Синергетический использованием нейронных клеток-предшественников и самоорганизации пептидов в экспериментальном шейного отдела спинного мозга Травма

Резюме

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Аннотация

Повреждения спинного мозга (SCI) вызывают серьезные неврологические нарушения и психологические, экономические и социальные последствия для пациентов и их семей. Клинически более 50% от ТСМ повлиять на шейный отдел позвоночника ^1. Как следствие первичной травмы, каскад вторичных механизмов, включая воспаление, апоптоз и демиелинизации происходят, наконец, приводит к образованию рубцов ткани и развития интрамедуллярные полостей ^2,3. Оба представляют физические и химические барьеры для трансплантации клеток, интеграции и регенерации. Таким образом, формирование ингибирующее среды и преодоление полости для создания благоприятной среды для трансплантации и регенерации клеток является перспективным терапевтическая мишень ^4. Здесь ушиб сжатия / модель шейки SCI с использованием аневризмы клипа описано. Эта модель является клинически более актуальным, чем других экспериментальных моделей, так как полная перерезка или разрывы корда редки. Кроме того, в comparisoп капельной модели вес, который, в частности, повреждения колонны Спинка, окружная сжатие спинного мозга появляется выгодно. Клип сила закрытия и продолжительность может быть отрегулирован для достижения различной степени тяжести травмы. Кольцо весной облегчает точную калибровку и постоянство клип силу. В физиологических условиях, синтетические самоорганизующиеся пептиды (SAP) самоорганизуются в нановолокна и, таким образом, являются привлекательными для применения в ТСМ ^5. Они могут быть введены непосредственно в очаг минимизации повреждения кабеля. ПСП являются биосовместимые конструкции возводят каркасы для преодоления интрамедуллярные полости и, таким образом, оборудовать поврежденный кабель для восстановительных процедур. K2 (QL) 6K2 (QL6) является роман SAP представила Донг с соавторами л. ⁶ По сравнению с другими пептидами, QL6 самостоятельно собирается в β-листов при нейтральном рН ⁶ 0,14 дней после ТСМ, после острой стадии, ПСП вводятся в центре поражения и нервных клеток-предшественников (NPC) являются ИнджеИДКТК в смежных колонках спинных. Для того чтобы поддерживать жизнеспособность клеток, трансплантации в сочетании с непрерывным субдуральной введения факторов роста осмотическим микро насосов в течение 7 дней.

Введение

Более 50% повреждений спинного мозга связаны с шейного отдела позвоночника. В клинических условиях два основных патофизиологических механизмов описаны: начальная ушиб спинного мозга и в дальнейшем, продолжающееся сжатие, вызванное переломов костей, кровоизлияний или отек тканей.

Аневризма клип ушиб / модели сжатия имитирует оба патофизиологические механизмы: привязка клип производит контузию и продолжительность отсечения представляет собой компонент сжатия, признавая, что компрессия в клинических условиях, вызванных переломами костей, кровоизлияний или отек тканей последний значительный больше. Использовать аневризма клип изменяется с помощью кольцевого весной, гарантирующей точное и воспроизводимое отсечения силу. Особенно в сравнении с полугидратом перерезки или модели ушиба, эта аневризма клипа модели имитирует лучших медицинских учреждениях. В то время как пациенты с грудной травмы страдают от параплегии, большинство больных раком шейки Injuries являются тетраплегией и полностью зависит. Анатомическое строение шейки матки мозга, однако, показывает существенные различия по сравнению с грудной или поясничный отдел позвоночника, и, таким образом, рассматривается, в частности, в этом протоколе.

Развитие костномозгового полостей и тканей рубцов препятствия для восстановления и регенерации. Чтобы преодолеть эти барьеры использование каркасного материала является перспективным подходом. Самоорганизующиеся пептиды могут быть введены непосредственно в эпицентре поражения. Там они собираются в нано-волокна лесов, соединяющих полости и улучшить ингибирующее среды, уменьшая воспаление и тканевую пугать. В то время как жесткие материалы вызывают значительное повреждение спинного мозга при имплантации, жидкость пептиды могут быть введены безопасно и без серьезного дополнительного повреждения.

Повышение ингибирующей среду с самоорганизующихся пептидов перед трансплантацией стволовых клеток, следовательно, поддерживает клетку яntegration, дифференцирование и, наконец, функциональное восстановление после шейки травмы спинного мозга.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже предлагается экспериментальный протокол был одобрен по уходу за животными комитет сети университета здравоохранения (Торонто, Канада) и в соответствии с политикой, установленной в руководстве по уходу и использованию экспериментальных животных, подготовленных Канадский совет по уходу за животными ,

1. шейки аневризмы клипа Ушиб / Сжатие Модель

1. Перед операцией автоклав инструменты и держать в стерильных условиях в течение всего surgcial процедуры, поставив инструменты в спиртовой ванны 70%.
2. Анестезировать крыс линии Вистар (250-270 г) с комбинацией кислорода (O _2), закись азота (N ₂ O) (1: 1), и 1,8-2,2% изофлуран и поддерживать спонтанное дыхание с помощью газовой анестезии маски. Для индукции анестезии начать с 5% изофлуран в течение 1 минуты, и после этого уменьшают. Перед началом операции, контроль глубины анестезии, давая болезненный стимул (например. На лапах). Применить жирные мазив глазах, чтобы избежать сухости и предотвратить последующие инфекции.
3. Положите крыс на отопление подушки (37 ° C) и зафиксировать голову в стереотаксической рамы.
4. Бритье хирургического область вокруг шейного отдела позвоночника и дезинфекции иодповидон и 70% спирта.
5. Сделайте срединный разрез над позвоночника от шейного позвонка (С2), достигающей выдающегося отростка грудной тела позвонка 2 (T2).
6. Вырезать через внешний слой позвонков мышц непосредственно по средней линии (чтобы избежать кровотечения) в черепно-каудальном направлении и далее анализировать глубинные слои мышц прямо, пока не достигнете Остистый отросток и пластинки. Вставьте преднатяжителями.
7. Ориентировать важную Остистый отросток Т2 позвонка тела, чтобы наблюдать целевых уровней для ламинектомии. После идентификации и микро-хирургическая подготовка выбранного пластинок, разрезать ligamenti flavae, чтобы ослабить пластинки и Остистый отросток. Наконец, сут через пластинки с костью машинки сбоку от спинного мозга и удалить те осторожно, избегая каких-либо сжатие самого спинного мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее распространенные уровни C5 / 6, C6 / 7, или C7 / T1. Скорость, госпитальная летальность возрастает более ростральной уровня травмы. Кровотечение из паравертебральной венозного синуса является общим и может быть решена путем тщательного сжатия с губкой.
8. Перед установкой клип травмировать мозг, выявлять новые нервные корешки, чтобы избавить их от отсечения (особенно на уровне С5 / 6).
9. В целях обеспечения бесперебойной индукции клип, ослабьте брюшной твердую мозговую оболочку от спинной стороне тел позвонков с крюком и подготовить коридор для клипа.
10. Наконец, вставьте Open Clip и пусть он захлопнуться (быстрое закрытие) для достижения травмы ушиб. Клип сила закрытия и продолжительность закрытия клипа определить интенсивность травмы и степень сжатия. Обычно используемые клип силы между 15-35 г и clippiнг продолжительность, например, 1 мин. (Рисунок 1).
11. После удаления клипа, адаптировать мышцы в 2 слоя и закрыть рану.
12. Стоп анестезии и пусть животных проснуться под постоянным наблюдением, пока он не восстановит достаточное сознание грудины лежачее положение. Положим, наконец, крысу в одном клетку и следовать послеоперационные рекомендации по лечению.
13. Так как животные бороться с тяжестью этого типа травмы, необходимо обратить особое внимание на послеоперационных процедур:
    1. Администрирование болеутоляющие средства (бупренорфин и мелоксикам в течение 3 дней и 5 дней, соответственно, и в соответствии с клиническими симптомами).
    2. Дать дополнительные подкожно физиологический раствор в течение 3 дней (2 раза в день, 5-10 миллилитров (мл)).
    3. Обеспечить антибиотики в питьевой воде за 2 дня до и до 7 дней после операции (например, Moxifloxacine)
    4. Сожмите мочевого пузыря 2-3 раза в день до тех пор, восстановление функции мочевого пузыря не является постояннымLY очевидной.
    5. Соблюдайте неврологические дефициты и физиологическое состояние оперированных животных, по крайней мере один раз в день.

2. Потребители инъекционных соки и NPC (через 14 дней после травмы)

1. Анестезии, как описано в 1.1. 1.3, исправить голову крысы в ​​стереотаксической рамы, удалить швы или раны клипы и дезинфицировать рану и хирургическую область с повидон йода и 70% спирта.
2. Осторожно вскрыть паравертебральных мышц, вставьте преднатяжителями, удалить рубцовую ткань под микроскопом из твердой мозговой оболочки, и вновь подвергать месте повреждения.
3. Подготовка ПСП в концентрации 1% (вес / объем), чтобы выполнить внеклеточного матрикса гел. QL6 ПСП имеет физиологически совместимый рН и не должны быть помещены в буфер перед инъекцией. Для визуализации ПСП в спинном мозге, использования флуоресцентного производной от QL6 (QL6-FITC).
4. Вводят ПСП (5 микролитров (мкл) в центр поражения, распределенной в 2 частей, каждая2,5 мкл двусторонняя от средней линии. Использование шприца Гамильтона, соединенный с стереотаксической рамы с микро стеклянный капилляр (100 мкм (микрон) наружный диаметр (OD)). Открыть твердую мозговую оболочку тщательно кончиком острой иглой, и вставить стеклянный капилляр стереотаксически 2 миллиметра (мм) в травмированной спинного мозга.
5. После введения 1/3 объема, извлеките иглу до 1,5 мм глубиной, и после дальнейшего 1/3 до 1 мм. После инъекции по всему объему, а перед удалением шприц, подождать 5 минут для стабилизации гелеобразования.
6. Для создания НПС, используйте мышей взрослых Dsred (или YFP положительных мышей, зеленый) и изолировать и культивировать их из paraventrical зоне ^4,18,21.
7. Оценка жизнеспособности НПС путем окрашивания трипановым синим, свидетельствующих о наличии ~ 90% живых клеток в клеточной суспензии. Развести клеток в среде роста (50 х 103 живых клеток / мкл), а затем использовать их для трансплантации клеток.
8. Сделайте четыре 2 мкл (8 мкл Общий во-Луме, содержащий 4 х 10 ⁵ НПС) в спинной инъекции на двусторонней основе на 2 мм ростральных и хвостового от места повреждения. После открытия твердой мозговой оболочки, вставить Гамильтон микро стеклянный капилляр 1,5 мм ниже дорсальной поверхности спинного мозга и придать 2 мкл клеточной суспензии. Выберите скорость впрыска в 0,5 мкл / мин (мин).
9. В конце каждой инъекции и до удаления капилляра из розетки, подождите, по крайней мере, 1 мин, позволяя ткани растяжения для размещения нового тома клеток. (Рисунок 2)

3. Имплантация субдуральной Насосы для фактора роста применения

1. Для того, чтобы обогатить спинномозговой жидкости (ликвора) с факторами роста поддержки выживания клеток, используйте микро-осмотического насоса разжижающие факторы роста суб-durally всей 7-14 дней, при скорости разбавления 0,5 мкл / ч, диаметр катетер 0,04 см OD, и объем резервуара 100 мкл.
2. Выберите предпочтительные факторы роста(Например, мозга фактор роста (BDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF)), заполнения насосов 6-10 ч перед имплантацией, и уравновешивают насосов на водяной бане при 37 ° С.
3. Сразу после NPC инъекций, подготовить подкожную выемку для размещения насоса. Предпочтительные места являются боковые фланги thoraco- брюшной области, избегая крупных местных дискомфорт, вызванный самого насоса.
4. Чтобы получить самую высокую концентрацию факторов роста, гарантировать, что открытый кончик катетера недалеко от концов в месте повреждения. Таким образом, выполнить с пропуском ламинэктомии прилегающей верхней или нижней уровне. Например, если ТСМ по крайней C7 / T1, выполнить небольшую ламинэктомии С5.
5. Поставьте насос в подкожной нише, сократить катетера нужной длины, и закрепите его с несколькими швами (6,0) на паравертебральных мышц, избегая любого движения, связанные дислокации.
6. После открытия твердую мозговую оболочку (например, у С5), с острым кончикомиглы, ввести катетер в субдуральных пространстве и пусть он скользит в каудальном направлении без какого-либо сопротивления и без повреждения шнура. Пропускаются пластинка, например, С6 служит дополнительной точкой фиксации и стабилизации катетера.
7. Убедитесь, что катетер проходит гладко и не раз.
8. Закрыть мышцы за слоем, и кожей, со швами или клипов. (Рисунок 3)
9. Стоп анестезии и пусть животных проснуться под постоянным наблюдением, пока он не восстановит достаточное сознание грудины лежачее положение. Наконец, положил их обратно в одном клетку и следовать послеоперационные рекомендации по лечению.
10. Оказывать специальную послеоперационного лечения, хотя, животные, возможно, восстановленный частично в это время точки:
    1. Администрирование болеутоляющие средства (Buprenorthine и мелоксикам в течение 3 дней и 5 дней, соответственно, и в соответствии с клиническими симптомами).
    2. Обеспечить антибиотики в бутылки с водой за 2 дня до до7 дней после операции (например, Moxifloxacine).
    3. Продолжить сжимая мочевой пузырь, если по-прежнему необходимо.
    4. Дайте дополнительные подкожные жидкости, если крысы появляются обезвоживание.
    5. Держите наблюдать неврологическую функцию и физиологическое состояние оперированных животных, по крайней мере один раз в день.
    6. Администрирование лечения иммуносупрессии за 2 дня до инъекции NPC и до 7 дней после пересадке (миноциклин) и до жертвы (SANDIMMUNE), соответственно.

Оценка 4. тканей

1. Жертву животных в конце времени наблюдения (например. 4 недели после ТСМ) в глубокой анестезии (5% изофлуран в течение 2-3 мин) и заливать их транскардиальную с 50 мл холодного (4 ° С) растворе с последующим 150 мл холодной 4 % параформальдегида в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS).
2. Удалить спинной мозг и поместить его в 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 24 ч.
3. Положите спинного мозга в 25% растворе сахарозы для криозащиты в течение 48 часов.
4. Обеспечить продольные криосрезы с толщиной <30 мкм.
5. Для иммуногистохимического окрашивания всех клеток-ядер, обеспечивающих фона использовать DAPI (1: 1000). DsRed положительные персонажи появляются красные, QL-6 FITC появляется зеленый, и оба, таким образом, не нужно быть окрашены специальным образом. (Рисунок 4).
6. Для сканирующей электронной микроскопии (SEM) Пусть образцы замочить в глутаральдегидом при 4 ° С в течение 2 ч, обезвоживают их медленно с шагом в 10% приращения этанола в течение 5 мин и поместите их в жидкость под давлением CO ₂ сифона в течение 1 часа. Пальто леса с золотом с использованием распылением для нанесения покрытий. Съемку с Hitachi S-3400N сканирующего электронного микроскопа. (Рисунок 5)

Результаты

При выполнении описанного выше процедуру, вы получите каркас SAP Преодоление полость и предлагая улучшение тормозного окружающей среды, меньше ткани пугать и увеличение NPC выживания. Рисунок 4 показывает продольный разрез спинного мозга крысы, полученной при травмы сайт 6 н?...

Обсуждение

Этот протокол был разработан, чтобы позволить читателю выполнить шейки модель травмы у крыс и использовать комбинированное лечение подход с ПСП и NPC, способствующих лучшему восстановлению после шейки ТСМ.

В частности, по сравнению с другими шейки матки моделей травм, та...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aneurysmal clip	SharpTech
Surgical microscope	Leica
Micro injection system	World Precision Instruments, Inc.
Small animal stereotaxic instrument	David Kopf Instruments
Hamilton syringe	Hamilton company
Subdural pumps	Alzet osmotic micro pump 1007D
Surgical instrument	Fine Science tools
Isoflurane USP	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0.9% Sodium Chloride injection USP	Baxter
7.5% Povidone iodine	Purdue Pharma
70% Isopropyl alcohol USP	GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP	Covidien
0.4% Trypan blue	Gibco
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)	Sigma
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma
Fibroblast Growth Factor (FGF)	Sigma