Манипулируя мышиной слезной железы

Резюме

Слезной железы (LG) представляет собой ветвящийся орган, который производит водные компоненты слез, необходимых для поддержания зрение и глазное здоровье. Здесь мы опишем мышиный LG рассечение и Экс естественных методов культуры расшифровать путей, вовлеченных в развитие LG сигнализации.

Аннотация

Слезной железы (LG) выделяет водные слезы, необходимые для поддержания структуры и функции роговицы, прозрачного ткани необходим для зрения. В человеке один LG находится в орбите над боковой конце каждого глаза доставки слезы на поверхности глаза через 3 - 5 каналов. Мышь имеет три пары основных глазных желез, наиболее изученным из которых является exorbital слезной железы (LG) расположен передний и вентральный к уху. Как и в других железистых органов, LG развивается через процесс эпителиального морфогенеза ветвления, в которой один эпителиальных почка в пределах уплотненной мезенхимы претерпевает несколько раундов зародыше и формирования канала, чтобы сформировать сложную взаимосвязанную сеть секреторной ацинусов и протоков. Это сложный процесс, были хорошо документированы во многих других эпителиальных органов, таких как поджелудочная железа и слюнной железы. Тем не менее, LG была гораздо менее изучены и механизмы, контролирующие морфогенез плохо подстоял. Мы подозреваем, что это недостаточная представленность в качестве модельной системы является следствием трудностей, связанных с поиском, рассекая и культивирование LG. Таким образом, здесь мы опишем методы рассечение для уборки эмбрионального и послеродового LG и методы для экс естественных культуры ткани.

Введение

Слезной железы (LG) отвечает за водный секреции слезной критической для остроты зрения и здоровья, обслуживания и защиты клеток глазной поверхности. LG дисфункция приводит к одной из самых распространенных и изнурительных заболеваний глаз: болезни водный дефицит сухого глаза, который характеризуется раздражения глаз, чувствительность к свету и снижение зрения ^1. В человеке LG находится в орбите выше боковой концу глаза, где 3 - 5 выводные протоки депозитные слезы на поверхности глаза. Мышь имеет три пары основных глазных желез, наиболее изученным из которых является слезной железы (LG) расположен передний и вентральный к уху (exorbital) со слезами, направляющимся в глаза через один выводной проток. Как и в других железистых органов, LG развивается через процесс эпителиального морфогенеза ветвления, в которой один эпителиальных почка в пределах уплотненной мезенхимы претерпевает несколько раундов зародыше и образование воздуховода длям сложную взаимосвязанную сеть секреторной ацинусов и протоков (рис 1) ^2. В процессе разработки эпителий становится васкуляризации, а также в большой степени иннервируют парасимпатических нервов крылонебной ганглия и в меньшей степени по симпатических нервов от верхнего шейного ганглия ^3. Взаимодействия между каждой из этих ячеек типа т.е. нервных, эпителиальных, эндотелиальных и мезенхимальных клеток, имеют важное значение для функционирования и поддержания взрослой ткани. Тем не менее, лежащие в основе молекулярные механизмы, координирующие развитие LG и регенерации, а также, как тип межсотовые связи направляет эти процессы, остается неясным.

Появление эмбриональных Экс естественных методов культивирования позволило выявить развития и регенеративных путей в нескольких ветвящихся органов ^4. Культивирование экс естественных дает исследователю возможность манипулировать орган (меняническое, генетическая или химического) при определенных условиях, а также для характеристики развития органов и межклеточных взаимодействий в реальном масштабе времени. Exorbital LG мыши является наиболее подходящей для этой техники и недавние исследования определяется систем, которые регулируют его развитие ^2,5 сигнализации. Однако, несмотря на необходимость, чтобы понять молекулярные сигналы, лежащие в основе развития LG и регенерации, в настоящее время он остается недостаточно изученной, скорее всего, из-за технических трудностей в изоляции орган. В этой статье мы расскажем, как изолировать и выполнять Экс естественных культуру эмбриональных мышиных LG определить программ развития.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все для животных Работа выполнена в рамках строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных Институтов Здоровья. Протокол был одобрен уходу и использованию комитета за животными (IACUC) из Университета Калифорнии, Сан-Франциско.

1. мышиных эмбриональных слезных желез (LG): Сбор и микродиссекция

1. После процедуры одобрены Институциональные животных в комитете Научно-исследовательский этики, усыпить приурочен беременных CD-1 (или трансгенных) самок с ростом CO ₂ ингаляции с последующим подтверждением смещением шейных позвонков к эмбрионов урожая на соответствующем эмбрионального дня. Назначить день вагинального e0 открытия плагина.
   Примечание: слезных желез (LGS) могут быть собраны из E14 один бутон этапе и далее. Тем не менее, E16 (5 - 10 бутонов) эмбрионы дать наиболее достоверные результаты для экс естественных культуры.
2. Стерилизовать стЕНТРАЛЬНАЯ стороне мыши с помощью 70% этанола. Зажмите кожу и сделать надрез на средней линии с стерильных хирургических ножниц; прорезать кожу и брюшины, чтобы разоблачить брюшной полости. Удалите 2 рога матки путем разрезания вдоль mesometrium в верхней части каждого рога матки и место в холодном PBS (фосфатно-солевой буфер) или DMEM F12 среде с добавлением 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
3. Использование щипцов (# 5), удалить эмбрионов из амниотической мешочков и помещают во вторую стерильную чашку Петри, содержащую холодный PBS. Будьте осторожны, чтобы не коснуться глаза или голова область.
4. Поместите эмбрион на вскрытии микроскопом с просвечивания основания. Если эмбрион шаги 1,5 - 1,7. Если эмбрионы> e17, эти шаги могут быть полезны, но не являются существенными, поэтому перейдите к шагу 1.8.
5. Отрежьте голову от туловища чуть ниже нижней челюсти (шаг 1, рисунок 2) USINга стерильный скальпель (# 10 лезвие). Поверните голову так, чтобы нижняя челюсть находится сейчас на вскрытии пластины. Используйте пинцет, чтобы стабилизировать голову и скальпель для удаления около ¼ спинной стороне мозга (шаг 2, ^1-й вырезом, Рисунок 2) - это особенно важно когда хрящ застывает вокруг e15.
6. Расположите головку так, что скальпель может проколоть нос между глазами. Сделайте надрез через центр головы, так что глаза сейчас на отдельных половинок (шаг 2, 2 нарезанных ^й, Рисунок 2).
7. Использование двух # 5 щипцы, взять одну половину головы и удалить лишнюю ткань (см шаг 3, рисунок 2). Будьте уверены, чтобы ориентировать голову так, LG (расположен в нижней задней углу глаза) не теряется в этом процессе удаления. Удалите излишки мозговой, хрящи и носовые ткани, окружающие и ниже глаз. Поскольку железы едва виден в этот момент, обеспечить глаз в правильной ориентации после удаления избытка ткани то не потерять расположение LG.
8. Осторожно захватить кожу от задней, нижней угла глаза с обеих щипцов. Снимите кожу, осторожно потянув открыт с пинцетом, чтобы разоблачить LG. Используйте дополнительное освещение выше и ниже ткани, чтобы помочь визуализировать LG.
   Примечание: LG, выделялся своей внешностью, как бутон на воздуховод в более темный, уплотненной мезенхимы, должны быть видны в этой точке.
9. Осторожно начинают рассекать LG и связанного мезенхиму (см диаграмму и изображения) от окружающих тканей с помощью щипцов, стараясь не захватить LG или связанный с ним канал. После железа от окружающей ткани свободно, осторожно удалить всю железу путем захвата эпителий, окружающие глаз у основания канала LG. Позаботьтесь, чтобы сохранить мезенхиму окружающий эпителий, который можно наблюдать в виде уплотненной мезенхимы в которых эпителий инвагинирует.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые дополнительные удаление Tissuе (любые мелкие фрагменты костей, мышц и соединительной ткани) может быть необходимо, чтобы избежать сигнализации факторы / роста из соседних тканей.
10. Для культуры, урожай 4 - 5 желез и связанный мезенхимы за тарелку (ОМС высевают сразу же после вскрытия); собрать минимум 14 желез на 100 мкл буфера для лизиса РНК для ОТ-ПЦР ^6.

