В естественных условиях и в пробирке разведение энтомопатогенных нематод (Steinernematidae и Heterorhabditidae)

Резюме

Целью данной презентации является демонстрация в естественных условиях и в пробирке методов выращивания энтомопатогенные нематод. IN VIVO методы рассмотреть выращивание этих нематод с войском насекомых, в то время как методы в пробирке использовать богатый агар СМИ.

Аннотация

Энтомопатогенные нематоды (EPN) (Steinernematidae и Heterorhabditidae) имеют мутуалистических партнерство с грамотрицательных Гамма-Proteobacteria в семье энтеробактерий. Xenorhabdus бактерии, связанные с steinernematids нематод в то время как Photorhabdus являются симбионтами heterorhabditids. Вместе нематоды и бактерии образуют мощный инсектицидный комплекс, который убивает широкий спектр видов насекомых в интимной и конкретного партнерства. Здесь мы демонстрируем в естественных условиях и в пробирке методов, обычно используемых в воспитании этих нематод в лабораторных условиях. Кроме того, эти методы представляют собой ключевые шаги для успешного создания EPN культур, а также стать основой для других биопроб, которые используют эти организмы для исследований. Производство aposymbiotic (симбионтов бесплатный) нематод часто решающее значение для углубленного и комплексного подхода к изучению симбиоза. ЭтоПротокол не требует добавление антибиотиков и может быть выполнена в течение короткого периода времени со стандартным лабораторным оборудованием. Нематоды, полученные таким образом, являются относительно надежными, хотя их выживаемость при хранении может изменяться в зависимости от вида используемых. Методы, описанные в этой презентации соответствуют описанным различными авторами и уточнена лаборатории П. складе в, Университет Аризоны (Тусон, Аризона, США). Эти методы отличаются от тела методов, которые используются в массовом производстве этих организмов в целях борьбы с вредителями.

Введение

Энтомопатогенные нематоды (EPN) Steinernema и Heterorhabditis SPP. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) и их бактериальных симбионтов, Xenorhabdus и Photorhabdus SPP (Enterobacteriaceae) считаются возникающим модель наземное животное-микроб симбиотических отношений ^2-4,6,10,19. Xenorhabdus и Photorhabdus SPP. которые питал как симбионтов в кишечнике только свободно живущих стадии нематод, также известный как инфекционного несовершеннолетнего (IJ) или ^3-м этапе инфекционного несовершеннолетних ^8,10,13. Пара бактерия-нематода является патогенным для широкого круга насекомых и успешно реализуется в биологический контроль и программ по всему миру ^6,8 комплексной борьбы с вредителями.

Здесь мы показываем выбор в естественных условиях и в пробирке методов, которые часто осуществляемой для выращивания EPN в лабораторных условиях. Iн методы естественных условиях созерцать множество насекомых для выращивания нематод. Обычно, незрелые этапы различных отрядов насекомых (т.е. Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, и т.д..) Считаются подходящими хозяевами. В естественных условиях методы обычно рассматриваются для поддержания нематод культур в лаборатории. Этот метод не может быть пригодным при рассмотрении массовое производство нематод. Большие количества насекомых хозяев может потребоваться для этой цели, требующей больше времени и дополнительных расходов, связанных с насекомыми воспитания.

Энтомопатогенные нематоды также можно культивировать в пробирке на нескольких носителях. В зависимости от цели исследования, в методах пробирке может или рассмотреть включение симбиотических бактерий в средствах массовой информации. В этой презентации мы опишем два наиболее часто используемых методов для распространения EPN. Ингредиенты СМИ являются источником питательных веществ для симбиотической бактерии аметоды й источник стериновый для нематод. В пробирке дают преимущество в основе воспитания EPN без хозяина насекомых.

Первоначально, многие СМИ в пробирке развитого были использованы для размножения EPN, когда подходящие насекомых хозяева отсутствуют. Тем не менее, в течение последних лет, в пробирке методы выращивания стали широко использоваться в научных исследований, направленных понять мутуалистических отношения между EPN и их симбиотических бактерий ^17,19.

Методы, описанные в этой презентации соответствуют описанным различными авторами и уточнена фондовой лаборатории университета Аризоны (Тусон, Аризона, США). Эти методы отличаются от тела методов, которые используются в массовом производстве этих организмов в целях борьбы с вредителями.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1 В естественных условиях Разведение энтомопатогенных нематод с их Symboitic бактерий

1. Обратить 100 х 15 мм пластиковый чашку Петри и поставить два диска фильтровальной бумаги (90 мм) в крышке блюдо.
2. Равномерно распределить 1 мл на IJ (инвазионных личинок) водной суспензии (в концентрации 1000-2000 IJ / мл) на фильтровальной бумаге.
   Примечание: ИЮ не должны быть поверхность стерилизуют.
3. Добавить 10 последнего возраста личинок большей waxmoth Galleria MELLONELLA к блюду. Цель состоит в том, чтобы обеспечить примерно 100-200 IJS / личинку.
4. Накройте крышкой с нижней части чашки Петри (рисунок 1) и напишите на чашку Петри. Упоминание следующую информацию: название вида нематод (если известно); изолировать код / ​​обозначение; Дата инфекция ловушка была установлена.
5. Поместите блюдо внутри свободно запечатанный пластиковый пакет (чтобы сохранить влажность) и держать его в темноте при любом комнатной температуре или в термостате между 20-25 ° C. Проверьте блюда ежедневно
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тьма облегчает нематод инфекции, как он имитирует природные условия инфекции в почве.
6. Через 3-5 дней, удалить трупы с признаками нематоды инфекции в модифицированной Белого ловушку ^7.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если трупы запах гнилостный, это может быть признаком того, что культивирование не была успешной и / или было загрязнение. Установка нового инфекции камеру с новой порцией нематод и насекомых.

2 В пробирке Разведение энтомопатогенных нематод с их симбиотические бактерии

1. Печень-почки Агар Метод ^9,19
   1. Чоп печень и почки на мелкие кусочки (2 см ³ или меньше) и поместите в блендер с NaCl, агар и 300 мл воды и смешать, пока мясо не станет жидкой пульпы, густой пасты или пюре. Затем смесь передачи в колбу Эрленмейера 1 л.
   2. Добавить окончательные 200 мл воды в блендере судна и сцеживать все оставшиеся средства массовой информации вКолба Эрленмейера. Автоклав в течение 15 мин при 121 ° С. После обработки в автоклаве позволяют агар для охлаждения прикоснуться перед заливкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетирование среде не рекомендуется, поскольку эта среда, как правило, имеют куски мяса.
   3. Налейте ~ 20 мл агара на 5 (или 6) см чашки Петри при перемешивании рука или вращая колбу между наливает для более однородной СМИ. Разрешить агар затвердевать и сохранять блюда при 4 ° С, пока не понадобится
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пламени стерилизовать металлический шпатель, чтобы разрушить любые большие куски мяса выливают в чашку Петри.
2. Липидов Агар Метод ^9,19
   1. Подготовьте липидов агаровой среды путем смешивания питательный бульон, агар и дрожжевой экстракт и залить смесь в колбе 2 л Эрленмейера. Добавить дистиллированной H ₂ O и MgCl ₂ • 6H ₂ O и автоклав в течение 15 мин при 121 ° C.
   2. Добавить стерильную смесь кукурузного масла и кукурузный сироп смеси и перемешивают энергично или вихревой и часто, чтобы разогнать капель масла равномерно.
      Примечание: стерилизацию кукурузное масло и сироп, поместив необходимый объем в УФ поперечно-сшивающего агента. Масло не растворяется в жидкости, но убедитесь, что он находится в мельчайших капелек.
   3. Налейте ~ 20 мл агара на 5 (или 6) см чашки Петри и позволяют агар затвердевать и сохранять блюда при 4 ° С до использования.
   4. Подряд желаемый симбиотических бактерий на липидный агаром и инкубировали планшеты при 28 ° С в течение 24-48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Распространение 100-200 мкл в течение ночи (12-16 ч) LB субкультуры.
   5. На следующий день после, добавить примерно 0,4 мл поверхности стерилизовать нематод суспензии (яйца или инвазионных личинок) и инкубировать пластин при комнатной температуре в темноте или в инкубаторе при 22 ± 3 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте больше 0,4 мл нематод подвески, как это может создать слишком влажную среду, которая неблагоприятна для роста нематоды.
   6. Daily Monitor культур. Культуры должны производить новое поколение IJS в около 12 дней (рисунок 2).
   7. Передача нижнюю тарелку с агаром, когда нематоды видно искателем стороны посудомоечной (фиг.3А) к модифицированному Белый ловушку (см Orozco и соавт. ¹²⁾ для сбора IJS (фиг.3В). Выполните этот шаг под ламинаре по снижению загрязнения СМИ.
   8. Соберите IJS из модифицированного Белого ловушку при выходе и промыть IJ подвеску для удаления среднего мусора. Магазин И.Я. в стерилизованной дистиллированной воды при 10 ° С (в холодной температуры инкубатора или холодной комнате), или, если это необходимо использовать немедленно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от цели исследования, семян тарелки с либо симбионтов-колонизировали или aposymbiotic нематод.

3 В пробирке Разведение Aposymbiotic (Symbiont-бесплатно) Энтомопатогенные Нематоды

1. Инфекция 10-20 G. MELLONELLA личинки с IJS желаемых видов нематод (смотри раздел 1). После 3 или 4 дня (в это время IJs должны созреливзрослым первого поколения) собирать трупы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: время зрелости и число женщин, необходимых для получения достаточного количества яиц будет варьироваться в зависимости от вида. Заражать больше G. MELLONELLA личинок при необходимости и начать вскрытия еще в 48 ч после заражения, чтобы оценить, являются ли они в правильном стадии развития.
2. Место каждого трупа по отдельности в чашке Петри с физиологическим раствором (M9 буфера ^18). Проанализируйте трупа, потянув голову с тонким наконечником пинцетом.
3. Соберите по крайней мере, 20 беременных (с яйцами внутри) женщин с тонкой иглой (L-формы предпочтительно) и поместите их в часовое стекло, содержащую 10 мл M9 буфера (4А).
4. Подготовка раствора axenizing с учетом следующих ингредиентов: 6,75 мл дистиллированной воды, 1,25 мл 5 N NaOH и 2,25 мл коммерчески доступного раствора хлорной извести, разбавленный до 3% раствором гипохлорита.
   ПРИМЕЧАНИЕ: NaOH является основным решение перчатки, защитные очки и другую соответствующую защитнуюодежда должна носиться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовить свежие решения axenizing каждый раз, как отбеливатель деградирует в свете. Подготовьте несколько партий axenizing решения и выполнять стерилизацию поверхности и сбор яиц в нескольких часовых стекол.
5. Промыть самок по крайней мере, три раза буфером M9 заполнения часового стекла с буферным раствором и всасывающей буфер с помощью пипетки. Убедитесь, что самки остаются в часовое стекло. Повторите этот шаг еще два раза.
6. Сразу добавить axenizing решение и позволить самки оставаться в этом растворе в течение не более 10-15 мин. Соблюдайте нематод ткани начинают распадаться в то время как яйца (которые устойчивы к axenizing решения) остаются нетронутыми.
7. Вручную нарушить женские тела, чтобы ускорить процесс, сокращая их с помощью иглы или скальпеля (Рисунок 4B, C). Удалить яйца с помощью пипетки их в 1,5 мл микропробирок, избегая добавления нерастворенный ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование в качестве млюбые микроцентрифужных трубки по мере необходимости, чтобы собирать яйца, и работать быстрее, так как жизнеспособность иц будет уменьшаться в течение длительного периода воздействия axenizing раствора.
8. Вихревые трубки для 15 сек с помощью "высокоскоростной установку" для дальнейшего удаления нематод ткани, прикрепленные к яйцам. Или же, если вихрь недоступен, пипетки вверх и вниз Решение несколько раз.
9. Гранул яйца центрифугированием при приблизительно 18000 г в течение 2 мин. Увеличить скорость, если яйца не достаточно осадок. Удалить axenizing решение и промыть два раза, заполнив микроцентрифужную пробирку стерильной дистиллированной водой и центрифуги еще раз на 900 мкг в течение 1 мин.
10. После последней промывки ресуспендируйте яйца в 300-500 мкл стерильной дистиллированной воды и поместите их в стерильной 3 см чашки Петри или стерилизованного часовым стеклом. Следует помнить, что яйца теперь поверхность стерилизуют, таким образом, использовать стерильные пипетки и / или советы pippetter и воду, чтобы поддерживать чистоту яиц.
11. Изучите яйца под микроскопом рассекает (30-50X увеличения), чтобы подтвердить, что они целы (Рисунок 4D) и передавать их на 5 см пластины с агар печени почек (см раздел 2.1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте более 400 мкл яичной суспензии на пластинах, как это сделает агар чрезмерно влажным.
12. Лейбл пластины с соответствующей информацией и хранить их в вертикальном положении в темноте при 28 ° C. Отрождение яиц должно быть очевидно ночь.
    Примечание: Вода может конденсироваться на крышке чашки, но это будет испаряться после 1 или 2 дней. В это время, поместите блюдо в полиэтиленовый пакет, чтобы сохранить влагу агара и избежать ее высыхания.
13. Периодически Соблюдайте блюда и отбросить любые блюда, которые показывают признаки грибковой или бактериальной контаминации. После того, как ИЮ видны миграции вверх по стенке чашки Петри, снять крышку и передавать нижнюю тарелку с агаром с модифицированным Белый ловушку ^12. Рассмотрим стерильных условий при передаче блюдо в modifieд Белый ловушка, чтобы избежать загрязнения открытой информации.
14. Продолжить мониторинг Уайт-ловушек и урожая IJ мере необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Aposymbiotic нематоды будет продолжать мигрировать в воду Белого ловушку в течение многих дней и даже недель.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Метод разведение в естественных условиях использует живых насекомых в качестве хозяев для роста нематоды и воспроизводства. Инфекция камеры представляют собой эффективный метод для раскрытия насекомых IJS. Это единственный этап в нематоды жизненного цикла, что векторы бактериал?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Использование подходящего хозяина является ключевым фактором для успеха в естественных условиях выращивания EPN. Как правило, оба steinernematids и heterorhabditids может воспроизводить и успешно завершить свой ​​жизненный цикл в личинок большей восковой моли, Galleria MELLONELLA (Lepidoptera: Pyralidae). Тем...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
For In vivo Infections
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose	Whatman/VWR	28450-081	Grade 1 filter paper recommended
Insect hosts	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	Galleria mellonella are recommended
For Liver-kidney Agar (for 500 ml)
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-092
Beef liver, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Beef kidney, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration)	Acros/VWR	200002-434	any research grade NaCl can be used
Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
500 ml distilled H2O
For Lipid Agar (for 1 L)
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Nutrient broth, 8 g	BD/VWR	90002-660
Yeast extract, 5 g	EMD/VWR	EM1.03753.0500
Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml)	EMD/VWR	EM-MX0045-1
Corn oil, 4 ml	Any brand	Locally source; supermarket	Any brand of corn oil can be used
Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity	Karo	Locally sourced; supermarket
Agar, 15 g	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
Distilled H2O, 890 ml