JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Аннотация

Визуализация нейронных проекций полнометражных эмбрионов необходимо получить представление о том, как у млекопитающих развивать нейронных сетей. Здесь мы опишем метод маркировать на месте подмножество спинной ганглий корень (DRG) аксонов прогнозов для оценки их фенотипические характеристики, используя несколько генетически модифицированных линий мышей. В TrkA-положительных нейронов нейроны ноцицептора, предназначенные для передачи сигналов боли. Мы используем мыши линии TrkA taulacZ для обозначения траектории всех TrkA-положительных периферийных аксонов в неповрежденной эмбриона мыши. Мы дополнительно разводить TrkA taulacZ линию на Bax нулевой фон, который, по существу отменяет апоптоза нейронов, с целью оценки роста, связанных с вопросы независимо от возможных последствий генетических манипуляций на выживание нейронов. Впоследствии, генетически модифицированные мыши, представляющие интерес, разводят с TrkA ЦаулACZ / Bax нулевая линия и готовы для исследования с использованием методов, описанных в данном документе. Данная презентация содержит подробную информацию о планах мыши размножения, генотипирование на момент вскрытия, подготовки ткани, окрашивание и очистки, чтобы для визуализации полнометражных аксонов траекторий в целом монтажа подготовки.

Введение

Установление точного нейронных сетей представляет собой сложный процесс развития необходимы для функциональности нервной системы. Нарушение этого процесса приводит к нейронной дисфункции, который был вовлечен в неврологических заболеваний человека 1-3. Для изучения основополагающих молекулярных механизмов роста аксонов и целевой иннервации у млекопитающих, мы разработали протокол для визуализации аксонов траектории TrkA-выражения сенсорных нейронов, используя комбинацию из двух генетически модифицированных линий мышей.

TrkA является рецептором для фактора роста нервов NGF и функциональный маркер ноцицептивных сенсорных нейронов 4. TrkA высоко экспрессируется в ноцицептивных нейронов во время раннего развития и посредником NGF-зависимое выживание нейронов, роста аксонов, разветвление и целевой иннервации 5-9. У мышей TrkA taulacZ, дикого типа гена TrkA заменен экспрессии taulacZ сassette 10, таким образом, что аксонов морфологии предполагаемых TrkA-позитивных нейронов могут быть визуализированы с помощью β-гал (X-GAL) окрашивания 11. Использование гетерозиготную линию TrkA taulacZ / WT, мы можем рассмотреть факторы, которые могут регулировать или помешать с развитием сенсорных афферентных проекций в естественных условиях.

Кроме того, выражение TrkA отсутствует у гомозиготных мышей TrkA taulacZ / taulacZ, которые, следовательно, могут быть использованы для оценки роста аксонов способствуя механизмов в отсутствие ФРН сигнализации / TrkA. С ноцицептивных нейронов зависит от NGF / TrkA сигнализации не только для роста аксонов, но и для выживания, мы используем другую линию мыши, не имея проапоптотического ген Bax, ингибируют апоптоз в эмбриональных нейронов DRG, спасая их от гибели клеток, что в противном случае наблюдается при отсутствии сигналов TrkA. Вах - / - фон 12 Таким образом, позволяет molecuLAR рассечение пути, непосредственно затрагивающих аксонов 7-9,13-15 роста сигнализации. В TrkA - / -: Вах - / - мышей, DRG нейроны выжить, но сенсорная афферентная иннервация в коже полностью отменена 14,15. Мы можем избирательно активировать сигнальные пути, чтобы определить их соответствующие взносы в развитие аксонов прогнозов. Полезность этого метода является то, что он позволяет оценить изменения в аксонов фенотипов роста, когда различные генетические модификации разводят на TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / - или TrkA taulacZ / WT: Вах - / - фоны.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры соответствовали требованиям Руководства NIH для использования и ухода за лабораторными животными. Протокол животное было одобрено IACUC в Weill Cornell Medical College.

1. Подготовка ткани

  1. Эвтаназии приурочен беременности самок смещения шейных позвонков 15. Рассеките эмбриональных E16 - E18 эмбрионов из тайм-беременности самок и место эмбрионов индивидуально в лунки блюдо 6-луночный, заполненных холодной фосфатным буферным солевым раствором (PBS).
  2. Промойте эмбрионы в холодной PBS.
  3. Удалить небольшую часть амниотической мембраны эмбриона и поместить в предварительно подготовленный протеиназы К раствору для последующего генотипирования. С другой стороны, если амниотической мембраны теряется, удалить небольшую часть от кончика хвоста эмбрионов и поместить его в раствор протеиназы К
  4. Совать отверстия в коже по всему эмбриона с использованием насекомых булавками (по крайней мере 100 с каждой стороны).
  5. Удалить PBS и медленно добавить свежий 2% параформальдегида (PFA),рН 7,4, к колодцу.
  6. Осторожно встряхивают в течение 2 ч при 4 ° С.
  7. Промыть эмбрионы дважды в PBS и хранить не в PBS при 4 ° С до окрашивания.

2. Генотипирование

  1. Погрузитесь амниотической мембраны или эмбриона хвосты протеиназы К смеси в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. Выдержите при 56 ° С в течение 10 мин.
  3. Экстракт ДНК с использованием коммерчески доступного набора для очистки ДНК.
  4. Взять 0,5 мкл общего объема 200 мкл очищенных геномной ДНК-раствор, объединить его с 0,5 мкл каждого из генов конкретного смыслового и антисмыслового праймеров (10 мкМ), 2 мкл дНТФ Mix (2,5 мМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ) , 0,2 мкл Taq полимеразы (5 ед / мкл) и 2 мкл ПЦР буфера (10x), добавляют H 2 O до полного объема 20 мкл.
    Примечание: Последовательности праймеров следующие (таблица 1):
    TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC ТГК GCG GCT CTG CCA GGG TG; ПЦР осколочнаяДлина ния: 400 пар оснований (п.о.).
    Вах: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA Г.Г., Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA Т.Г., NeoR: CCG СТТ ССА ТТГ CTC AGC GG; Длина ПЦР-фрагмента: дикого типа, 304 BP; Вах NULL, 507 б.п..
    TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; ПЦР длины фрагмента: 360 пар.
  5. Запуск ПЦР со следующей программой для TrkA: Шаг 1: 1 мин при 95 ° C, шаг 2: 10 сек при 95 ° C, шаг 3: 20 сек при 68 ° C, шаг 4: 30 сек при 72 ° C. Повторите шаги 2 - 4 для 40 циклов.
    1. Для LacZ и Bax, запустить ПЦР со следующей программой: шаг 1: 1 мин при 95 ° С, шаг 2: 10 с при 95 ° С, шаг 3: 1 мин при 54 ° С, Шаг 4: 1 мин при 72 ° C, повторите шаги 2 - 4 для 35 циклов.
  6. Образцы Выполнить ПЦР на 2% агарозном геле при 100 В в 1x Трис-ацетат-ЭДТА буфере в течение 20 мин с полосу ДНК лестницы, чтобы оценить фрагментов длины.
  7. Анализ эмбрионов на наличие дикого типа TrkA, TРКА-tauLacZ и Bax нулевые аллели. Генотипы экспериментальных эмбрионов TrkA taulacZ / вес: Вах - / - и TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / -, в зависимости от экспериментальных вопросов. Эмбрионы, лишенные репортеру tauLacZ будет отрицательным для окрашивания аксонов и, следовательно, может служить в качестве отрицательного контроля для калибровки процесса окрашивания.

3. эмбрионов Окрашивание

  1. Использование коммерческого набора для окрашивания LacZ с некоторыми модификациями, как описано ниже в разделах 3.2 - 3.8. Вот, используйте комплект Millipore.
  2. Погрузитесь эмбрионов в буфере А, по крайней мере, 1 ч, встряхивая осторожно при комнатной температуре.
  3. Непосредственно погрузиться эмбрионов в буфере B, по крайней мере, 15 минут, встряхивая осторожно при комнатной температуре.
  4. В то время как эмбрионы в буфере A / B, предварительно теплой ткани основного раствора при 37 ° С. Используйте 5 мл ткани базы раствора на эмбрион.
  5. В то время как эмбрионы в буфере A / B, подготовки свежего 5-Bromo- 4- хлор-3-индолил α-D-галактопиранозид (X-Gal) в концентрации 40 мг / мл в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО).
  6. Развести X-гал в подогретого ткани исходного раствора с концентрацией 1 мг / мл и добавляют 5 мл X-Gal / ткани базовой смеси в стекл нный сцинтилл ционный флакон.
  7. Трансфер эмбрионов в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий X-гал / ткани основной смеси. Уплотнение крышки парафильмом и инкубировать при 37 ° С в течение ночи, проверка на наличие синего красителя.
  8. Эмбрионы Postfix со свежими 4% PFA, рН 7,4. Осторожно встряхивают в течение 4 ч при 4 ° С.
  9. Промыть эмбрионы дважды в холодной PBS.

4. Ткань Обезвоживание и посредничества

  1. Место эмбрионов в 50% метанол / 50% PBS смеси в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивания в стеклянных флаконах.
  2. Продолжать обезвоживают в 75% метаноле / 25% PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивая в стеклянных флаконах.
  3. Продолжить для обезвоживания в 90% метанола / 10% РБС в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивая в стеклянных флаконах.
  4. Продолжать обезвоживают в 100% метаноле в течение 30 мин (2х) при комнатной температуре, встряхивая в стеклянных флаконах.
  5. В то время как эмбрионы дегидратации, подготовить 1: 1 (по объему) смеси спирта и бензоил бензоат бензоила.
    ПРИМЕЧАНИЕ: бензоила алкоголя и бензоил бензоат является токсичным.
  6. Погрузить эмбрионов в 1: 1 (по объему) смесь из 100% метанола: 100% Babb в течение 15 мин. Использовать стекло только потому, что Бабб будет растворяет пластик.
  7. Погрузитесь эмбрионов в 100% Бабб полностью очистить ткань и визуализировать окрашивание X-гал в очищенном эмбриона.
    Примечание: изображение как можно быстрее, так как X-Gal пятна будет исчезать в течение долгого времени.

5. Всего горе изображений

  1. Стабилизация эмбрион, погруженный в 100% Бабб на соответствующих углов для фотографии с помощью металлических щипцов. Освещать используя комбинацию UP-света и под-света Источники света.
  2. Получение изображений с рассекает микроскопомоснащен цифровой камерой. Возьмите несколько экспозиций светлом поле в пяти последовательных фокальных плоскостях 0,5 мм друг от друга вдоль оси Z. Время экспозиции и диафрагмы может меняться в зависимости от освещения и камеры спецификации и должны быть оптимизированы для каждой установки.
  3. Используйте стандартное программное обеспечение для обработки изображений процесс нанесения изображения и создавать фотомонтажи.

Результаты

Генотипы TrkA WT / taulacZ: Вах - / - и TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / - эмбрионы могут быть однозначно определено с помощью стандартных ПЦР генотипирование (Рисунок 1). X-Gal окрашивание отображает подробную периферийных аксонов беседки подкожно, обычно окрашенных эмбрионов

Обсуждение

Описанный выше X-гал процедура окрашивания эмбриональных мышей TrkA taulacZ позволяет быстро и детальной визуализации на большие расстояния аксонов прогнозов в интактном фиксированной эмбриона. Из-за Вах нулевой фоне этих мышей позволит для зондирования механизмы, которые ...

Раскрытие информации

The authors declare that there are no competing interests.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Луи Рейхардт для мышей TrkA taulacZ и д-р Аннет Markus для проницательного обсуждения и предложений. Эта работа была поддержана запуска средства из Берк Фонда, а также Уайтхолл исследовательского фонда грант 2010-08-61, исследовательский грант от Крылья для жизни фонда (WFL-US-028/14), грант ZB1-1102-1 от Кристофер и Дана Рив Фонд и гранты 1R01EY022409 и 3R01EY022409-01S1 из Национального института глаза, к JZ. KJo является членом Голдсмит.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PFASigma-AldrichP6418
PBSLife Tech10010-023
Tissue Rinse Solution AMilliporeBG-6-B
Tissue Rinse Solution BMilliporeBG-7-B
Tissue Stain Base SolutionMilliporeBG-8-C
X-galSigma-AldrichB4252
Glass scintiallation vialKimble Chase74500-20
IncubatorLablineModel 120
Insect pinsFST26000-30
DMSOSigma-AldrichD8418
6-well dishUSA ScientificCC7672-7506
PrimersIDTcustom DNA primers
Takara dNTP mixtureTakara4030
Takara LA bufferTakaraRR002A
Takara LA TaqTakaraRR002A
PCR machineBio-RadDNA Engine Dyad
Benzyl alcoholSigma-AldrichB-1042
Benzyl benzoateSigma-AldrichB-6630
Dissecting microscopeLeicaM205A
CameraLeicaDFC310FX
Ring lightLeica MEB110
PhotoshopAdobePhotoshop 4.0

Ссылки

  1. Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
  2. Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
  3. Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
  4. Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
  5. White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
  6. Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
  7. Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
  8. Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
  9. Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
  10. Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
  11. Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
  12. Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
  13. Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
  14. Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
  15. Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
  16. Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
  17. Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
  18. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  19. Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  20. Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience94TrkA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены