Приобретение высококачественного цифрового видео из<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и взрослые особи поведения от боковой перспективе

Резюме

Здесь мы опишем простой и широко доступного технику микроскопии на приобретение высококачественного цифрового видео Drosophila взрослого и личинок мутантных фенотипов с боковой перспективе.

Аннотация

Дрозофилы является мощным экспериментальная модель системы для изучения функции нервной системы. Генные мутации, которые вызывают дисфункцию нервной системы часто производят жизнеспособный личинок и взрослых, которые имеют передвижения, дефектные фенотипы, которые трудно адекватно описать с текстом или полностью представляют с одной фотографического изображения. Текущие режимы научных публикаций, однако, поддерживает представление цифрового видео СМИ как дополнительного материала, чтобы сопровождать рукопись. Здесь мы опишем простой и широко доступного технику микроскопии для получения высококачественного цифрового видео как дрозофилы личинок и взрослых фенотипов с боковой перспективе. Видео из личинок и взрослых передвижения от побочного зрения выгодно, потому что это позволяет наблюдать и анализировать тонких различий и вариаций в аберрантных поведения локомотивных. Мы успешно использовали технику для визуализации и количественной aberranт ползет поведения в третий личинок возрастной стадии, в дополнение к взрослым мутантных фенотипов и поведения в том числе ухода.

Введение

Общая плодовой мушки дрозофилы является мощным экспериментальная модель системы для изучения функции нервной системы ^1-3. Эволюционная сохранение структуры и функции нервной системы с человека, а также простота генетических манипуляций и огромный массив генетических инструментов делает Drosophila премьерный организм для моделирования человеческого нейродегенеративных заболеваний ^4. Генные мутации, вызывающие дисфункции нервной системы часто приводит к жизнеспособным мутант личинок и взрослых дрозофилы с нарушением двигательной. Фенотипы наблюдаемые в нервной системы дефектных мутантов включают снижение темпов передвижения, аномальным координации и спастических движений у взрослых, а также дефицит в перистальтического сокращения стене мускулатуры и частичный паралич личинок. Эти фенотипы были использованы в разработке высокопроизводительных генетических экранов и опорно-двигательного анализов мутантных личинок ⁵, 6 и ^7-10 взрослых дрозофилы направлена ​​на количественное определение нарушения локомоции и идентификации генов, необходимых для функции нервной системы. В то время как эти подходы являются чрезвычайно полезными для количественного личинок и взрослых локомотивных поведения, они не в состоянии передать качественную информацию о каждом конкретном девиантным поведением. Например, в то время как мутант третьего личинки возрастной стадии могут проявлять измененных параметров передвижения, в поведенческой анализа, это может быть непонятно, является ли это результатом изменений в художественной перистальтических сокращений в течение цикла ползать, общее отсутствие координации, или частичным параличом задней тела стена мускулатура. Здесь мы опишем простой и широко доступного технику микроскопии для получения высококачественного цифрового видео Drosophila взрослого и личинок фенотипов локомотивных от боковой перспективе. Цифровое видео приобрела у боковой перспективе позволяет прямое наблюдение и анализ тонких различий в Локомотиве поведения от более информативное ориентации бокового обзора.

протокол

1 Стерео микроскоп Система

Примечание: Хотя этот протокол легко адаптируется практически к любой стерео микроскопа системе, связанной с цифровой камеры с возможностью приобретения видео, информация представлена ​​на системы, используемой в нашей лаборатории (Таблица материалов / оборудования).

1. Приобретать цифрового видео с использованием тринокулярный стерео микроскоп, соединенный с коммерческой цифровой камеры.
2. Для того, чтобы пара коммерческую цифровую камеру тринокулярной порту стереомикроскопом, удалить ½x C-Mount из фотоэлемента порту стереомикроскопом и заменить его на 1X C-Mount.
3. Установите цифровой камеры соединитель (43 мм резьба) к 1X C-Mount.
4. Mount две понижающие кольца, 58 мм до 48 мм, и 48 мм до 43 мм, в камеру соединителя сделать мост между цифровыми камерами муфты к переходником объектив для цифровой камеры.
5. Установите цифровую камеру к комплекту адаптера объектива.
6. Приобретать видео с увеличением микроскопа и оптического зума цифровой набор камеры для комбинированной увеличении примерно 12X (30 кадров в сек, 640 х 480 пикселей). Примечание: увеличение из стереомикроскопа должны быть компенсированы в соответствии с вновь преобразованного 1X C-Mount от тринокулярной порта.

2 изображений Drosophila третьего возраста личинки

1. Лента маркером в черный стадии пластины стереомикроскопом соединен с цифровой камеры так, чтобы сторона маркера крышки занимает примерно ⅓ до ¼ вертикальной поле зрения наблюдается в ЖК-мониторе камеры. С помощью маркера вершины, как на стадии личинок, чтобы выполнить изображений, потому что они приходят в ассортименте цветов, которые могут быть использованы для цветового кода и дифференциации генотипов личинок изображаемого.
2. Демаркацию поле зрения наблюдается в цифровом ЖК-мониторе камеры на поверхности маркера сверху с тонкой точкемаркер.
3. Выберите третьего возраста личинки к изображению. Критерии для выбора третьего личинок Instar был Длина тела, появление от источника питания во время личиночной фазе жизненного цикла, наличием переднего и заднего дыхальца, и структура нижнечелюстных крючков аппарата рта ^11. Убедитесь, личинка чист путем промывания его большим количеством воды.
4. Освещать постоянный этап маркер верхнюю сверху света от системы волоконно-оптической освещения. Отрегулируйте угол падающего света, чтобы обеспечить оптимальное освещение.
5. Фокус микроскоп на краю постоянного маркера сверху. Начните приобретения цифрового видео.
6. Поместите личинку на стороне маркера крышкой примерно 75 ° от вертикальной оси, в ​​непосредственной близости от поля зрения, с передней части личинки, обращенной к полю зрения (Рисунок 1). Примечание: Размещение личинки на стороне маркера крышки позволяет камере записывать движения гоэлектронной личинка с боковой перспективе. Это помогает держать личинку влажной водой, чтобы они не падают на сторону маркера крышкой. Необходимо проявлять осторожность, однако, чтобы не использовать слишком много воды, как чрезмерное количество будет придерживаться личинки, как это ползает по полю.
7. Аккуратно нащупывать и личинку с небольшим кисти, чтобы принудить его ползать по полю зрения. Будьте терпеливы, как личинки редко сотрудничают и часто должны быть возвращены в исходную точку много раз, прежде чем они ползают прямо по полю.
8. Запись примерно 10-15 мин непрерывной цифровой видеозаписи и культуры и удалить все ненужные кадры после приобретения с цифровым программным обеспечением для редактирования видео.

3 изображений для взрослых Drosophila

1. Поместите одного взрослого Drosophila в одноразовом 1,5 мл спектроскопического полистирола кювете.
   Примечание: CO ₂ обезболивание взрослого дрозофилы непосредственно перед BehavПротокол ioral анализ может поставить под угрозу результаты ^12. Рекомендуется взрослых Drosophila быть предоставлен период 24-часовом, чтобы оправиться от CO ₂ обезболивания перед выполнением в поведенческой тесте ^13.
2. Вставьте конец кюветы с небольшим ватным тампоном. Убедитесь, ватный тампон упакован достаточно плотно, чтобы занять большую крышку пространство и ограничивает муху с уменьшением объема отсека кюветы.
3. Поместите кювету на белом стадии пластины стереомикроскопом и правильно выровнять снижение громкости отсек кюветы с полем зрения наблюдается в цифровом ЖК-мониторе камеры.
4. Illuminate кювету сверху света от системы волоконно-оптического освещения. Отрегулируйте угол падающего света, чтобы обеспечить оптимальное освещение.
5. Фокус микроскопа и начать получать цифровые видео.
6. Запись примерно 30-45 мин непрерывной цифровой видеозаписи и культуры и удалить все лишнеекадры после приобретения с цифровым программным обеспечением для редактирования видео.

Результаты

Мы успешно использовали эту технику, чтобы приобретать и количественной оценки личинок поведенческий фенотип, связанный с потерей функции гена stathmin (рисунок 2) ^14. Ген stathmin кодирует микротрубочек регуляторный белок, которая разделяет димеров тубулина из пулов р...

Обсуждение

Сила Дрозофилы 'ы в качестве модельной системы для изучения функции нервной системы значительной мере обусловлено сходимости мощных генетических инструментов доступных и широкого круга надежных поведенческих анализов развитой. Здесь мы представляем простой и широко доступн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trinocular Stereozoom Microscope	Olympus Corporation	SZ6145TR	½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount
1X C-mount	Leeds Precision Instruments	LSZ-1XCMT2
Digital Camera Coupler (43 mm thread)	Qioptiq Imaging Solutions	25-70-10-02
58 mm to 48 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR5848
48 mm to 43 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR4843
Lensmate Adapter Kit for Canon G10	LensMateOnline.com
Canon PowerShot G10 Digital Camera	Canon U.S.A., Inc.
1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette	Denville Scientific	U8650-4