<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Лазерно-индуцированное Травма спинного мозга модель для оценки Механизмы дегенерации аксонов в режиме реального времени

Резюме

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Аннотация

Пострадавшие аксоны ЦНС не восстановить, и часто отказаться от места повреждения. Аксоны избавлены от первоначальной травмы в дальнейшем могут подвергаться вторичной дегенерацию аксонов. Отсутствие образования конуса роста, регенерации, и потери дополнительных миелиновых аксонов прогнозов в спинном мозге значительно ограничивает неврологического восстановления после травмы. Для оценки центрального миелиновые аксоны спинного мозга реагировать на травмы, мы разработали экс естественных условиях живут спинного модель мозга с использованием трансгенных мышей, которые выражают желтый флуоресцентный белок в аксоны и очаговых и хорошо воспроизводимый лазерно-индуцированной травмы спинного мозга к документу судьбу аксонов и миелина (липофильные флуоресцентный краситель Нил красный) с течением времени с использованием двух-фотонной возбуждения покадровой микроскопии. Динамические процессы, такие как острый аксонов травмы, аксонального втягивания и миелиновой дегенерации лучше всего изучать в реальном времени. Тем не менее, без очаговый характер контузии основе травм и артефактов движения столкнулсяво в естественных условиях спинного изображения шнур марки дифференциации первичных и вторичных аксонов ответов травмы, используя микроскопия высокого разрешения сложной задачей. Экс естественных условиях модель спинного мозга, описанный здесь имитирует некоторые аспекты клинически значимых контузии / сжатия, вызванного аксонов патологий, включая аксонов отек, сфероида образования, аксонов перерезки и пригородных аксонов отек обеспечивая полезную модель для изучения этих динамических процессов в режиме реального времени. Основные преимущества этой модели отлично пространственно-временной резолюции, который позволяет дифференцировать между первичной оскорбление, которые непосредственно повреждает аксоны и механизмы вторичного повреждения; контролируется вливания реагентов непосредственно в перфузат купания мозга; точные изменения в экологическом среде (например, кальция, ионы натрия, известные вкладчики аксонов травмы, но практически невозможно манипулировать в естественных условиях); и мышиные модели также имеют преимущество, поскольку они обеспечивают возможность визуализации иманипулировать генетически определенных популяций клеток и субклеточных структур. Здесь мы опишем, как изолировать и изображение живых спинного мозга у мышей, чтобы захватить динамику острого аксонов травмы.

Введение

Вырождение аксонов из основных причин заболеваемости охватывающих несколько неврологических заболеваний, включая нейротравме, инсульта, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний. В отличие от периферической нервной системы (ПНС), центральной нервной системы (ЦНС) аксоны имеют ограниченные возможности к регенерации однажды ранил из-за как внутренних, так и внешних барьеров (например, тормозные молекул рост аксонов, образующихся при формировании рубцовой и выделяющейся при миелиновой дегенерации) ^{1 -7.} Хотя некоторые из этих барьеров были широко изучены, терапевтические мероприятия, направленные на предотвращения ЦНС дегенерацию аксонов, способствуют надежной регенерацию аксонов, и восстановить функциональную соединительно, остаются ограниченными.

Аксоны После отделения от их сомы пройти стереотипное процесс перерождения известного как валлеровский дегенерации, которая характеризуется аксонов отек, сфероида образования и в конечном итоге фрагментации (обзор ^8). Вконтраст, проксимальный культи, что остается в непрерывности с сомы о пересечённого периферической аксона, формирует отек на его конце, отмирает до ближайшей перехвата Ранвье, а затем может инициировать образование роста конуса, жизненно необходимым условием необходимым для последующей регенерации аксонов ^9-11. В отличие от этого, проксимальные аксонов окончаний многих центральных аксонов образуют характерные "endbulbs" или луковицы отвода не образуют конусы роста, и вместо того, чтобы убрать от места повреждения, где они остаются в течение нескольких месяцев после травмы ^12-15. В дополнение к основной аксонов травмы, дополнительное повреждение аксонов / потери могут также происходить в аксонов, которые были в значительной степени избавлены от начальной травмы. Это задержка аксонов потери изначально избавлены аксонов называют вторичной дегенерации аксонов. Это неотъемлемое ответ ЦНС аксонов травмы оказывает функциональных регенерации аксонов еще более труднодостижимой целью достижения в головном и спинном мозге.

Хотя гаllmarks аксонов травмы (например, сфероида образования, луковицы отвода) были охарактеризованы с посмертной ткани и экспериментальных моделей дегенерации аксонов, выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе этих динамических процессов была ограничена. Большинство этих исследований использовали такие статические конечных наблюдений, которые по своей сути не смогли захватить отдельные аксонов ответов с течением времени. Хотя экзогенно применяется аксонов индикаторы оказались полезными для выяснения ответов аксонов от статических разделов и во время живого изображения, наличие генетически кодируемых аксонов маркеров значительно улучшили нашу способность визуализировать аксоны в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Действительно, основополагающем докладе от Kerschensteiner и коллег-первых условии прямых доказательств дегенерации аксонов и регенерацию в естественных условиях с использованием Thy1 -GFP-S мышей, которые кодируют зеленый флуоресцентный белок в подмножеств нейронов, которые посылают свои прогнозы в спинной колонкам позвоночникашнур ^16. Живая съемка подходов с использованием двух фотонных лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM) и генетических флуоресцентный белок маркировки клеток, представляющих интерес продолжает оказывать прямое доказательство и механических понимание многих различных динамических процессов, таких как дегенерации аксонов, Ca ²⁺ сигнализации, регенерации аксонов, астроцитов физиологии, микроглии физиологии и ответ на повреждение ^17-25.

В отличие от аксонов, очень мало известно ответов миелиновых травмы в режиме реального времени. Миелин является жизненно важным компонентом белого вещества создан и поддерживается олигодендроцитах в клетках ЦНС и Шванновских в ПНС. Миелин изолирует 99% поверхности аксонов и тем самым обеспечивает высокую сопротивления, малой емкости защитное покрытие, которое поддерживает быстрое и эффективное Сальтаторные распространение импульса, недавно рассматривался Buttermore и др. ^26. Чтобы захватить динамические характеристики миелина на повреждение, мы используем сольватохромные, липофильныхфлуоресцентный краситель Нила Red ^27. Сольватохромных свойства этого витальной окраски позволяют спектральные сдвиги его спектра излучения, которая зависит от физико-химической среде ^28,29. Эти свойства полезны, чтобы разобраться в механизмах axomyelinic травмы и может быть визуализированы с помощью соответствующим образом выбранных дихроичными и фильтры выбросов или разрешено с помощью спектрального микроскопа ^27. Например, спектр излучения Найл Ред является сине-смещается в менее полярных липидов богатых средах, таких как те, что в адипоцитах и нормальной миелина ЦНС (максимум излучения ~ 580-590 нм) ^27. В отличие от этого, пики спектра излучения этой жизненно важной красителя по крайней ~ 625 нм endbulbs, образующихся в аксонов подвергаются аксонов отмирание ^27. Хотя точные механизмы, лежащие в основе этих спектральных сдвигов в частности, в endbulbs по сравнению с нормальной миелина остаются неясными, такие спектральные изменения могут выявить основные изменения в накоплении белка или дезорганизации, ведущего квоздействие гидрофобных сайтов связывания ^27.

В то время как изображения в естественных это конечная метрика для наблюдения спинного мозга динамику аксонов травмы в их родной среде, это технически сложным и требует значительных хирургического опыта, и часто повторяют операции, чтобы разоблачить спинной колонки, которые могут представить экспериментальные артефакты (например, воспаление рубцовой формирование). Кроме того, дорогостоящего оборудования часто требуется, чтобы подвески и позиционирование интактного животного под микроскопом объектива. Животные должны быть тщательно проверены, а чтобы они оставались теплыми, чтобы обеспечить жидкости пополняется, и гарантировать, что нет никаких признаков гипоксии из-за длительного наркозом сессий визуализации. Последнее чрезвычайно важно, так как аксоны и миелиновых абсолютно требует постоянного перфузии и адекватные уровни кислорода, чтобы оставаться жизнеспособными. Тем не менее, это часто не сообщается или контролируются в наиболее естественных условиях исследования вДата. Кроме того, артефакты движения из-за сердечного ритма и дыхания (ИФ анестезии взрослой мыши: ~ 300-450 ударов в минуту (BPM) является оптимальным для поддержания 97-98% насыщения кислородом (нормальная скорость ~ 632 BPM) и ~ 55-65 вдохов в мин (нормальная скорость составляет ~ 163 вдохов в минуту), соответственно)) ³⁰ столкнулись во время в естественных условиях спинного марки изображений шнур дифференциации первичных и вторичных аксонов ответов травмы при высоком разрешении флуоресцентной микроскопии трудно, так как даже самые быстрые лазерного сканирования неизбежно подчиняются этим движением артефакты. Успехи в сверхбыстрых резонансных сканеров в сочетании с имплантируемого твердого позвоночника в рамке окна может позволить визуализации мышиного спинного мозга у бодрствующих животных, но раз быстрее сканирования неизбежно уменьшить отношение сигнал-шум качество изображения унижающие. Дальнейшие улучшения в методах визуализации спинного мозга, в настоящее время используются для визуализации головного мозга может преодолеть многие из этих препятствий и ограничить потенциальные смешивает вносимые INAdequate тканевой перфузии, например, ^31-33.

Многое из того, что известно о белого вещества физиологии и механизмов белого травмы вещества была определена с использованием в пробирке или бывших естественных препаратов белого вещества из зрительного нерва, периферического нерва, и полоски спинного мозга белом веществе ^34-41. Эти препараты продолжают продвигать наши знания о белых механизмов травмы от того, как они позволяют контролируются изменения в экологических факторов, контролируемое применение лекарственных препаратов и реагентов, функциональные оценок с использованием электрофизиологии, а прямые флуоресцентной микроскопии наблюдения аксонов и миелина в живой ткани. Тем не менее, некоторые прежние подходы наблюдать аксоны от спинного мозга полос спинной колонки или брюшной полос белого вещества неизбежно травмировать поверхности аксонов на стадии удаления, которые могут повлиять на реакцию тесно отличие аксонов. Чтобы воспользоваться экспериментальными манипуляции над и избежать повреждения веRy волокна под следствием, мы используем Экс Vivo шейного отдела спинного модель мозга, так как предотвращает непосредственный контакт спинной части мозга. Таким образом, архитектура мягкой мозговой оболочки и прилегающих поверхностной дорсальной аксонов столбцов остаются жизнеспособными и невозмутимо во время изоляции.

Здесь мы описываем относительно простой подход, который позволяет непосредственно наблюдать центральных миелиновых аксонов, как они динамически реагировать на фокальной травмы в режиме реального времени до 8 - 10 + часов после травмы. Травмы спинного мозга (Lisci) модель лазерно-индуцированной позволяет дифференцировать между первичными и вторичными механизмов аксонов травмы, первичное поражение (абляции сайта) остается пространственно ограниченных во времени. Изображения камеры открытым ванна доступна терапевтического вмешательства, доставка реагентов и экологических манипуляций. Предполагаемые axomyelinic защитные агенты могут быть быстро оценены в реальном времени с помощью прямых наблюдений по сравнению с длительных и дорогостоящих экспериментов, связанных с процессом тканейING, секционирования, иммуноокрашивания, захват изображения, и анализ, и, следовательно, обеспечивает полезную суррогатной модели для оценки острых ответов и защитные манипуляции перед тестированием экспериментальные агентов в живых животных.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными уходу и использованию комитета Институциональная животных в университете Луисвилля, придерживаясь федеральных нормативных актов.

1. Подготовка Низкий Са ²⁺ и 2 мМ Са ²⁺ Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) Perfusates

1. Подготовка 2x низким Ca ²⁺ (0,1 мм) со С буфер, 2x нормально Ca ²⁺ (2 мм) со буфер и буфер 2x Stock B, как описано в таблице 1. Отдельные исходные растворы возможности изменения содержания ионов (например, низкий или нулевой Са ²⁺⁾ и может храниться при 4 ° С в течение до одного месяца.
2. Для внутрисердечного перфузией при вскрытии, добавить 100 мл 2 раза низкой Ca ²⁺ со С и 100 мл 2 раза со В в пластиковой бутылке, чтобы 1x низкой Ca ²⁺ ACSF. Смешивать и хранить в течение ночи при 4 ° С или сделать свежий.
3. Для перфузии Экс Vivo спинного мозга во время ИМАГING, добавить 500 мл 2 раза нормальной Ca ²⁺ запасе и 500 мл 2 раза со B в стеклянный флакон 1 л генерировать 1x ACSF. Смешивать и хранить в течение ночи при комнатной температуре или сделать свежий.
4. Отрегулируйте рН ACSF буферов до 7,4. При поддержании ACSF при комнатной температуре, поместить низкой Ca ²⁺ ACSF на льду, а затем пузырь как буферы с карбогена газа (95% O _2, 5% СО ₂₎ в течение 30 мин перед использованием, и непрерывно в процессе перфузии.

2. Подготовка Ex естественных изображений палаты

1. Оберните одеяло отопления (без автоматического выключение) вокруг бутылки ACSF и отрегулируйте температуру до низкого / среднего обстановке.
2. Вставьте специальный ACSF перфузии линии в бутылку, подключенного к перфузии насоса и в он-лайн нагревателем, который управляется с помощью биполярного регулятора температуры и обратной связи датчика температуры, как показано на рисунке 1А.
3. Прикрепите с плоским микроскопа этап вставки (152 х 102 мм) с 2-фотонного возбуждения / конфOcal микроскоп этап оснащены разлива контейнера.
4. Место большой открытой ванной перфузии камеры (Ш х Д х В, 12 х 24 х 8 мм) в сливной контейнер для размещения и обеспечения непрерывного потока свежего кислородом ACSF экс естественных спинного мозга (рис 1B подходящего экс естественных изображений конструкции камеры).
5. Подключите металлический порт выхода в линию отопительного экс естественных изображений камеры с помощью подходящую трубку. Место тонкий абсорбирующей прокладки под экс виво изображения камеры, чтобы помочь поддерживать температуру буферного / ткани во время съемки.
6. Придерживайтесь экс естественных изображений камеры в нижней части разлива контейнер / Stage вставки с помощью съемного липкий тактику. Податливость липкой липкости позволит камере быть скорректированы по мере необходимости, чтобы обеспечить путь света Цель состоит перпендикулярно к поверхности ткани. Если необходимо, используйте уровень бычий глаз, чтобы отрегулировать камеру.
7. Безопасныйв линию Датчик температуры обратной нагреватель вблизи впускной камеры жидкости и нержавеющей стали всасывающая трубка соединена с вакуумной линией на выходе из камеры. Магнитной ленте и необходимости микропипетка держатели полезны в этом отношении. Включите источником вакуума.
8. Включите перфузии насоса, чтобы начать заполнение изображения камеры с кислородом ACSF. Установите перфузии насос 1,5-2 мл в минуту.
9. Контроль объема ACSF в камере формирования изображения путем регулировки вакуумную линию. Важно, что есть достаточно ACSF в камере формирования изображения для покрытия спинного мозга сегмента и обеспечить достаточное рабочее расстояние между водой погружением цели и поверхностью ткани. Миелин и аксоны могут быть отрицательно затронуты, если сегмент ткани не полностью погружается в свежем кислородом ACSF приводит к экспериментатор-индуцированных артефакты.
10. Регулировка регулятор температуры нагревателя в линию таким образом, чтобы температура перфузат в камере формирования изображения находится вблизи комнатной температуры.

3. Вскрытие взрослых мышиный шейного отдела спинного мозга

1. Эвтаназии взрослого 6-10 недель старый Thy1 -YFP трансгенной мыши (использование соответствующего штамма, который имеет флуоресцентный экспрессию белка в заднекорешковых ганглиев) путем введения передозировки в анестезии пентобарбиталом натрия (200 мг / кг) через внутрибрюшинного введения.
2. После того, как под должном уровне анестезии (например, никакой реакции до пят крайнем случае и утрате мерцания рефлекса), осторожно побрить кожа, покрывающая спинного и головного мозга при хирургическом клиперов. Очисти кожу с помощью бетадин и 70% этанола колодки.
3. Спрей груди / живота с 70% этанола, а затем заливать тему транскардиальную использованием охлажденной, карбогена-ыми низкий Ca ²⁺ ACSF. (Смотрите рисунок 1С для предложенной вскрытия НАСТОЛЬНАЯ настроить).
4. Как бледнеет печени, обеспечить перфузии иглу в сердце с помощью небольшой клип. Поверните объект, чтобы получить доступ бритая спинной сторонеПредмет и протрите бритая зона с 70% этанола.
5. Сделайте надрез спинной кожи вдоль средней линии, начиная от носа до тазобедренного сустава с использованием рассечение ножницами, чтобы разоблачить мозга и позвоночного столба (рис 2а). Безопасный препарат путем размещения контакты в нос и бедро.
6. Использование рассечение микроскоп с этой точки зрения, твердо пересекают спинной поверхности черепа на уровне обонятельных луковиц. Вставка один из ножниц наконечниками в боковых краев разреза и разрезать вдоль краев тюбетейке билатерально до мозжечка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не полностью иссечь тюбетейку, как это понадобится в дальнейшем поднять лежащего ткани от спинного мозга на протяжении вскрытия (рис 2б).
7. Поднимите тюбетейку, чтобы разоблачить мозга. Аккуратно разрезать слева и справа края Кость инков (находится в мозжечке) и вытащить его обратно каудально, чтобы разоблачить ствола мозга / спинного мозга (рис 2С ).
8. Используйте точная наклоненная ножницы, проводимых под углом 45 ° к поверхности стола и разрезать позвонки на двусторонней основе только уступает корней задней нерва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегать контакта с яркими белыми колоннами спинных. Эти волокна являются те, которые будут в образ (рис 2D) и могут быть легко повреждены.
9. Поднимите тюбетейке и спинной поверхности позвоночного столба с тонкими наконечником пинцетом, осторожно потянув лежащего ткани в одно целое, как разрезы, чтобы обнажить спинного мозга. Продолжить, чтобы сократить позвонков к верхней грудной уровне, чтобы изолировать 1-2 см сегмент шейного шнура для последующей визуализации (рис 2E).
10. Используйте ножницы, чтобы вырезать ткань / кости параллельно позвоночнику и чистой ткани под колонны. Сделайте надрезы как можно ровнее. Очень важно, что ткань лежит плоско в камере таким образом, чтобы шнур уровня для визуализации.
11. Используйте # 11 скальпель, чтобы секут ствол головного мозга (в прошломпрекращение грацильных пучке волокон) и на верхнем уровне грудной изолировать шейного отдела спинного мозга (см рис 2F). Используйте ножницы, чтобы вырезать ткань / кость при тех же двух точках. Выделенную ткань должна содержать 2/3 позвоночного столба, охватывающей хвостовой ствол головного мозга, увеличение шейки и верхней грудного отдела спинного мозга (рис 2G).
12. Поместите изолированный позвоночник в чашку Петри с карбогена-ыми, охлажденной низкой Ca ²⁺ ACSF. При необходимости, обрезать ткань под позвоночника, пока он не станет плоской в ​​блюдо.
13. Передача изолированный позвоночник экс естественных изображений камеры и постепенно увеличивать Перфузат температуры в течение 1 часа до 36 - 37 ° C. Поддерживать эту температуру во время съемки.

4. Размещение Ex Vivo спинного мозга в визуализации палаты и миелина маркировки с видом на Нил красный

1. Тщательно закрепите позвоночный столб в Imaging камера с соответствующей арматуры ломтик удерживайте нажатой изменены с вертикальной сетки платформы, состоящей из мелких лайкры нитей (удалить средние нити сетки платформы, чтобы пространство для спинного мозга; рис 3а).
2. Оттепель аликвоту Нила Красный (5 мМ наличии в ДМСО и 0,22 мкм фильтруют; можно хранить в течение 1 месяца при 4 ° С, либо 6 месяцев при -20 ° C в темноте). Прежде, чем добавить Нила красного до изображения камеры, уменьшить поток перфузии насоса и отрегулируйте вакуумную линию, чтобы жидкость в камере всегда покрывает спинной мозг.
3. Добавить 5-10 мкл Найл Ред маточного раствора в камере формирования изображения вблизи хвостового конца шнура (фиг.3В). Используйте 1 мл пипетки осторожно перемешать Нила Красный всей камере. Разрешить Нила Red остаться в камере в течение 1-2 мин, затем поместите вакуумную линию возврата и регулировки перфузии насос 1,5-2 мл в минуту непрерывно заливать спинного мозга.
4. Осторожно поднимите столик микроскопаи выровнять цели с центром спинного мозга сегмента и медиально по столбцам спинных, пока вода не иммерсионный объектив примерно 10 мм от поверхности ACSF в камере. Использовать микроскоп револьверная головка фокусировки колесо медленно довести цели, пока она слегка касалась поверхности ACSF. Используйте эпифлуоресцентной источник света, чтобы сосредоточиться столбцы спины в поле зрения (рис 3C).

5. Ex Vivo Визуализация мозга мыши спинного с TPLSM и лазерно-индуцированной повреждением спинного мозга (Lisci)

Примечание: Задняя вены обеспечивает полезный маркер для центрирования ткани, как грацильными пучке волокон (происходят из тела клетки из ганглиях задних корешков и подниматься из Т6 и ниже вдоль средней линии спинного мозга) проходят параллельно этой кровеносного сосуда. Более толстые YFP ​​+ шейки зуба прогнозы спинные также обеспечивают полезный маркер, как поднимаются волокон и спуститься с боков к YFP + грацильный пучке волокон, которые меньше в диаметре.

1. После того, как ткани спинного мозга выравнивается надлежащим образом, переключение в режим лазерного сканирования для выполнения базовой визуализации восходящих худой пучке миелиновых волокон. Для возбуждения как YFP и Найл Ред, использовать двухфотонный лазерный источник, настроенный на длину волны 950 нм (~ 17 мВт, измеренного на выходе из 25X, 1,1 Н. объективной) и соответствующих дихроичными (СД) и полосовых фильтров для изоляции флуоресцентное излучение флуорофоров (мы используем 525/50 DM560, DM640 600/60 и 685/70, отделить YFP, и Найл Ред в желто-оранжевый, и расширенные красного каналов, соответственно).
   1. Если более чем на 3% из аксонов показать аксонов сфероидов в течение базового томографии (30-60 мин), отбросить подготовку за счет экспериментатора-индуцированной артефактов.
2. Вызвать Lisci, увеличивая поле зрения до 30.3X (для создания диаметр абляции ~ 20 мкм). Tune лазер 800 нм, а также увеличить мощность лазера до ~ 110 мВт приобразец. Разрешить 5 полное поле зрения лазерного сканирования для обеспечения волокна полностью перерезана.
3. Подтвердите Lisci, изменив настройки лазерные вернуться к настройкам визуализации (950 нм, 17 мВт на образец, 2.08X) и сканировать ткани для визуализации абляции. Проверка диаметр абляции и что первичные удалена аксоны полностью перерезана (рис 3D). Используйте настройки покадровой на микроскопе в сочетании с захватом г для записи динамических характеристик аксонов и миелина-за травмы до 8-10 + часов после травмы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если удаление является неполной (то есть, неполная рассечение волокон), отказаться от подготовки, как определение механизмов первичного и вторичного повреждения будут посрамлены. Кроме того, отдельные сегменты спинного мозга могут быть отображены до 24 ч после Lisci только с легкой до умеренной Lisci независимую повреждения тканей.

Результаты

Подробная информация о соответствующем лаборатории, созданной необходимого для изоляции, поддерживать жизнеспособность, и изображения экс естественных спинного мозга показано на рисунке 1. Микроскоп должен быть оборудован настраиваемым импульсным фемтосекундного лаз...

Обсуждение

Мы описываем метод визуализации Экс Vivo спинного мозга мякотных аксоны (то есть, худой пучке) в сочетании с повреждением спинного мозга лазерно-индуцированной исследовать динамические прогрессии как первичного, так и вторичного миелиновые аксонов дегенерации с течением врем...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin