Изоляция потенцированной Hsp104 вариантов Используя дрожжи Proteinopathy Модели

Резюме

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Аннотация

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Введение

Дрожжи модели proteinopathy были разработаны для белок-неправильного сворачивания расстройств, включая боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD) ^1-3. Экспрессия белков TDP-43 и FUS, которые misfold у пациентов с БАС, являются токсичными и mislocalize с образованием агрегатов цитоплазматические в дрожжах ^1,2. Аналогично, выражение α-синуклеина (α-син), который участвует в PD, является токсичным и mislocalizes с образованием агрегатов цитоплазматические в дрожжах ^3. Эти особенности резюмировать фенотипы у больных с этими расстройствами ^4,5. Таким образом, модели дрожжей обеспечить полезную платформу для скрининга белков или малых молекул, которые предотвратить или обратить вспять эти фенотипы ^2,6-13. Мы заинтересованы в развитии белков, которые способны перевернуть агрегацию и токсичность из-за TDP-43, FUS, и α-син. Мы делаем ставку на Hsp104, в AAA + белка из дрожжей, который однозначно способен разбивке белки и птOM аморфные агрегаты и амилоида в дрожжах, пока это не имеет никакого человеческий гомолог ^14,15. Hsp104 тонко настроенный разбить эндогенные дрожжевых прионов и имеет лишь ограниченную способность разбить субстраты, причастных к нейродегенеративных заболеваний человека, которые он никогда не обычно сталкивается ^16,17. Таким образом, мы стремимся инженер расширенные версии Hsp104, которые способны действенно детализировать эти человеческие субстраты. Чтобы сделать это, мы строим большие библиотеки из Hsp104 варианты использования ошибкам ПЦР; эти библиотеки могут быть подвергнуты скринингу с использованием моделей дрожжи proteinopathy ^17. Мы приняли домена целевой подход к построению и скрининга библиотек, как Hsp104 очень большой ^17. Мы изначально была ориентирована на средней области (MD) из Hsp104 ^17, при том, что аналогичные подходы могут быть использованы для скрининга других доменов. Эти модели позволяют скрининг на disaggregase активности непосредственно, в отличие от альтернативных способов, таких как поверхности дисплея, который является Остальноеricted использовать для мониторинга связывания ^18.

Наш протокол базируется на двух шагов скрининга (рисунок 1). Во-первых, варианты Hsp104, которые подавляют токсичность болезни подложки в дрожжах выбраны. Чтобы сделать это, Hsp104 варианты и болезни, связанные подложка котрансформировали в Δ Hsp104 дрожжей. Мы используем Δ Hsp104 дрожжей, чтобы исследовать последовательности пространство Hsp104 в отсутствие дикого типа (WT) Hsp104 ^17. Важно отметить, что удаление Hsp104 не влияет α-син, FUS или TDP-43 токсичность в дрожжах, и выражение Hsp104 ^WT обеспечивает минимальное спасение ^1,13,17. Дрожжи затем высевали на средств индукции, чтобы индуцировать экспрессию обоих белков. Дрожжей, несущих варианты Hsp104, которые подавляют токсичность заболеваний, ассоциированных роста подложки придают колонии. Эти варианты отобраны для дальнейшего анализа, в то время как колонии поддержания варианты, которые не подавляют токсичности кубик. Тем не менее,ложные срабатывания существенной проблемой в этом экране. Выражение TDP-43, FUS, и α-син являются высокотоксичными, которая создает сильное селективное давление для возникновения спонтанных генетических супрессоров токсичности, не связанной с вариантом Hsp104 выражается. Таким образом, мы использовали среднее экран, который также сравнительно высокая пропускная устранить эти неспецифические супрессоры токсичности ^17. В этом вторичном экране, выбранный дрожжи обрабатывают 5-Fluorootic кислоты (5-FOA), чтобы противостоять выберите для Hsp104 плазмиды ^19. Штаммы затем оценивали на подложке (TDP-43, FUS, или α-син) токсичность через пятнистость анализа, чтобы гарантировать, что токсичность подложки восстанавливается после потери плазмиды Hsp104. Таким образом, дрожжи, в которых токсичность восстанавливается в этом вторичном экране по-видимому, первоначально отображается подавление токсичность из-за присутствия в варианте Hsp104. Эти дрожжи обозначаются как "хитов" и плазмиды Hsp104 должны затем бытьвосстановлены и последовательность, чтобы определить мутации в Hsp104 ген ¹⁷ (рисунок 1). Любые удары должны быть подтверждена путем построения мутацию независимо с помощью сайт-направленного мутагенеза, а затем повторное тестирование для подавления токсичности. Потенциальные приложения для этого протокола широки. С помощью этих методов, библиотеки любого типа белка может быть подвергнуты скринингу на вариантах, которые подавляют токсичность любой подложки белком, который является токсичным в дрожжах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Библиотека поколения

1. Для построения библиотеки Hsp104 помощью предметно-ориентированный подвержены ошибкам ПЦР, сначала усиливается область интереса с ошибкой склонны ДНК-полимеразы ^20.
2. Очищают путем ПЦР-продукт экстракции геля.
3. Выполните шаг расширения megaprimer с использованием стандартного протокола сайт-направленного мутагенеза: объединить 50 нг шаблона плазмиды, 250 нг megaprimer, 200 мкМ дНТФ, и с высокой точностью воспроизведения ДНК-полимеразы в ПЦР буфере, и доводят до 50 мкл общего объема с ПЦР воду, содержащую ²⁰ , Запустите стандартную программу ПЦР.
   Примечание: специфические праймеры, используемые будет меняться в зависимости от конкретного области гена, который должен быть усилен.
   1. После ПЦР, переварить родительского матричной ДНК с 1 мкл Dpn I рестрикционным ферментом в течение 2 ч при 37 ° С.
4. Transform библиотеку, электропорации или другими средствами в ultracompetent Е. палочка и очистить его от минипрепаративную.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотека поколениеизменяется существенно основывается на целях данного эксперимента. Hsp104 очень большой белок, так что это непрактично, чтобы рандомизировать полный ген, и именно поэтому мы используем конкретному домену ошибкам ПЦР. Кроме того, структура Hsp104 еще недостаточно изучена, что делает конструкцию направленных библиотек захватывающих ^21. Библиотеки могут быть построены с использованием направленные или случайные подходы к мутагенеза, с единственным ограничением в том, что шаблон плазмиду основой должны содержать ген URA3, чтобы позволить 5-FOA выбора счетчика на декстрозы массовой информации.

2. Трансформация Hsp104 библиотеки

1. Интеграция с заболеванием связаны субстрат в W303aΔ Hsp104 дрожжей с использованием стандартной ацетат лития / PEG протокол ²² преобразования. Выберите отдельных колоний и экран их токсичности для выделения штамма с высокой токсичности заболевания, связанного субстрата ^23.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте интегрированную напряжение и Изолат.е одну колонию, чтобы обеспечить равный выражение во всех клетках. Клон болезни субстрата в плазмиды, позволяющей осуществлять интеграцию гена под любой маркер, кроме урацил (мы используем гистидин) и библиотеки Hsp104 в pAG416GAL плазмиды (урацил маркер) ^24. Для обеспечения 5-FOA counterselection, гарантировать, что библиотека выражается из плазмиды с урацил маркера. Также могут быть использованы другие штаммы дрожжей. Мы отметили, сходный фенотип подавления токсичности, используя W303a и BY4741 штаммов дрожжей в обоих WT и Δ Hsp104 фонов (Мэй и JS, неопубликованные данные).
2. Преобразование библиотеки Hsp104 в этом штамме, используя тот же ацетат лития / PEG протокол ²² преобразования. Расширить трансформацию соответствующим образом поддерживать последовательность пространство библиотеки и сохранить предсказанный размер библиотеки.
3. Пластина преобразование смесь на noninducing, селективные пластины (например SD-Его-Ura), используя достаточно тарелки вобеспечить рост большого числа колоний. Используйте большие чашки Петри (150 мм), чтобы свести к минимуму количество пластин, необходимых. Восстановление трансформантов с использованием пластин позволяет эффективность трансформации в оценке.
4. Transform Hsp104 ^WT и векторные отрицательных контролей параллельно.

3. Скрининг на борьбе Proteotoxicity

1. Вымойте колонии от пластин с помощью раффинозу дополнить отсева СМИ (например SRaff-Его-УРА). Используйте серологические пипетки и стерильные деревянные аппликаторы, чтобы ослабить колонии из чашек. Передача жидкости промывки на 50 мл коническую пробирку и тщательно вихря, чтобы отделить любые скопления клеток. Развести в слегка пасмурную культуры, ОД ₆₀₀ ~ 0,025.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь раффиноза служит для снятия нагрузки клетки глюкозы опосредованной репрессии индукции, таким образом, грунтовки клетки для галактозы-опосредованной индукции.
2. Растут разбавленный культуру на ночь в рафиноза отсева СМИ при встряхивании на 30 ºC. Растут Hsp104 ^WT и векторных элементов управления параллельно.
3. На следующее утро, пластины диапазон концентраций на отдельные галактозы (например, SGal-His-URA) пластины (1 мкл до 2 мл концентрированной культуры в 400 мкл общего объема). Покрытие широкий диапазон концентраций будет гарантировать, что пластина будет иметь отдельных колоний. Фактическая концентрация, необходимая зависит от токсичности заболевания подложки, представляющей интерес.
4. Нормализовать вектор и Hsp104 ^WT культур в OD ₆₀₀ библиотеки и пластины равные объемы сравнить рост библиотеки по сравнению с контролем.
5. Для оценки выбора жесткости, пластины библиотеку на глюкозу (гнет) СМИ. Выдержите пластины на 2-3 дней при 30 ° С, пока колонии не появляются (рисунок 2). Оценить полученные колонии и по сравнению с контрольной группой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часто больших и малых колонии получаются, но нет корреляции между размером колоний и актаivity наблюдается. Экран эти потенциальные хиты, используя технику отбора счетчик 5-ФА (шаг 4), чтобы свести к минимуму ложные срабатывания, перенесенные в последовательности.

4. 5-FOA Counterselection и Зрительные по ликвидации ложных срабатываний

1. Серия из отдельных колоний в двух экземплярах на двуспальной и односпальной отсева СМИ (например, SD-Его-Ura и SD-His пластин) и растут в течение ночи при 30 ° С. Повторите с векторными и Hsp104 ^WT управления. Покрытие на SD-His до 5-FOA повышает эффективность на стадии 5-FOA, увеличивая вероятность того, что клетки будут потеряны плазмиду Hsp104, когда они помещают на 5-FOA.
2. Для предотвращения пластины от высыхания, оберните SD-Его-УРА пластин в парафильмом и хранить при температуре 4 ° С при выполнении экран 5-ФА. Эти пластины в конечном итоге будут использоваться для секвенирования.
3. Серия колонии от SD-Его пластины до отдельных колоний на 5-FOA пластин (YPD СМИ + 1 г / л 5-FOA) и выдержать в течение 1-2 дней при 30 &# 186; C, пока не появятся отдельные колонии. Здесь, 5-FOA преобразуется в токсичного продукта (5-fluorodeoxyuridine) в клетках, которые содержат ген URA3. Таким образом, любые клетки еще несущие плазмиды Hsp104 умрет.
4. Подряд отдельные колонии из пластин 5-FOA в двух экземплярах на SD-Ura и SD-His пластин. Тестовые 3 колонии для каждого удара, чтобы увеличить вероятность того, что по крайней мере одна колония для каждого удара будет потеряли плазмиды Hsp104. Инкубируют в течение 1-2 дней при 30 ° С. Колонии, которые потеряли плазмиды Hsp104 будет расти на SD-His пластин но не SD-Ura пластин.
5. Растут штаммы, которые потеряли плазмид Hsp104 для пятнистость анализов. Растут штаммов к насыщению в рафиноза отсева СМИ (например SRaff-His) в 96 шахтах 2 мл пластин в течение ночи при 30 ° С при встряхивании. Не забудьте включить в 5-FOA обработанных контрольных штаммов.
6. Подготовка пластин для пятнистость анализа. Используя многоканальную пипетку, аликвоту 200 мкл раффиноза отсева СМИ (например SRaff-His) ва из 96-луночного планшета, оставляя колонны 1 и 7 для аккуратных культур. Аликвоты 250 мкл каждого из 16 насыщенных культур в колонках 1 и 7 пластине.
7. Серийно разбавить культур 5 раз в каждом столбце пластины, тщательно перемешивая с помощью многоканальной пипетки. Удалить 50 мкл разбавленного культуры из колонн 6 и 12, чтобы обеспечить конечный объем каждой лунки 200 мкл. Это имеет важное значение для обеспечения даже кровянистые выделения.
8. Используя 96-болт репликатора инструмент (FROGGER), определить культуру в двух экземплярах на SD-его и SGal-His пластин. Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение 2-3 дней.
9. Выбрать для секвенирования штаммы, которые обладают токсичностью по SGal-His пластин, аналогичных средств управления. Откажитесь также ложные штаммов срабатываний, которые не так токсичен, как в контрольной группе. 5-FOA также часто токсичны по себе, так отбросить штаммы, которые проявляют дефект роста на SD-His пластин или которые демонстрируют существенно больше, чем только токсичности заболевания субстрата ( Рисунок 3).

5. Секвенирование Hsp104 Варианты ПЦР колоний

1. Скрип ~ 10 мкл дрожжей из пластин SD-Его-Ura в 3 мкл 20 мМ NaOH в ПЦР стрип труб и лизиса клеток путем замораживания-оттаивания. Поместите полосы трубки в морозильной камере -80 ºC в течение 10 мин или в жидком азоте, а затем инкубируют при 99 ° С в амплификаторе в течение 10 мин. Развести штаммов к 100 мкл ПЦР с начальной воды.
2. Подготовка ПЦР реакции: 5 мкл ПЦР шаблон, 0,5 мкл 100 мкМ каждого праймера, 0,5 мкл 10 мМ дНТФ, 0,25 мкл ДНК-полимеразы в ПЦР буфере, и составляют до 25 мкл общего объема с ПЦР класса водой. Дизайн праймеров для амплификации рандомизированное регион плюс примерно 100 б.п. на обоих концах. Минимизировать размер усиленного региона увеличить вероятность успешной амплификации. Запустите стандартную программу ПЦР.
3. Анализ проб с помощью электрофореза в агарозном геле, чтобы подтвердить амплификацию ПЦР-продукта в соответствующем SIZе. Повторите ПЦР, если нет ни одного присутствует.
   ПРИМЕЧАНИЕ: отказ ПЦР обычно из-за слишком большого количества дрожжей используется в шаге 5.1.
4. Подготовка образцов для секвенирования ДНК. Удалить ПЦР-праймеров либо путем очистки ПЦР или с помощью ПЦР-продукт очистки реагентом, таким как Экзонуклеазой I и креветок фермента щелочной фосфатазы (ExoSAP-IT) деградировать одноцепочечной ДНК. Этот реагент ферментативно ухудшает некорпоративные праймеры и дНТФ, что позволяет более высокой пропускной способности.
5. Последовательность ПЦР-продуктов. Не забудьте тщательно проанализировать секвенирования хроматограммы для мутаций. Мутации можно наблюдать в виде смеси двух нуклеотидов в данном месте (рисунок 4), как дрожжи часто питают множество плазмид.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы построили библиотеку вариантов Hsp104 рандомизированных в средней области и отбор ее для подавления TDP-43 токсичности. Библиотека была преобразована и высевали на глюкозу и галактозу пластин (рисунок 2) для оценки жесткости экрана. Единичные колонии отбирали и штаммы были выбр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы представляем наш подход к изоляции потенцированные варианты Hsp104, которые подавляют токсичность, ассоциированных с заболеваниями подложек с использованием моделей дрожжи proteinopathy. Используя этот подход, большие библиотеки вариантов может быть показан в высокой пропускной спо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150 mm Petri dishes	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Plates	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200