2. Подготовьте Тарелки для Ex Vivo культуры

Эта процедура основана на том, что используются для развивающегося слюнной железы ^7,8.

1. Добавить 200 мкл DMEM F12, дополненной (100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) культуральной среде с 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты и 50 мкг / мл трансферрина голо-к прозрачным дном диаметром 50 мм микролуночным блюдо ^7.
   Примечание: DMEM F12 был выбран, как мы ранее обнаружили, что он максимально морфогенез в эмбриональном слюнной железы.
2. Поплавок 13 мм polycarbOnate мембранный фильтр с порами 0,1 мкм на верхней части массовой информации.
3. Дополнительный этап Развести 3-D Ламинин 1: 1 с DMEM / F12, чтобы получить конечную концентрацию 3 мг / мл (использовать 200 мкл пипетки осторожно перемешать; центрифуги в течение 1 мин, если появляются пузырьки). Добавить 15 мкл этого разбавляют 3-D ламинином фильтровать.
   Примечание: Это разбавление было установлено, что оптимальным для поддержания LG в своем 3D состоянии без ущерба эпителиальных разветвление. Тем не менее, это не является необходимым для культуры LG.
4. Поместите 4 - 5 LG на фильтре или в ламинином. Культура ОМС экс естественных для 24 - 48 часов (рисунок 3) или исправить с 4% PFA в течение 20 мин для дальнейшего анализа по кПЦР или иммуноокрашивания (рисунок 4). Для КПЦР анализа эмбрионального железистой ткани, пожалуйста, обратитесь к Rebustini др., 2011. Для иммунофлуоресцентным анализа эмбриональных железистой ткани, пожалуйста, обратитесь к следующим цитатам: Хоффман и др, (2002) и Steinberg е.т др., (2005).

3. Мышь Послеродовая и взрослых слезных желез (LG): Вскрытие

1. Усыпить послеродовой мышь в соответствии со стандартами соответствующий комитет по этике животного. Для послеродовых щенков день 8 или более молодых, усыпить путем разделения на голову стерильными ножницами. Для послеродового день 8 лет и старше, спрей мех с 70% этанола.
2. Чтобы найти LG, лежал мыши боковой стороне под микроскопом рассекает с подсветкой сверху. Примечание: послеродовой и взрослых LG окаймлены сонной артерии, жевательные мышцы и дермы (рисунок 5).
3. Использование малых ножницы рассечение, делают небольшой разрез в эпидермисе, где в боковом направлении от LG должны быть расположены.
4. Использование щипцов, выдвиньте эпидермис к уху, чтобы разоблачить LG.
5. Используйте пинцет, чтобы аккуратно ослабьте LG от окружающей ткани.
6. После того, как LG освобождается от окружающих тканей, осторожно удалите LG по воздуховоду,взявшись где воздуховод и эпителий, окружающий глаз подключения (рисунок 1).
7. Поместите ЛГС в буфере для лизиса РНК для ОТ-ПЦР, или закрепить с 4% PFA в течение 20 мин для иммунным окрашиванием.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

LG разрабатывает в процессе эпителиального морфогенеза ветвления. Светлое образы эмбриональных МСУ расчлененный на e14, e15, e16, e17, и Р2 иллюстрируют это событие.

Рисунок 1. LG разрабаты...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Универсальность культуры и манипулировать LG экс естественных обеспечивает значительные преимущества для изучения его развитие. Это включает в себя скорость, с которой исследователь способен проверять гипотезы и множество возмущений, которые могут быть выполнены, чтобы оценить,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 without HEPES	SH3027101	Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin	P0781	Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum	A9576	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution	15710	Electron Microscopy Sciences	Diluted to 4% in 1x PBS
Phosphate Buffered Saline 10x	BP665-1	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1x			Prepared from 10x stock
holo-Transferrin bovine	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
L-ascorbic acid (Vitamin C)	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes	130182	Thermo Scientific	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator	Stemi 2000	Carl Zeiss	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes	353001	Corning	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm uncoated glass bottom dishes	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope	TCS SP5	Leica Microsystems	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm)	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm)	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	Ideal for harvesting glands from embryos.
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.	4-30	Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice		Charles River Labs	Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm	110405	Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	Optional mice for learning how to locate the LG.