JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Аннотация

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему ведущей причиной смертности в мире сегодня, и уровень смертности остается практически неизменным в течение последних двух десятилетий (Американская ассоциация сердца). Существует острая необходимость в разработке новых терапевтических стратегий для эффективного предотвращения или обратить вспять сердечной недостаточности. Одним из перспективных стратегия клеточной терапии после бурного развития биологии стволовых клеток 1. В связи с этим, мультипотентных ЦЧП может быть отличным источником клеток для лечения из-за их способности к пролиферации, но совершено только клонов дифференциации сердечной. Таким образом, эффективный и надежный метод генерации и изолировать цены за клик имеет большое значение для исследований сердца клеточной терапии.

Этот протокол фокусируется на эмбриональных цены за клик, выявленных в ходе раннего эмбриогенеза и как их поколение из ЭСК. Различные ЦЧП были выделены из эмбриональных и взрослых сердец, даже из костного мозга 2. Во время развития эмбриона, кости morphogeмагнитные белки (BMPs), бескрылые типа члены семьи интеграции MMTV сайт (WNTs) и узловых сигналы вызывают приверженность Mesp1 + мультипотентной мезодермы 3. Mesp1 + клетки затем дифференцируются в эмбриональные цены за клик 4. Эти цены за клик, как правило, отмечается HCN4, NK2 гомеобокс 5 (Nkx2-5), Isl LIM гомеобокс 1 (Isl1), T-бокс 5 (Tbx5), и миоцитов фактором усилитель 2C (Mef2c), образуют поля первичного и вторичного сердце, и способствовать основных частей сердца во время кардиогенеза 5-10. Цены за клик Как Nkx2-5 + и Isl1 + / MEF2C + способны дифференцироваться в кардиомиоциты, гладкие мышечные клетки (ГМК) и эндотелиальные клетки 5-8. Таким образом, эти ЦЧП будет приводить к сердечной сосудистой, а также сердечных тканей и идеальным источником клеток для клеточной основе сердечной терапии. Следовательно, создавая цены за клик в пробирке был крупным научным внимание при сердечно-сосудистых исследований. С ЭСК имеют неограниченное расширение емкости ай представляют ICM клетки на стадии бластоцисты, дифференциация ЭСК в эмбриональные цены за клик по естественному эмбриогенеза считается логичным и эффективным подходом для получения цены за клик.

Одним из широко используемым подходом для получения цены за клик от ЭСК является агрегирование ЭСК в ЭТ 11. Для повышения эффективности дифференциации, определенные химические и факторы роста, основанные на знании развития сердца были использованы 12-14. Тем не менее, нет никаких категорических КПК маркеры, в частности, нет клеточной поверхности маркеры, которые широко принятые в этой области. Чтобы решить эту проблему, ЭСК разработаны, чтобы отметить цены за клик Isl1 + или MEF2C + и их производные флуоресцентных журналистами, используя Cre системы / LoxP. CRE рекомбиназы постучал в под контролем Isl1 / Mef2c промотор / энхансер. Модифицированный люминесцентные RFP белок или ген YFP обусловлен конститутивного промотора может быть активирован удаления Flox стоп-кодона с CRE рекомбиназой(Isl1: CRE; pCAG-Flox-СТОП-Flox-GFP или RFP / Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; Rosa26YFP) 5,6. После того, как ЭСК дифференцируются во вторые СРС сердце на местах, Isl1 / Mef2c промотор / энхансер приводом CRE активирует флуоресцентные журналистам и цены за клик может быть обогащен FACS-очистки. Вкратце, метод агрегирования EB используется для инициирования ESC дифференциации. Для повышения эффективности дифференцировки, дифференцированные клетки обрабатывают аскорбиновой кислоты (АК) и факторов роста, таких как Bmp4, активин А и Vegf 13,15. Этот протокол позволяет надежный и эффективный дифференциации CPC, используя и мышь и ЭСК человека.

протокол

1. Вывод мышиных эмбриональных цены за клик от мыши ЭСК

  1. Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) фидерного слоя.
    1. Теплый MEF среды (10% FBS в DMEM) до 37 ° С.
    2. Подготовка желатиновых пластинок, покрытых.
      1. Добавить 1 мл 0,1% желатина в воде в лунку 6-луночного планшета или 5 мл в 10 см чашку.
      2. Оставьте пластин или блюда при 37 ° С или при комнатной температуре в течение по крайней мере 30 мин. Стремитесь желатин перед использованием.
    3. Оттепели облучают MEFs быстро в водяной бане при 37 ° C, при осторожном встряхивании.
    4. Передача клетки осторожно к 15 мл или 50 мл коническую трубку. Добавить 5 мл подогретого MEF среды. Вихревой клетки медленно и центрифуге при 200 х г в течение 5 мин.
    5. Ресуспендируют клеток в MEF среды и считать жизнеспособных клеток. Используйте следующие объемы MEF среды: 2 мл для клеток на лунку от 6-луночного планшета и 10 мл для клеток от 10 см блюдо.
    6. Пластина клеток в 6-луночных планшетах или 10 см блюда в 1-2х 10 6 на чашку / блюдо.
    7. Инкубируйте MEF пластин / блюда при температуре 37 ° C, 5% CO 2 по крайней мере, 24 часа в сутки до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отменить MEF пластин / блюда старше недели.
  2. Подготовка ЭСК мыши
    1. Культура Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; Rosa26YFP мыши ЭСК на MEFs до 90% сливной. Используйте ES клеточная среда состоит из 410 мл DMEM, 75 мл FBS, 0,1 мМ MEM NEAA 2 мм L-глутамина, 0,1 мМ пирувата, 100 U Pen / Strep и 0,1 мм β-меркаптоэтанола.
    2. Подготовьте желатин покрытием 6-луночных планшетах, как описано в 1.1.2.
    3. Отберите среду из пластин и промыть клетки с DPBS.
      1. Аспирируйте DPBS и добавить 0,4 мл 0,25% трипсина в одну лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 5 мин. Добавить 1 мл подогретого ES среднего прекратить реакцию трипсина.
    4. Урожай клетки и центрифуги клетки при 200 мкг в и аспирации среды. Ресуспендируют клеток в 1 мл ES клеточной среде и считать клетки.
    5. Пластинчатые ЭСК на желатиновых пластинок, покрытых при плотности 3 х 10 4 / см 2. Выдержите при 37 ° С, 5% СО 2 в течение примерно 2 дней, когда ЭСК составит около 90% вырожденная. Изменение средней каждый день.
    6. Когда ЭСК являются 90% сливной, повторите шаги 1.2.2-1.2.5, чтобы полностью удалить MEF питатели.
  3. Вызвать CPC дифференциация по образованию EB
    1. Подготовка дифференциации среды, как следует: 36 мл IMDM, 12 мл F12 Хэма, 2 мМ L-глутамина, 0,34 мл БСА (7,5%), 0,25 мл N 2, 0,5 мл В27, 50 мкг / мл А.А., 0,45 мМ 1-тиоглицерин.
    2. Отберите среду из клеток и промыть DPBS. Аспирируйте DPBS и добавить 0,4 мл 0,25% трипсина в одну лунку 6-луночного планшета. Инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
    3. Добавить 1 мл дифференциации среду прекратить реакции и пипетки вверх и вниз, чтобы разогнать клетки кластеров в одиночных камерах.
    4. Центрифуга ЭСК в 200 мкг в течение 5 мин и отбросить среды.
      1. Ресуспендируют 1 х 10 6 </ SUP> ЭСК в 1 мл дифференциации среды. Количество клеток, культуры клеток в цене отрыва чашки Петри в концентрации 1 × 10 5 клеток / мл в среде для дифференцировки при 37 ° С в течение первых агрегации EB.
    5. Через два дня после формирования EB, трансфер ЭТ из блюд 50 мл пробирки. Спина в 200 мкг в течение 1 мин. Удалить среду и промыть ЭТ с 10 мл DPBS без Са 2+ и Mg 2+.
    6. Отберите DPBS и добавить 1 мл 0,25% трипсина. Инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин. Добавить 4,5 мл дифференциации среды, чтобы остановить реакцию. Внесите вверх и вниз, чтобы отделить ЭТ в одиночных камерах.
    7. Центрифуга клетки при 200 х г в течение 5 мин. Вытяжку средних и ресуспендирования клеток в 1 мл дифференциации среды.
    8. Граф клеток и разбавить 2 х 10 6 клеток в 1 х 10 5 клеток / мл в среде для дифференцировки среды. Добавить VEGF, BMP4 и активин А в среду в конечной концентрации 5 нг / мл, 0,8 нг / мл, и 5 нг / мл, соответственно. CultuRe клеток в чашки Петри для формирования второго EB при 37 ° С.
    9. 40 ч после второго образования EB, трансфер ЭТ в 50 мл пробирки. Промыть DPBS один раз, диссоциируют ЭТ 1 мл 0,25% трипсина при 37 ° С в течение 5 мин. Внесите вверх и вниз, чтобы отделить ЭТ в одиночных камерах.
    10. Ресуспендируют клеток в Stempro-34 среды с 5 нг / мл VEGF, 10 нг / мл bFGF и 12,5 нг / мл FGF10. Пластина клеток в 2 х 10 5 / см 2 в покрытые желатином пластин. Культура в 37 ° C инкубаторе в течение примерно 32 ч перед выделением КПК.
  4. Изолировать mCPCs
    1. Отберите средних и промыть DPBS. Добавить 0,5 мл 0,25% трипсина в культуральные планшеты при 37 ° С в течение 5 мин. Добавить 4,5 мл дифференциации среды, чтобы остановить реакцию. Внесите вверх и вниз, чтобы отделить ЭТ в одиночных камерах. Сбор клеток путем центрифугирования и ресуспендирования клеток в 2% FBS / PBS для FACS-очистки.
    2. Запустите недифференцированные ЭСК на сортировщик отрицательного контроля. Изменение напряжения для регулировки вперед копротер (FSC) и боковое рассеивание (SSC), чтобы выбрать нужный населения. Используйте рассеяния вперед по сравнению с боковой разброс и вперед высоте рассеяния по сравнению с шириной, чтобы исключить мусор и камзол. В выбранной подгруппы населения, в соответствии с распределением контроля ESC, рисовать ворота YFP положительный на гистограмме, чтобы устранить клеток аутофлуоресценцию. Сбор YFP + цены за клик от YFP + гейт.
    3. Пластина очищенные цены за клик (YFP + клетки) в 6-луночных планшетах с дифференцированием среды (1.3.1). Культура дополнительные 3-5 дней при 37 ° С в течение дифференциации цены за клик в кардиомиоциты и ГМК.

2. Вывод человеческих эмбриональных цены за клик от ЭСК человека

  1. Подготовка Кормушки
    1. Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) фидерного слоя, как описано выше, при плотности 2 х 10 4 / см 2.
  2. Поддержание ЭСК человека
    1. Поддержание человека Isl1: CRE; pCAG-Flox-СТОП-Flox-GFP или RFP ЭСК обычно на МEF с помощью регулярного чЭСК среды (нокаут DMEM / F-12 385 мл, Нокаут SR 100 мл, 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ NEAA, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 10 нг / мл основного ФРФ). До остановки дифференциации, передачи ЭСК человека в фидерной свободном состоянии, по крайней мере, 2 проходов.
  3. Подготовка ЭСК человека в фидерной свободном состоянии
    1. Подготовка покрытием пластины для ЭСК человека культуры.
      1. Оттепель Матригель при 4 ° С в течение ночи. Поместите 50 мл пробирку на льду и добавляют 30 мл холодной DMEM / F12 среды в трубе.
      2. Добавить 1 мл Матригель в холодную среду и хорошо перемешать. Добавить 1 мл холодного Матригель-DMEM / 12 среды в лунку 6-луночного планшета или 5 мл в 10 см чашку.
      3. Оставьте Тарелки / блюда в 4 ° С в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2 ч. Отберите Перед использованием в среду.
    2. Сплит ЭСК человека на пластинах: Аспирируйте средств массовой информации из MEF пластины и промыть ЭСК человека с DPBS. Затем добавить 1 мл диспазу (1 мг / мл) в лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте клетки в 37 ° Cинкубатор пока края колоний не начнут отделяться.
    3. Удалить диспазу решение. Промыть DPBS в два раза, а затем добавить 2,5 мл / лунку средой mTeSR или MEF-кондиционированной среды к пластине.
    4. Очистите клеток с использованием клеток скребком и тщательно пипетки вверх и вниз, чтобы сломать человека колонии ЭСК в небольшие пряди.
    5. Трансфер глыбы ESC и разбавить 1: 3 в покрытых плитами.
    6. Добавить 2 мл / лунку mTeSR средний или MEF-кондиционированной среды и изменения средней ежедневно.
    7. Культура ЭСК человека в mTeSR среды или MEF-кондиционированной среды на пластинок, покрытых по крайней мере 2 проходов.
  4. Вызвать CPC дифференцирование от эмбриональных клеток
    1. Когда клетки ~ 90% сливной, аспирация среды и промыть DPBS. Тогда инкубировать ЭСК в 0,5 мг / мл диспаза при 37 ° С в течение 20 мин.
    2. Промыть ЭСК с DPBS два раза, удалить соты из плит с сотовым подъемника, то ресуспендируйте клеток зажимы в дифференцировке среде (DMEM / F12, содержащей 18% FBS, 0,1 мМ NEAA, 2 мМL-глутамина, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты).
    3. Перевести клетки в 6-а ультра-низких пластин крепления для формирования EB.
    4. Изменить дифференциации среду на следующий день.
    5. Замените среду каждые 3 дня, и поддерживать ЭТ в суспензионной культуре.
  5. Изолировать HCPCS
    1. Собрать ЭТ не позднее, чем через 9 дней дифференциации для изоляции человека КТК.
    2. Отберите среднего и промыть ЭТ с DPBS в два раза. Добавить 0,5 мл 0,25% трипсина в каждую лунку культуральных планшетах 6-а при 37 ° С в течение 5 мин.
    3. Добавить равный объем среды для дифференцировки, чтобы остановить реакцию. Внесите вверх и вниз, чтобы отделить ЭТ в одиночных камерах. Сбор клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин и ресуспендируют клеток в 2% FBS / DPBS. Фильтровать клетки с сетчатым фильтром клеток 40 мкм и FACS-очищенной ППП + КПК клеток, как описано в разделе 1.4.3.
    4. Plate сортируются HCPCS на geltin покрытием пластин. Культура HCPCS дифференциации среды для 7-9 Дней дифференцироваться в кардиомиоцитов и гладкомышечных клеток. 7 дней после посева, культура дифференцированные клетки с 5% нокаут СР в DMEM / F12 среде.

Результаты

Протокол показывает вывод всех цен за клик от нескольких клеточных линий ES. ЭСК объединяются, чтобы сформировать ЭТ дифференцироваться в цены за клик. ЭСК регулярно поддерживается на MEF фидеров (рис 1А, F) и питатели удаляются перед дифференциации. После агрегации ESCs в ЭТ в диффе...

Обсуждение

This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability ...

Раскрытие информации

The authors declare no competing financial interests.

Благодарности

We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
FBSThermo scentificSH30070.03E
Knockout SRLife technology10828028
Knockout DMEMLife technology10829018
DMEMLife technology11965118
NEAALife technology11140050
GlutaMAXLife technology35050061
N2Life technology17502048
B27Life technology12587010
Ham’s F12Life technology11765062
IMDMLife technology12440061
Pen/StrepLife technology15140122
PyruvateLife technology11360070
DispaseLife technology17105041
Stempro-34Life technology10639011
DMEM/F12Life technology11330032
BSA Life technology15260037
Trypsin Life technology25200056
Ascobic Acid SigmaA5960
1-ThioglycerolSigmaM1753
2-MercaptoethanolSigmaM3148
VEGFR&D293-VE
Bmp4R&D314-BP
ActivinAR&D338-AC
bFgfR&D233-FB
Fgf10R&D345-FG
mTeSRStemcell technologies5850
MatrigelBD Biosciences354277

Ссылки

  1. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  2. Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
  3. Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).
  4. Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).
  5. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  6. Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).
  7. Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).
  8. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  9. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  10. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).
  11. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  12. Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).
  13. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  14. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).
  15. Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151 (1), 206-220 (2012).
  16. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  18. Gaj, T., Gersbach, C. S., Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  19. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  20. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  23. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
  24. Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).
  25. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).
  26. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).
  27. Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 8/10/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

The following author is now listed as a co-corresponding author:

Lei Bu

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

95FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены