ЭКА и свои две ветви, затылочная артерия (ОА) и верхняя щитовидная артерия (STA). Coagulate две ветви с помощью ветеринарного блока электрохирургической. Поместите две части стерильных 6-0 шелковыми швами под ЭКА.
8. Отдельные два шелка, помещенных под артерии, одна часть к голове (дистальный конец), а другой к телу. Свяжите плотный лигатуры (# 2) на стороне, самой близкой к голове, понять шелк с небольшими кровоостанавливающих и тянуть учил к голове. Подготовьте свободную узел (# 3) с другой шелка, чтобы использовать позже.
9. Рассеките ICA и PPA от окружающих нервов (без ущерба для блуждающего нерва). Свяжите PPA с 6-0 шва (# 4). Сделать скольжения узла с 6-0 шва вокруг ICA (# 5). Кроме того, клип ICA использованием микрососудистой клип.
10. Сокращение маленькое отверстие (1/2 через) в ЭКА между жесткой сыпучих (# 3) лигатур (# 2) и с Vannas стиле весенних ножницами. Вставьте модифицированный ПЭ-50-ваннаэ содержащий сгусток крови в разрез и заранее к бифуркации ОСА. Затянуть свободную лигатуры (# 3) вокруг просвета достаточно просто обеспечить сохранение мобильности трубки в-жилища.
11. Отрежьте ЭКА на месте небольшое отверстие, чтобы освободить пень и расположите пень ниже бифуркации ЭКА и ВСА; это позволит изменение трубка легко устанавливаться в ВСА. Открытие ICA и осторожно продвигать трубку из просвета ECA в ВСА, пока кончик катетера не достигнет происхождение MCA (~ 17 мм от бифуркации). Примечание: Перед вставить наконечник трубки в ECA, стерильной внешней поверхности трубки с 70% этанолом, а затем промывают стерильным физиологическим раствором.
12. Введите сгусток через модифицированного ПЭ-50 катетера вместе с 10 мкл физиологического раствора в течение 10 сек с помощью 100 мкл Hamilton шприц (фиг.3В).
13. Вывод катетера из ЭКА 5 мин позже. Свяжите ЭКА и открыть CCA. Шовный разрез на шее.

4 Мониторинг регионального мозгового кровотока (rCBF)

1. До окклюзии СМА, сделать длинный 1,2 см срединный разрез в коже головы, чтобы выставить кости черепа. Удалить тканей на кости черепа с зубной скребком и стерильным ватным свопов. Примечание: Перед операцией, поврежденная площадь кожи головы и окружающих мех дезинфицируют 10% повидон-йода с последующим 70% этанола.
2. Просверлите 1,5 мм Диаметр заусенцев отверстия расположены на 2 мм задней и 5 мм латеральнее брегмы используя сферическую заусенцев 0,7 мм из нержавеющей стали (рисунок 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите твердую мозговую оболочку в неприкосновенности.
3. Поместите зонд 0,5 мм над поверхностью твердой мозговой. Контролируйте rCBF в 0 (базового уровня), 5, 15, 30, 60, 90, и 120 мин после эмболизации и продолжить в 5, 15, 30, 45, и через 60 мин после внутривенного введения ТАП. После последнего измерения rCBF, волосистой части головы разрез закрывают швом. Примечание: Перед шеи разрез мы измеряем rCBF качестве базовых до MCA occlusионный. Сообщение MCA окклюзии мы измеряем rCBF после закрытия шва шеи разрез. Таким образом, шеи разрез сохраняется стерильным.

5 Послеоперационный уход

1. Введите 2,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание и привнести Buprenex (0,05 мг / кг, подкожно) сразу после операции и через каждые 6-12 часов при необходимости для облегчения боли.
2. Стоп ИФ анестезии. Поместите крысу в 37 ° C ветеринарная восстановления камеры (держать животных в тепле) и держать наблюдение. Это обычно занимает 10 минут для крыс, чтобы оправиться от наркоза. Затем положить животное в стерилизованную клетке, место некоторые смоченной еду в чашке Петри в клетке, и вернуть клетку к животным стерилизации комнате.
3. 24 ч после инсульта, эвтаназии крысу с передозировкой пентобарбитала натрия (100 мг / кг массы тела, IP).

6 неврологического дефицита Оценка

1. Выполните счет Бедерсон до и в 2 ч после эмболизации. Используйте классификации SСетевой 0-3, как описано выше ^5: 0, поднимая крысу хвостом, животное продления обе передние конечности на пол и не выставляется никаких других дефицитов (нормальное движение); 1, в результате чего крыса хвостом, согните контралатеральный переднюю конечность; 2, снижение устойчивости к боковому нажиму (и передних конечностей сгибания) без кружили; 3, то же поведение, класса 2 с кружили.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы не показывая Бедерсон балл = 0 (нет дефицита) в 2 часа после эмболизации исключены из дальнейшего исследования.

Результаты

Лазерной допплеровской флоуметрии (LDF) был использован для контроля rCBF при индукции ишемии головного мозга ^6,7. Многие лаборатории в том числе нашу лабораторию уже используют rCBF для идентификации животных с успешной окклюзии МСА, но пороги базового варьировать между лабораториям?...

Обсуждение

В этом исследовании мы показали стандартный метод для выполнения эмболической модель МСАО инсульта у крыс, в которой происхождение MCA окклюзии по фибрина богатых сгустка. Основным преимуществом данной модели является: окклюзия ствола СМА с фибрина богатых тромба похожа на тромбоэмбо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607