Возможно данио рерио Модель поликистоза почек: Нокдаун<em&gt; Wnt5a</em&gt; Причины кисты у рыбок данио почек

Резюме

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Аннотация

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Введение

Данио рерио (Danio rerio) эмбрионы были широко используется в качестве модели для изучения развития почек и поликистоз почек. Есть много преимуществ в использовании данио в качестве животной модели: технико-экономическое изучения генетических взаимодействий, способность использовать антисмысловые Morpholinos (MO) для белка нокдаун, возможность быстро пробирной большое количество эмбрионов, и легкость просмотра органов фенотипы в жить личинки ^1. Предпочка является первым почек развивать у позвоночных и функционально в личиночной рыбок данио ^2. Структура данио предпочки относительно проста по сравнению с metanephros млекопитающих, третий и последний почек развивать у млекопитающих. Нефрона является рабочий блок почки, с каждой почки человека, содержащей от ^3,4 500,000-1,000,000 нефронов и каждой мыши почки, имеющей приблизительно 13000 нефронов ^5, что делает его трудно наблюдать единую структуру нефрона яN человека или мыши почки. Данио имеет только два нефронов, и каждый данио нефрона содержит все основные компоненты, найденные в клубочек и канальцев мышей и человека ⁶ и аналогичных специализированных видов почечных клеток. По сравнению с другими моделями позвоночных, таких как Xenopus, данио нефрона больше напоминает нефрона млекопитающего, поскольку она имеет закрытую систему ^7.

В последние годы, данио геном был секвенирован, что позволяет обеспечить широкое введение генетических средств, обширные мутантных ресурсов и коллекций трансгенных репортерных линий в данио моделей. Данио предпочки формы между 12-72 ч после оплодотворения (ФВЧ) и могут быть легко визуализированы в прозрачных эмбрионов. Опухоль Белок Вильмса WT1 является существенным фактором для развития почек. Трансгенные линии, экспрессирующие данио зеленого флуоресцентного белка (GFP) под контролем промотора в wt1b Tg (wt1b: GFP), показывают, GFP expreделения специально расположен в pronephric регионах у эмбрионов данио рерио, начиная с 17 часов после оплодотворения ^8. Nephronophthisis (NPHP), аутосомно-рецессивный поликистоз почек, вызывается мутациями NPHP генов ^9. NPHP4 нокдаун в морфолино- вызвало образование кисты в TG (wt1b: GFP). Рыбу ¹⁰ Таким образом, эта трансгенная рыба подходит модель для наблюдения структуры почек и образованию кист во время развития почек. Важно отметить, что влияние модуляторов развития почек могут быть изучены с использованием этого штамма в времени и труда эффективным образом.

Наша статья описывает использование ТГ (wt1b: GFP) рыбы в качестве модели для визуализации формирование почек кисты после генной модуляции. Мы использовали пуско-и сайту сплайсинга, анти-смысл МО, чтобы сбить ген Wnt5A у рыбок данио. Wnt5a является неканонической секретируется гликопротеин из семейства Wnt, который играет важную роль в развитии различных органов и послеродовой сотовойФункция ^11. Wnt5a работает через неканонических Wnt путей, в том числе плоской клеточной полярности (PCP) пути, который был найден, чтобы играть важную роль в ориентированной клеточное деление в процессе почечных канальцев удлинения. Wnt5a регулирует Wnt / PCP путь, формируя комплекс с рецептором, как тирозинкиназы (Ryk), который дополнительно преобразовывает сигналы Wnt5a путем образования комплекса с плоской VANGL клеточной полярности белка 2 (Vangl2), тем самым способствуя стабильности Vangl2 ^12. Дефекты в PCP пути может привести к разделению случайной клеток и вызывать образование почечных кист. Мы использовали Tg (wt1b: GFP) данио линию наблюдать формирование почек кисты после Wnt5A нокдаун. Tg (wt1b: GFP) данио модель позволяет живого изображения и своевременной наблюдение структуры почек. После Wnt5A нокдаун, формирование почек киста была обнаружена, начиная с 24 часов после оплодотворения; в 72 часов после оплодотворения, кисты могут быть найдены в клубочках и проксимальных канальцах. Этот метод также может быть использован для SCreen другие гены, которые могут привести к образованию почек кисты.

протокол

О себе Этика:: Примечание Все данио эксперименты были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Восточной Вирджинии медицинской школы в.

1. Морфолино Подготовка

1. Дизайн и синтезировать перевод блокирующие (ческого увеличения) и сплайсинга ингибирования (сращивания) анти-смысл морфолино (MO) олигонуклеотиды для интересующего гена в соответствии с указаниями изготовителя (рис 1а). Пожалуйста, смотрите информацию изготовителя в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: МО поставляются в виде лиофилизированных запасов в стеклянных бутылках.
2. Добавить полноценный стерильную воду в стеклянных бутылках, чтобы повторно приостанавливать МО до конечной концентрации 25 мкг / мкл. Убедитесь, что олигонуклеотид полностью не растворится. Если некоторые твердые остатки, нагреть флакон фондового олигонуклеотидную решение в 65 ° С в течение от 5 до 10 мин, а вихрь кратко.
3. Храните маточного раствора МО при комнатной температуре. Не следует хранить их при 4 ° С или -20 °С, так как при более низких температурах может привести олигонуклеотид МО связываться с стенки контейнера. Измерьте концентрацию раствора с помощью спектрофотометра (см табл.1) каждый раз новый MO исходный раствор.
4. Приготовления рабочего раствора MO в день инъекции разбавлением исходного раствора с высококачественной стерильной водой до желаемой дозы. Добавить 0,5% фенола-красного до достижения концентрации 0,05%. Например, чтобы сделать 5 мкл рабочего раствора с концентрацией 15 нг / нл, добавить 3 мкл исходного раствора MO и 0,5 мкл 0,5% фенола-красного до 1,5 мкл воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При этой рабочей концентрации, каждая капля (500 ФЛ) инъекций содержит 7,5 нг МО и две капли содержат 15 нг МО.

2. Получение инъекционного устройства

1. Покупка стекла предварительно вытащил иглы (см таблицу 1 для получения более подробной информации). Кроме того, вытащить иглу Wi впрыска стеклаго иглы съемник.
2. Включите компрессор воздуха и регулировать величину до 50 фунтов на квадратный дюйм давления. Включите рассекает микроскопа источника света и Пико микро-топливного насоса и настройте параметры следующим образом: удерживая давление 20 фунтов на квадратный дюйм, извлеките давление 10 фунтов на квадратный дюйм, период значение 2,5 и 100 мкс диапазоне стробирования.
3. Загрузите стеклу, предварительно вытащил иглу с 5 мкл раствора для инъекций и поместите иглу в вертикальном положении с острием вниз. Подождите, пока весь раствор не достигнет кончика иглы без видимых пузырьков воздуха. Установите держатель иглы в соответствующем положении рядом с микроскопом и вставьте стекло иглу в держатель. Регулировка угла впрыска до 45 градусов.
4. Принесите наконечник в целях иглы под микроскопом, высоко над сценой, и сосредоточить внимание на самой тонкой области кончика. Перерыв с кончика иглы с тонкой точечных пинцетом.
5. Поместите линейку и капиллярную трубку с внутренним диаметром 0,15 мм бок о бок под микроскопом;инъекции раствора в один конец капиллярной трубки, чтобы столб жидкости. Отрегулируйте время извлечения для достижения каждые 17 капель в 1 мм колонке длина жидкой, то объем каждой капли 1 п (объем капли = π х ² радиус х длина (от столба жидкости) / кол-во (капель).
   Примечание: падение с диаметром 0,1 мм дает объем впрыска около 500 мкл (объем капли = 4/3 х π х радиус ^3).

3. Подготовка оплодотворенной эмбрионов данио рерио и впрыска с Morpholinos

1. Настройка Tg (wt1b: GFP) трансгенные данио гнездящихся пар в соответствии с опубликованными протоколами для стандартной данио хозяйства и технического обслуживания. Сбор эмбрионов после стихийных икры, и держать их в 10 см чашку Петри, заполненную E3 воды (5 мм NaCl, 0,17 мм KCl, 0,33 мМ CaCl _2, 0,33 мМ MgSO _4). Начните МО инъекции сразу ^13. Монитор эмбриона морфологии под микроскопом и убедиться, что инъекции МО на одно-стадия ячейку, либо не позднее стадии четыре клетки.
   1. Трансфер эмбрионов в 10 см чашки Петри с клиновидным агар впадин. Аспирируйте дополнительный E3 воду и слегка нажмите эмбрионов в желобов.
   2. Манипулировать эмбрионов с микропипеткой для визуализации эмбрионов 1-клеток сцене под рассекает микроскопом. Проникнуть хориона и затем желток придать одну или две капли МО в желток (1 капле = 500 PL). Передача инъекционные эмбрионов в 10 см чашки Петри с E3 воды и инкубировать при 28,5 ° С.
2. После инъекции, удалить мертвые эмбрионы и записать число вводимых эмбрионов. Замените воду E3 в блюдо каждый от 24 до 48 ч.

4. Фенотип Спасательные Эксперименты

1. Выберите ортолог от других видов, что имеет другой первичный пар оснований ее структуре (обычно 3-7 пар оснований несоответствия) и, следовательно, устойчивых к МО, для спасения. Например, в этом эксперименте мы выбралимыши, потому что последовательность мыши Wnt5a мРНК отличается от данио последовательности.
2. Разработка набора праймеров с прямой праймер, начиная с поступательным сайта и обратного праймера в непосредственной близости от конца кодирующей области мРНК. Добавить последовательность промотора Т7 в 5'-конце последовательности праймера вперед. В этом эксперименте мы использовали следующие последовательности праймеров; вперед: 5'-НТО TAC ПКК TCA кту тег GGA кту TGA ТГК ТГК TGA AGC TGA а- 3 'и обратного: 5'-TCA СТТ ГПК ПКК GTA CTG gtc- 3 ».
3. Выполнение 50 мкл полимеразной цепной реакции (ПЦР) с набором праймеров (0,5 мкМ каждого праймера) предназначен выше и 0,1 мкг матричной ДНК, содержащей мыши Wnt5a кДНК последовательность со следующей программой: ПЦР 1 цикл при 95 ° С в течение 5 мин; 35 циклов 95 & deg; С (30 сек), 58,5 ° С (30 сек), 72 & deg; С (1 мин); и заключительный шаг удлинение при 72 ° С в течение 7 мин.
4. После окончания тон цикл, запустить 2 мкл ПЦР-продукта на 1% агарозном геле, чтобы убедиться, полоса правильный размер. Очищают продукт ПЦР с ПЦР-набор для очистки в соответствии с инструкциями изготовителя. Проверка концентрации ДНК с помощью спектрофотометра. Хранить очищенный продукт ПЦР при -20 ° С или непосредственно использовать в ограничен транскрипции РНК на следующей стадии.
5. Обобщить в пробирке с крышкой мРНК с ограничен набором синтеза РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести мРНК в 20 мкл РНКазы свободной воды и определить концентрацию. Алиготе РНК и хранить при температуре -80 ° C.
6. В день инъекции, подготовить рабочий раствор мРНК с РНКазы свободной стерильной воды. Следует отметить, что 40 мкг, как правило, высокие дозы РНК, при которой не происходит неспецифические или токсические эффекты РНК. Держите рабочий раствор на льду. Вводите эмбриона с МО, а затем спасательную мРНК, или совместно вводить оба вместе. Например, если концентрация мРНК В ведениеред на этапе 4,5 0,6 мкг / мкл, добавить 0,67 мкл мРНК (0,4 мкг) с 4,33 мкл РНКазы свободной воды, чтобы получить конечную концентрацию 0,08 мкг / мкл, а затем одну каплю (500 мкл) из каждой инъекции содержит 40 стр мРНК. Подготовка MO, как описано в шаге 3.

5. Подготовка закачанного эмбрионов для флуоресцентных изображений

1. После инкубации при 28,5 ° CO / N, добавить 0,003% N-фенилтиомочевины (ПТУ) в воде E3, чтобы предотвратить меланизации, который влияет на наблюдение структуры предпочки с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако, не добавляйте ПТУ до гаструляции, потому что это влияет на раннее эмбриональное развитие.
2. В 48 часов после оплодотворения, вручную dechorionate эмбрионов с мелкими пинцетом. Выполняйте съемку 48 и 72 часов после оплодотворения эмбрионов под световым микроскопом рассечение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фотографии могут быть приняты без анестезии.
3. Около 10 минут до визуализации под флуоресцентным микроскопом, обезболить эмбрионов, помещая их в10 см чашку Петри, содержащую 160 мкг / мл забуференного Tricaine. Подождите 5-10 минут, а затем они слегка касались данио, чтобы подтвердить, что они не двигаются, и поэтому анестезия работает.
4. После того, как эмбрионы под наркозом, смонтировать их в 3% растворе метилцеллюлозы и ориентировать их в положении лежа при вскрытии микроскопа (пожалуйста, обратитесь к таблице 1).
5. Обратите внимание на структуру предпочки под флуоресцентным микроскопом (пожалуйста, обратитесь к таблице 1) и сфотографироваться на разных увеличениях (10x и 20x).

Результаты

Wnt5a сбить была достигнута путем введения перевод блокирующий МО (август-MO) или экзон / интрон границы сращивания MO (разъем-MO), чтобы эмбрионов данио на стадии одной клетки. Авг-мишени из стартовый кодон и, следовательно, ингибирует матери и зиготического сообщение Wnt5A. Сплайсинг?...

Обсуждение

Поликистоз почек (ДОК) является одним из ведущих причин терминальной стадии почечной болезни у людей и характеризуется образованием прогрессивной кисты, почечной расширения, и аномального развития канальцев ^14. Аутосомно-доминантное PKD (ADPKD) является генетическим заболеванием, в ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop