JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Аннотация

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

Введение

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms1–3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change4, the spread of invasive species5, and host-pathogen interactions6,7.

The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.

Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism8–10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus15–17. Diapause eggs are more desiccation resistant5,18 and contain more total lipids19 than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect22. In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.

This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause23, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. личинок Разведение двух А. albopictus Группы во взрослую жизнь

  1. Установите два Фотопериод шкафы с программируемым освещения на 21 ° C для оптимального выражения диапаузы 16 и примерно 80% относительной влажности.
    1. Программа один шкаф для 16L: 8D свет: темно цикл (без диапаузы вызывая LD фотопериод). Установите второй шкаф для 8L: 16D свет: темно цикл (диапаузы вынуждающего) 13.
    2. 'Огни на "программу в то же время в обоих шкафов для синхронизации циркадного времени между фотопериодов.
  2. Рассчитайте количество яиц, необходимых для проведения эксперимента. Стремитесь к 300-500 яиц в клетке. По крайней мере, трех повторных диапаузы клетки и трех повторных без диапаузы клетки необходимы для выработки РНК. Это составляет приблизительно до 1,800-3,000 яиц в эксперименте.
    1. Люк яйца путем погружения яиц бумаги в примерно 500 мл деионизированной H 2 O.
    2. Добавить прибл. 1 мл пищевой суспензия, состоящая из пищи земля собак и креветок, как описано выше 24. Обложка контейнер с сеткой, и держать сетку в месте с резинкой.
    3. Место в LD светового дня шкафу в течение примерно 24 часов.
  3. Передача вылупившихся личинок до 10 х 10 х 2 см чашки Петри, заполненные приблизительно 90 мл деионизированной H 2 O.
    1. Поддерживать около 30 личинок на блюдо. Трансфер личинок чистую посуду каждый 48-72 ч, например, каждый понедельник, среду и пятницу (MWF) 24.
    2. Поток около 1 мл пищевой суспензия, состоящая из пищи земля собак и креветок в деионизированной воде каждый MWF, как описано выше 24.
  4. Настройка 3:57 взрослых клеток для каждой обработки в течение светового дня, где каждый клетка содержит биологическую репликации.
    1. С противоположных сторон 9.5 л ведра, вырезать один 10-By-14 см отверстие, и другое отверстие диаметром 15 см. КомпанияVer первый с сеткой. Сокращение длины одной ноги ортопедического чулок, и приклейте один конец вокруг внутренней другое отверстие.
    2. Отрежьте конец ноги чулок выходные и узлов Шут - открыть только тогда, когда доступ внутрь клетки необходим. Для крышки клетки, вырезать все интерьере, оставив только обод, и заменить внутреннюю пластика с сеткой 24.
    3. Обратите внимание на фотопериод, повторить номер, клетки дату начала и другую информацию, относящуюся к эксперименту с перманентным маркером на стороне клетки.
  5. Линия нижней части взрослых клетках с влажной фильтровальной бумаге. Смочите фильтровальную бумагу с достаточно деионизированной H 2 O, чтобы увеличить местную влажность в клетке, но избежать стоячей воде, которые могут стимулировать яйцекладку на фильтровальной бумаге 24. Проверить фильтровальную бумагу в день в течение сушки, повторно мокрым, когда это необходимо.
  6. Для получения достаточных яйца РНК библиотеке, включают в себя, по меньшей мере 100 женщин / 9,5 л CaGE, с не более, чем 500 комаров в клетке.
  7. Сбор куколки МЧЗ и место в маленькой чашке чистой H 2 O при плотности не более 50 куколок на 25 мл H 2 O. Передача куколки чашку взрослого клетке. Место клеток в соответствующей светового дня кабинета - А. albopictus куколки светочувствительная 15.
  8. Убедитесь в день, что H 2 O в чашках чист и ясен, и удалить мертвые куколки, потому что наращивание мертвой куколки может привести к массовой гибели. Удалить H 2 O чашки после того как все куколки появляются.
  9. Поместите органических изюм на верхнем сетки клетку, чтобы обеспечить сахар для появившихся взрослых. Монитор изюм, и менять их каждые 3-5 дней для предотвращения накопления плесени.

2. Поддержание взрослых Разрешить спаривания и производства яиц

  1. Поддержание клеток при высокой влажности (прибл. 80%), выравнивая дно клетки с влажной фильтровальной бумагой, и обеспечивают доступ к не-плесенью изюма, как описано выше (SectiДополнения 1.5 и 1.9).

3. Кровь грудью

  1. Подготовка к крови кормовых женщин между 5:58 дней после вылупления, чтобы убедиться, что женщины были выставлены, по крайней мере восемь однозначных коротких дней, прежде чем яйцекладка начинается в течение почти 100 яиц% диапаузирующих 14.
  2. Подготовка системы кормления Hemotek мембраны. Подключите кормовых единиц на блок питания. Отрегулируйте температуру каждого блока до 37 ° С, используя регулировочный винт. Использование электронного термометра и зонда для измерения температуры блока питания во время калибровки.
  3. Подготовьте резервуар еды. Протяните квадрат коллаген подачи мембраны над отверстием резервуара еды и закрепите его с уплотнительным кольцом. Осторожно потяните углы, чтобы убрать морщины; обрезать лишний мембрану с ножницами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген мембрана не может хорошо работать для всех видов комаров, и это может быть необходимо попробовать несколько видов, чтобы найти оптимальное мембрану при работе скроме А. видов albopictus. Парафильмом хорошо работает с Комар обыкновенный.
    1. Если кровь хранили замороженной, оттепели при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа перед использованием.
    2. Держите резервуар так мембрана обращена вниз, без поддержки, и порты наполнении вверх. Использование передачи пипетки или шприца, чтобы заполнить резервуар с приблизительно 3 мл цельной крови от цыплят, который имеет цитрат натрия в качестве антикоагулянта. Печать отверстия для наполнения с пластиковыми заглушками.
  4. Прикрепите подготовленную резервуар для фидера, привинтив его шпильки на теплообменной пластины на нижней части питателя. Обратить подачи и поместите его на верхней части клетки, мембраны стороной вниз, так что комары могут питаться через сетку клетки. Держите устройство подачи на клетке в течение приблизительно 45 мин, чтобы максимизировать кормление.

4. Стимулировать откладки яиц

  1. Четыре-пять дней после еды в крови, оснастить каждую клетку с темного цвета 50 мл сдо выложены небеленой прорастания семян бумаги (бумаги яйцо) или текстурированной небеленый бумажным полотенцем и заполнить наполовину дистиллированной водой 9. Если более чем 250 комаров в клетке, используйте две чашки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для маленьких клетках или одного женского флаконах, "сено настой" в яйцекладки контейнеров может увеличиться откладки яиц из-за запаха микробной флоры 25.

5. Сбор и магазин Яйца

  1. Начать сбор яиц в течение 4-5 дней кормления крови, потому что производство яиц, как правило, пики примерно через пять дней после питания кровью, а затем спадает в течение следующей недели.
  2. Вары яйцо частоту сбора на предметы первой необходимости эксперимента. Для общих целей, собирать яйца документы по установленным расписанием MWF. Удалить из яиц документы из каждой клетки и замените свежим бумаги. Поместите недавно удаленные документы в чашках Петри и хранить в SD в течение светового дня шкафу, чтобы избежать смешанное воздействие хранения яиц.
  3. Разрешить яйцо документы повторно Основной влажными в течение 2 дней после яйцекладки, чтобы образование серозный кутикулы, которая повышает устойчивость яйцо усыхание 26.
  4. Примерно через 48 часов после сбора, сухие яйца на открытом воздухе. Высушите бумагу так, что она является мягким и слегка влажной на ощупь, но не настолько мокрой, что бумага темно от H 2 O или стимулирует вылупления яиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: "х 4" бумага 6,5 может занять около 3,5 ч для просушки. Будьте осторожны, чтобы не чрезмерно сухой яичный работ, так как это приведет в яичном высыхания 27.
  5. Резервные дополнительные яйца от обоих LD и SD фотопериодов для оценки заболеваемости диапауза и интерпретировать фотопериодическую эффект (см Измерение диапаузы, раздел 6).
  6. Для длительного хранения, держать яйца с докладами на 21 ° C и приблизительно 80% влажности в чашках Петри. Хранить чашки Петри в контейнер для хранения Tupperware с колбу воды для поддержания местной влажности, как эмбриональное развитие происходит 4:56 дней при 21 ° С.
ove_title "> 6. Измерьте диапаузы Заболеваемость

  1. Используйте дополнительные защищены эмбрионы (см Стимулировать откладки яиц, раздел 4), которые 7-20 дней для количественной оценки ответа диапауза.
  2. Запишите количество яиц, находящихся на каждое яйцо бумаги.
  3. Стимулировать яйца вылупиться, полностью погружая отдельные документы яйцо в чашку 90 мл Петри с приблизительно 80 мл деионизированной H 2 O. Добавьте примерно 0,25 мл пищевой кашицы.
  4. После 24 часов подсчитать количество вылупившихся первый личинок возрастной стадии. Поместите чашку Петри на черной поверхности, чтобы визуализировать личинок и поместить источник света на одной стороне тарелки. Личинки будут двигаться от источника света, что позволяет четкого подведения итогов индивидуального личинок. Удаление отдельных личинок с помощью пипетки, считая для предотвращения пересчета индивидуальный личинок.
  5. Место яйцо документы в новом чашку Петри и повторной сухой. Re-люк яйца после ~ 1 недели и снова подсчитать яйца вылупившихся используя данный метод.
  6. Место яйцо бумаги с оставшимся U н-вылупились яйца в новых 90 мл чашки Петри с приблизительно 80 мл отбеливающего раствора 28. Убедитесь, что яйцо документы полностью погружен в отбеливания решения и оставить под вытяжкой в ​​течение ночи, чтобы избежать запаха хлорки.
    Примечание: отбеливающий раствор может храниться в течение ~ 1 недели при 4 ° С, но в противном случае должны быть свежими.
  7. Проверьте яйца с помощью светового микроскопа в качестве отбеливания будет ясно хориона и позволяют визуализировать с эмбрионами, ООН-вылупился яйца. Если яйцо эмбрионов и, яйцо будет иметь совсем белый цвет с глазами появляются как два маленьких черных точек друг напротив друга на спинной стороне. Tally количество не-вылупились, яйцах с эмбрионами 13.
  8. Определить частоту диапауза по следующей формуле:% диапаузы = нет. эмбрионом ООН-вылупившиеся яйца / (нет. вылупившиеся яйца + нет. эмбрионом ООН штриховкой яиц) х 100 13.

7. Экстракция РНК из яиц / pharate личинок

ontent "> Примечание: Используйте Trizol в капюшоне ламинарного потока.

  1. Кисть комаров яйца, содержащие развивающихся эмбрионов или pharate личинок в различных точках времени разработки из яичного работ на стеклянные шлифовальных использованием верблюжьей шерсти. Измельчить яйца в TRIZOL (1 мл на 50-100 мг ткани) до полного измельчают. Используйте по крайней мере 400 яиц в библиотеку, чтобы дать достаточного количества РНК.
    1. Кроме того, оснастки заморозить яйца в жидком азоте и хранили при -80 ° С в микропробирок на срок до месяца перед помолом в TRIZOL.
  2. Выполните извлечение РНК в TRIZOL затем изопропанол осадков в соответствии с инструкциями изготовителя.
  3. Лечить скамейки раствором РНКазы дезактивации или других агентов, чтобы удалить любые остаточные нуклеазы, чтобы избежать деградации РНК.
    1. Лечить извлеченный РНК с ДНКазы. В соответствии с инструкциями производителя, инкубировать образцов РНК с ДНКазы в течение 30 мин при 37 ° С. Используйте 1 & #181; л ДНКазы на срок до 10 мкг РНК в реакции 50 мкл. Увеличение количества ДНКазы, если есть больше, чем 10 мкг РНК в одной реакции.
    2. Деактивированы ДНКазы путем добавления 5 мкл приостановлено ДНКазную инактивации реагента. Инкубируйте 5 минут при комнатной температуре, смешивая три раза в течение инкубационного периода (нежным вортексе).
    3. Центрифуга при 10000 х г в течение 1,5 мин. Передача супернатант, содержащий обработанные образцы РНК свежие пробирки для последующих стадий.
  4. Оценка качества общего образцов РНК флуорометрии. Отправить образцы к специальности объекта с соответствующим инструментом для решения этой задачи. Объект будет выполнять гель-электрофореза на-чипе для определения численности видов РНК в образце, визуализированных флуоресцентным красителем привили в чипе. Результаты будут возвращены как electropherogram.
    1. Определить целостность общего образцов РНК в присутствии или в отсутствие продуктов распада, о чем свидетельствует наличие OF пиков между 18 и 5S рибосомных РНК пики на полученной electropherogram (рис 1b).

8. РНК Секвенирование

  1. Отправить общие образцы РНК с достаточно высоким качеством (рис 1а) и количества (обычно> 3 мкг на библиотеку) к коммерческой секвенирования центра для строительства, обогащенных парно-концевых библиотеках мРНК и мРНК последовательности, следующих стандартных протоколов.
  2. Если более чем одна полоса используется для секвенирования одного эксперимента, разделить отдельные библиотеки в две полосы для секвенирования для учета технического различий между полосами во время секвенирования.

9. lllumina Почитать очистки

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлены биоинформатики часть этого протокола. Для получения полного списка всех программ и ресурсов, используемых в разделе биоинформатики этого протокола, обратитесь к таблице 1. ВКроме того, Справочная файла 1 содержит примеры командной строки для каждого из следующих шагов протокола биоинформатики.

  1. Используйте ssaha2 29 (таблица 1), чтобы определить матчи 95% идентичности или выше с базой данных NCBI Univec ядра (Таблица 1), А. albopictus рРНК (GenBank # L22060.1) и секвенирования адаптеры (примеры подробная командной строки, приведенные в Дополнительной файла 1). Удалить прочитанные пары с совпадений с использованием Perl или аналогичного инструмента сценариев, например, путем адаптации при условии Perl скрипт (Справочная файла 2).
  2. Удалите остатки читает с пакетом SolexaQA 30 (Таблица 1; Справочная файла 1): отделка области с PHRED оценка эквиваленте менее 20, используя настройки по умолчанию DynamicTrim.pl.
    1. Удалить читает меньше, чем 25 б.п. с LengthSort.pl на прямом и обратном читает одновременно. Оцените качество очищенных fastq файлов с FastQC (табл 1 ) - в частности, убедиться, что качество по-базовой последовательности и оценки в последовательности качества выше 20.

10. Цифровой Нормализация

  1. Выполните один раунд цифровой нормализации на очищенную читает с помощью инструмента кхмерской 31 (таблица 1; Справочная файла 1), в частности, normalize-by-median.py (с использованием размера K-мерный 20, покрытия отсечку 20 и Х = 1e10).
  2. Кроме того, если машина с высокой памяти доступно (сотни ГБ), используйте normalize_by_kmer_coverage.pl сценарий Троицы (таблица 1).

11. De Novo Транскриптом Ассамблея

  1. Получить доступ к компьютеру или компьютерной кластера с до 256 Гб оперативной памяти и 24 процессоров, в зависимости от размера сборки.
  2. Используйте Троицы 32 (таблице 1; Справочная файла 1), чтобы собрать цифровой нормализованное чтения набор в контигов. Для сниженияиспользование памяти, использовать --min_kmer_cov 2.

12. Ассамблея Оценка

  1. Запустите assemblathon_stats.pl из проекта Assemblathon2 33 на выходе арендуемая Троицы. Этот сценарий выполняет основные вычисления, относящиеся к оценке качества сборки, такие как количество лесов, N50, монтаж композиции и более (табл 1; Справочная файла 1).

13. Аннотация собранного Транскриптом

  1. Выполнение BLASTX (таблица 1) узла с набором ссылка белка; для комаров, дрозофилы, Anopheles gambiae, Комар обыкновенный, и Комар желтолихорадочный подходящие ссылки. В частности, формат файла FastA ссылка белка за взрыв, а затем BLASTX (Справочная файла 1).

14. Карта Читает Ассамблее Использование RSEM 34 (Таблица 1)

  1. Создайте файл 'стенограмма к генной карте », в которомПервый столбец содержит идентификаторы контрольного гена, а вторая колонка арендуемая IDS. В табличном редакторе, поменяйте местами первый и второй столбцы из вывода BLASTX, и писать эти колонки в файл .txt. Используйте программу LineBreak преобразовать разрывы строк в результате .txt файла в формате Unix.
  2. Создайте эталонный набор данных из файла FastA транскрипций, используя rsem-подготовить справочную сценарий, представленную в RSEM пакета (Справочная файла 1).
  3. Рассчитать значения выражения отдельно для каждой библиотеки, используя команду rsem просчитать-выражения, представленную в RSEM пакета (Справочная файла 1). Как гласит, использовать парные fastq файлов, полученный на стадии чтения очистки (этап 9.2).
    1. Если РНК из биологического репликации была разделена на две полосы для секвенирования, включают в себя как fastq файлов в расчете выражения для создания одного файла.
  4. Преобразование результатов выражение из каждой библиотеки к матрице легко обрабатывается другой рrograms с использованием предоставленного сценария rsem генерировать-DATA-матрицу, представленную в RSEM пакета (Справочная файла 1).

15. Дифференциальная Анализ экспрессии

  1. Установите R и обрезки (таблица 1).
  2. Используйте read.delim загрузить результаты RSEM, начиная с шага 14,3 (Справочная файла 1). При необходимости, округлить счетчики до ближайшего целого числа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: руководство обрезки рекомендует ограничить набор данных генов с достаточно высокой экспрессии обнаружить значение.
  3. Чтобы отформатировать данные для обрезки, формирования объекта DGEList из загруженного файла данных (Справочная файла 1). Затем, нормировать данные, используя ТММ нормализацию (Справочная файла 1). Оценить общие и tagwise дисперсии данных (Справочная файла 1).
  4. Определить дифференциально выраженные гены с Benjamini-Hochberg исправить значение р <0,05 (Справочная файла 1). Участок распределение лог-кратным-изменений по сравнению с обилием (Справочная файла 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Флуориметрии из двух репрезентативных образцов РНК показали две полосы примерно 2000 нуклеотидов (1А, В). 28S насекомых рибосомальной РНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, удерживаемых вместе водородными связями, которые легко разрушается при кратковременном нагревании и?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол представляет методы, чтобы обнаружить дифференциально выраженные гены из-за photoperiodically индуцированной диапаузы в А. albopictus. Протокол имеет важное значение в том, что она уникально сочетает в себе комаров воспитание и методы биоинформатики, чтобы сделать все экспериме?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was supported by the National Institutes of Health grant 5R21AI081041-02 and Georgetown University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Incubator - Model 818Thermo-Scientific3751120 V
Controlled environment roomThermax ScientificN/AWalk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulbPhilips3921834 W
Petri Dish 100 mm x 20 mmFisher08-772-E
Filter Paper 20.5 cmFisher09-803-6J
9.5 L BucketPlasticanBway Productshttp://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting WhiteJoann10173292http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockingsAlbahealth23650-040product no. 081420
Organic RaisinsNewman's OwnUPC: 884284040255
Oviposition cups (brown)Fisher Scientific03-007-52The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper TowelsSeventh Generation30BPT120
Modular Mates Square Tupperware SetTupperwarehttp://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass GrinderCorning Incorporated7727-2These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI ReagentSigma AldrichT9424Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-freeAmbion/Life TechnologiesAM1907This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZapAmbion/Life TechnologiesAM9782Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AAPlace up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane FeederHemotek 5W1This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and ProbeHemotek MT3KFUMicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium CitratePel-Freez Biologicals33130-1The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

Ссылки

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634(2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633(2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107(2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619(2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52(1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182(2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485(2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10(2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

93De Novo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены