Метод оценки воздействия диапазоне длин волн и интенсивностей красный / ближней инфракрасной световой терапии на окислительного стресса<em&gt; In Vitro</em

Резюме

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Аннотация

Красный / около инфракрасный свет терапия (R / NIR-LT), с которым выступил лазерном или светоизлучающий диод (LED), улучшает функциональные и морфологические результаты в диапазоне центральная система повреждений нервной в естественных условиях, возможно, за счет снижения окислительного стресса. Тем не менее, влияние R / NIR-LT на окислительный стресс, как было показано варьироваться в зависимости от длины волны и интенсивности облучения. Исследования, сравнивающие параметры лечения не хватает, из-за отсутствия коммерчески доступных устройств, которые обеспечивают несколько длин волн или интенсивности, подходящие для высокой пропускной положить в пробирке исследования оптимизации. Этот протокол описан способ доставки света в диапазоне длин волн и интенсивности для оптимизации терапевтических доз, необходимых для данной модели травмы. Мы предположили, что метод доставки света, в которых могут быть легко изменены длины волны и интенсивности параметры, может облегчить определение оптимального дозы R / NIR-LT для снижения реактивных форм кислорода(ROS) в пробирке.

Некогерентное ксеноновые фары фильтруют через узкополосных интерференционных фильтров, чтобы доставить различные длины волн (в центре длины волн 440, 550, 670 и 810nm) и флюенсы (8,5 × 10 ^-3 до 3,8 × 10 ^-1 Дж / ​​см ²⁾ света в культивируемых клетках. Светоотдача из устройства калибруют, чтобы излучать соответствующие терапевтически, равные квантовых дозы света на каждой длине волны. Активные формы были обнаружены в глутамат подчеркнул клетки, обработанные с учетом, используя DCFH-DA и H ₂ O ₂ чувствительных флуоресцентных красителей.

Мы успешно доставлено свет в диапазоне физиологически и терапевтически соответствующих длин волн и интенсивностей, в культивируемых клетках, подвергшихся воздействию глутамата в качестве модели повреждения ЦНС. В то время как флюенсами R / NIR-LT, используемых в данном исследовании не оказывают влияния на ROS, генерируемого культивируемых клеток, способ доставки света применимо к другим систEMS включая изолированные митохондрии или более физиологически соответствующие органотипической модели ломтик культура, и может быть использован для оценки воздействия на целый ряд критериев исхода окислительного метаболизма.

Введение

Активные формы кислорода (АФК) требуется для ряда сигнальных путей трансдукции и нормальных реакций клеточного метаболизма, в том числе нейропротекции ^1. Однако, когда эндогенный антиоксидант механизм не в состоянии контролировать производство АФК, клетки могут поддаваться окислительным стрессом ^2,3. После травмы ЦНС, что приводит к повышению в присутствии АФК и окислительного стресса, как полагают, играют существенную роль в прогрессировании повреждения ^4,5. Несмотря на широкое ряда стратегий для ослабления окислительного стресса, которые были оценены, не существует в настоящее время нет полностью эффективных, клинически значимые стратегии антиоксидантные для ослабления АФК и связанного с окислительного стресса в клинической практике следующие нейротравме ^6. Поэтому ослабление окислительного стресса остается важной целью для терапевтического вмешательства ^7.

Улучшения следоватьчисле R / NIR-LT были зарегистрированы в широком диапазоне повреждений и заболеваний, включая сокращение размера инфаркта сердечной, почечной и печеночной осложнений во время диабета, дегенерации сетчатки, травмы ЦНС и инсульта ^8, возможно, снижая окислительный стресс. Что касается непосредственно повреждения ЦНС, доклинические исследования эффективности 670 нм света показали хорошие эффекты в моделях дегенерации сетчатки ^9-11, повреждение спинного мозга ^12, гибели нейронов ^13. Клинические испытания были проведены для сухой возрастной макулярной дегенерации и в настоящее время инсульта ^14, однако результаты этих исследований не выглядят многообещающими, возможно, из-за сбоя использовать эффективное лечение параметров ^15. Таким образом, R / NIR-LT не были широко приняты как часть обычной клинической практике в нейротравме, несмотря на то, легка в управлении, неинвазивный и относительно недорогое лечение. Барьеры на пути к клинической перевода включают в себя отсутствие в клраннего понимать механизм действия и отсутствие стандартизованной эффективного ^16,17 протокол лечения. Текущий литература о световой терапии показывает множество вариаций в параметрах лечения по отношению к источникам облучения (LED или лазером), длины волны (например, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), общая доза (Дж облучения / на единицу площади), продолжительность (время экспозиции), сроки (до или после оскорблять), частота лечения и способ родоразрешения (импульсный или непрерывный) ^8. Изменчивость параметров обработки между исследованиями делает сравнение трудным и внесла свой ​​вклад в скептицизм в отношении эффективности ^16.

Таким образом, оптимизация R / NIR-LT Очевидно, что необходимо, с систем клеточных культур, способных обеспечивать механизм высокопроизводительного скрининга необходимо сравнить несколько переменных. Однако есть несколько коммерчески доступных осветительные системы, которые могут обеспечить достаточную гибкость и контроль над ваvelength и интенсивность выполнять такие эксперименты по оптимизации. Коммерчески доступные устройства СИД, как правило, не способны доставить несколько длин волн или интенсивности, в результате чего исследователей, использующих несколько светодиодных устройств от разных производителей, которые могут меняться не только в интенсивности, но и спектр волны излучаемого света. Мы решили эту проблему путем использования широкополосного ксеноновые источник света фильтруют через узкополосный интерференционных фильтров, тем самым создавая диапазоне длин волн и флюенсах света, что позволяет близко, точный контроль параметров R / NIR-LT.

Важно отметить, что терапевтическая доза лечения определяется число фотонов, взаимодействующих с photoacceptor (хромофора), который, в случае R / NIR-LT является предполагаемым быть цитохром с оксидазы (COX) ^18. Энергия фотона доставлен изменяется с длиной волны; это означает, равные дозы энергии на различных длинах волн будет комценится из различного числа фотонов. Таким образом, свет, испускаемый из устройства калибруют, чтобы излучать одинаковое количество фотонов для каждого из выбранных длин волн для тестирования. Мы разработали систему, которая может быть использована для доставки R / NIR-LT в диапазоне длин волн и интенсивностей в клетки в пробирке и продемонстрировал способность измерять воздействие при поставке R / NIR-LT на продукции АФК в клетках, подвергнутых глутамат стресс.

протокол

1. Оптический Калибровка: Измерение светового выхода

1. Чтобы подготовить световой аппаратурой доставки, подключения широкополосного источника света (например, ксенон или вольфрамовая лампа) к соответствующему источнику питания. Установите коллимирующей линзы перед источником света для получения коллимированного пучка света. Пропускают свет через фильтр жидкого тепла, чтобы удалить большую часть тепла от светового луча. В зависимости от применения, сфокусировать коллимированный пучок на входной апертуре жидкой световода, который обеспечивает более гибкое доставки света (например., В инкубаторе).
2. На другом конце световода жидкости, положение второй коллимирующей линзы, а затем держатель для интерференции и фильтры нейтральной плотности. Убедитесь, что это устройство производит равномерно освещенного пятна света от желаемого диапазона длин волн и интенсивности.
   Примечание: расстояние между концом световода и плоскости образца может потребоваться варьироваться в зависимости отобласть, которая должна быть освещена, но помните, что по мере удаления от конца световода возрастает, интенсивность света уменьшается. В настоящем исследовании, это расстояние 14 см и производит поперечное сечение пучка, который равномерно освещает область также 3x3 на 96-луночный планшет с.
3. Убедитесь, что рассеянный свет от лампы и связанных с ними оптических компонентов не может достичь образца.
4. Включите охладитель воды для фильтра жидкого тепла и обеспечить происходит обмен воды через рубашку фильтра. Включите источник питания лампы и подождите не менее 5 мин для широкополосного источника света для стабилизации. Примечание: использование кулера необходимо для предотвращения перегрева устройства.
5. Выберите фильтр узкополосных помех (обычно описывается их длины волны центра, пик пропускания и Полуширина (FWHM) пропускной способности) для создания нужной полосы освещения. Примечание: узкополосного интерференционных фильтров, используемых в данном исследовании были 442 нм, 550 нм, 671 нм и 810 нм.
6. Измерьте свет, излучаемый лампой в плоскости, где образец должен быть расположен во время лечения. Измерьте свет с помощью калиброванного освещенности датчик (косинус коллектор) соединен с подходящей спектрорадиометра, используя соответствующее программное обеспечение в соответствии с инструкциями изготовителя.
7. Используйте нейтральные фильтры, чтобы регулировать интенсивность света, пока не будет получен желаемый результат. Примечание: В настоящем исследовании, интенсивность света, прошедшего от каждого фильтра помех регулируется, чтобы дать равные квантовых выход на каждом из четырех диапазонах обработки. Важно проверить калибровку регулярно, как выход лампы могут быть изменены.
   Примечание: В соответствии с настроить устройства, клетки готовы для освещения Рисунок 1 является представлением света устройства доставки, используемого в данном исследовании..

Рисунок 1. Изображение световой аппаратурой доставки. Проиллюстрированы свет источник питания, ксеноновая лампа с жильем, коллимирующей линзы, фильтр для воды, входного отверстия, жидкого световода, второй коллимирующей линзы, держателем фильтров, рамы лечения и матовой черной картой. Следует отметить, что узкополосные длин волн и интенсивность фильтрации, не показаны.

2. Сотовый Подготовка

1. Описанный R / NIR-LT способ доставки может быть применен к любому типу клеток или в пробирке модельной системы; поскольку такие следующие описания клеточной культуре являются общими, с использованием хорошо зарекомендовавших себя методов культуры феохромоцитома (PC12), Мюллер (RMC1) и первичных смешанных клеток сетчатки.
2. До посева клеток для легкой обработки и окислительного стресса анализа, культуры увековечены клетки в их соответствующих питательных сред, содержащих соответствующие добавки (например,., FB, антибиотики) в Т75 FLASKS до 70-80% вырожденная.
3. Отделить иммортализованных клеток из колбы Т75, используя метод, соответствующий типу клеток для тестирования напр., Трипсин. При необходимости, прежде чем приступить к высева клеток в 96-луночные планшеты для анализа, покрытие анализа планшетов с 10 мкг / мл поли-L-лизина в течение 1 часа (например., Для клетках PC12) или 10 мкг / мл поли-L-лизина для 1ч сопровождается O / N инкубации с 10 мкг / мл ламинин (например., для смешанных клеток сетчатки).
4. Центрифуга клетки, чтобы собрать как необходимо (например., 3 мин при 405 мкг в течение РС12 клеток или 10 мин при 218 мкг в течение RMC1 клеток), удалить супернатант и ресуспендируют в 8 мл соответствующего культивирования клеток.
5. Если смешанные клетки сетчатки, которые будут использоваться, готовят из P0-5 новорожденных крысят путем ферментативного пищеварения (папаин) в соответствии с установленными процедурами ¹⁹
6. Подсчитайте число жизнеспособных клеток, за исключением 0,4% (вес / объем) трипанового синего красителя, с помощью гемоцитометра.
7. Отрегулируйте плотность клеток SUCч, что клетки будут примерно 70-80% сливной после 24 или 48 часов в культуре. (Для клеток РС12 плотность посева является 4,0 × 10 ⁵ жизнеспособных клеток / мл, по RMC1 клеток, то есть 2,5 х 10 ⁵ жизнеспособных клеток / мл и для смешанных клеток сетчатки это 8 х 10 ⁵ жизнеспособных клеток / мл). После добавления клетки либо прозрачный или черный 96-луночные планшеты (используемые для H ₂ O ₂ или DCFH-DA анализа соответственно), в 100 мкл соответствующей среде роста, позволяют пластины, чтобы сидеть на ровной поверхности на 37 ° С, 5 % CO ₂ (или любой другой надлежащих условий для конкретного типа клеток), по крайней мере 24 часа, чтобы дать сотовый приверженность.
8. Культуры клеток в среде для выращивания в соответствующих 96-лотков, пока они не 70-80% сливной (24h для PC12 и RMC1 клеток, 48h для смешанных клеток сетчатки).

3. Добавление глутамата стрессора клеток

1. Подготовка L-глутаминовой кислоты мононатриева концентрации соли гидрат СТРЕССОР на 0-10 мм в соответствующем полной растутго культура СМИ.
2. Удалить носитель из клеток и осторожно мыть клетки 3 раза ЗФР (PC12) или HBSS (RMC1 и смешанных клеток сетчатки). После промывки, добавления глутамата-содержащий носитель в общем объеме 100 мкл / лунку.

4. Сначала Дозы Лечение светом

1. Сразу же после того глутамата или стресс выбора, подвергать клетки к свету лечения в нужных длин волн и интенсивностей, поместив его под подготовленную аппарата свет доставки. Будьте уверены, чтобы изменить квантовых выход светового пучка с помощью установленных комбинации фильтров нейтральной плотности в зависимости от длины волны вводимого.
   Примечание: В нынешних экспериментов, подвергать клетки легкого лечения в течение 3 мин поддержания температуры, отдыхая хорошо пластины 96 на 37 ^{° С} тепла площадку. Время обработки может изменяться в соответствии с требованиями.
   1. Поместите матовую черную карту под клетках, чтобы предотвратить света, отражающегося в соседних скважин в 96-вэйл лоток предназначен для других параметров обработки.
2. Если лечение желательно в течение более длительных периодов времени, добавление 25 мМ Hepes буфера для поддержания рН среды для культивирования клеток или, в идеале, разместить устройства и обработки пластин в инкубаторе с CO ₂ концентрацией доводитс до 5% CO _2, или условия, которые являются оптимальными для конкретного типа клеток.
3. После завершения светолечение, поместите клеток на ровной поверхности и инкубировать при 37 ° С и 5% CO ₂ (или любые условия, являются оптимальными для данного типа клеток) в течение 24 часов.
   Примечание: Дополнительные дозы R / NIR-LT можно вводить, как описано выше, по желанию.

5. Окончательный Дозировка Лечение светом и обнаружения АФК

1. Перед выполнением заключительного тура светолечение, подготовить реагенты, которые будут использоваться для обнаружения ROS. Подготовка 50 мМ цитрат буфер (pH6.0), Тритон X100 и H ₂ O ₂ реагент обнаружения работырешение (1: 2: 97 Соотношение 10мм H ₂ O ₂ обнаружения реагента раствора; 10 ед / мл пероксидазы хрена; 50 мМ цитрат натрия (рН 6,0)). Подготовка DCFH-DA в конечной концентрации 100 мкМ в соответствующих средствах массовой информации.
   Примечание: DCFH-DA реагент для клеток РС12 в среде RPMI СМИ, DCFH-DA реагент для RMC1 клеток в DMEM средств массовой информации. Следует отметить, что коммерчески доступные реагенты для детекции имеют дифференциальные чувствительности к конкретному АФК и реагенты должны быть выбраны тщательно, чтобы предоставить информацию, требуемую для индивидуального применения.
2. Администрирование светолечение к клеткам, как описано в стадии 4.1-4.1.2. Убедитесь, что клетки лечат с желаемыми флюенсы / длин волн света.
3. Сразу же после светолечение, удалите глутамата средах, содержащих и мыть два раза с соответствующим буферным раствором (для клеток РС12, PBS используется и для RMC1 клеток, HBSS используется). Выполнение анализов ROS на клетках следующим образом:
   1. H ₂ O ₂ Анализ: добавить 45 мкл 50 мМ цитратного буфера (рН 6,0) и 5 ​​мкл Тритона X100, чтобы каждый из скважин. Слегка встряхните клетки на орбитальном шейкере в течение 30 сек и инкубировать при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 15 мин. Добавить 50 мкл H ₂ O ₂ рабочего раствора обнаружения и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Измерьте флуоресценции с использованием планшет-ридер с длиной волны возбуждения 530 нм и длине волны эмиссии 480nm.
   2. ДДП анализа: добавьте 100 мкл 100 мкМ раствора DCFH-DA в каждую лунку и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С и 5% СО _2. Извлеките носитель, содержащий 100 мкМ DCFH-DA и промывают соответствующим буферным раствором (как описано выше) в два раза. Добавить 90 мкл буферного раствора и 10 мкл Тритона X100, чтобы каждый из скважин и осторожно встряхнуть на орбитальном шейкере в течение 30 секунд до 15 мин инкубации при 37 ° С. Измерьте DCF, полученную флуоресценцию с помощью планшет-ридер с длиной волны возбуждения 480nm и Вавель выбросовength из 530 нм.
   3. Экспресс РОС значения по отношению к концентрации белка клеток, оставшихся в лунках, с использованием колориметрического набора для количественного определения концентрации белка в соответствии с инструкциями производителя, со ссылкой на стандартной кривой для расчета мг белка.

Результаты

Выход света доставлен на длине волны 670 нм была откалибрована с помощью фильтры нейтральной плотности, чтобы облучать клетки с диапазоном плотности энергии, охватывающих дозу 670 нм света было показано ранее, полезными в естественных условиях (0,3 Дж / ​​см ^{2) 20.} По мере увеличен...

Обсуждение

Мы успешно приспособлены точное и калиброванного системы доставки света, чтобы обеспечить механизм для изучения оптимизации R / NIR-LT в пробирке. Длина волны и интенсивность параметры R / NIR-LT могут манипулировать точно и эффективно использовать эту систему. Мы установили, что светол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B