3-D изображений и анализ нейронов Infected<em&gt; В Vivo</em&gt; С<em&gt; Токсоплазма</em

Резюме

Используя этот протокол, мы смогли изображение 160 мкм срезы толщиной головного мозга мышей, инфицированных паразитом Toxoplasma Gondii, что позволяет визуализации и анализа пространственных отношений между encysting паразита и зараженной нейрона.

Аннотация

Токсоплазма является облигатным, внутриклеточным паразитом с широким спектром хозяев, включая человека и грызунов. В обоих людей и грызунов, Toxoplasma устанавливает пожизненную хроническую инфекцию в мозге. В то время как эта инфекция мозга протекает бессимптомно, в большинстве людей с нормальным иммунитетом, в развивающегося плода или ослабленных лиц, таких как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) больных, в этом пристрастии к и настойчивости в мозге может привести к разрушительным неврологических заболеваний. Таким образом, очевидно, что взаимодействие мозговой Toxoplasma является критическим для симптоматической болезнью производимого Toxoplasma, пока мы имеем слабое представление о клеточном или молекулярном взаимодействии клеток центральной нервной системы (ЦНС) и паразита. В мышиной модели ЦНС Токсоплазмоз было известно на протяжении 30 лет, что нейроны являются клетки, в которых паразит сохраняется, но мало информации о том, какиечасть нейрона обычно заражены (сома, дендритов, аксонов), и если это сотовой отношения меняет между штаммами. В частности, это отсутствие является вторичным по отношению к сложности визуализации и визуализации целые зараженные нейроны от животного. Такие изображения, как правило, требуют последовательного секционирования и сшивание тканей отображаемого с помощью электронной микроскопии или конфокальной микроскопии после иммунной окраски. Объединив несколько методов, способ, описанный здесь, обеспечивает возможность использования толстых секций (160 мкм), чтобы идентифицировать и изображения целых клеток, которые содержат цисты, что позволяет трехмерной визуализации и анализа отдельных, хронически инфицированных нейронов без необходимости иммунным, электронная микроскопия или серийный секционирования и шить. Используя эту технику, мы можем начать понимать сотовой отношения между паразитом и зараженной нейрона.

Введение

Основная цель данного метода является получение высокого разрешения, трехмерные изображения отдельных нейронов, которые заражены облигатной внутриклеточным паразитом Toxoplasma Gondii.

Toxoplasma часто считается одним из самых успешных паразитов из-за его большой промежуточной области хоста, которое включает в себя людей и грызунов. В обоих людей и грызунов, после острой инфекции при проглатывании зараженной пищи или воды, Toxoplasma может привести к хронической инфекции ЦНС путем преобразования из его форму быстрого дуплицируемый (в tachyzoite) в его медленном тиражирования и encysting форму (bradyzoite ). В иммунокомпетентных лиц, это латентное инфекции ЦНС, как полагают, чтобы быть относительно бессимптомно, но в индивидуумов с ослабленным иммунитетом, таких как больных СПИДом или реципиентов, рецидив паразита может привести к фатальной toxoplasmic энцефалита ^1,2. Кроме того, недавние исследования гаве показали, что скрытая инфекция с токсоплазмозом может привести к поведенческим изменениям у грызунов ^3,4, хотя механизм остается неизвестным.

Удивительно, но, несмотря на эти данные, подчеркнув важность взаимодействия CNS- Toxoplasma, относительно мало известно об этом отношений, особенно на клеточном и молекулярном уровне. Способность к обучению даже простые аспекты мозговой паразит взаимодействия была затруднена в части технологических ограничений. Например, большинство работы, показывающие, что нейроны клетки, в которой сохраняются кисты было сделано с электронной микроскопии (ЭМ) ^5,6. Хотя EM дает высокое разрешение, это занимает много времени, трудоемкий, и дорого. Иммунофлуоресценции (ИФ) анализы недавно были использованы в сочетании с конфокальной микроскопии, чтобы подтвердить проделанную EM ^7. Если анализы технически легко выполнить и относительно недороги, но при использовании этих методов, чтобы UndersТ и пространственное соотношение между кистой и инфицированных нейрона требуется серийный реконструкцию, которая занимает много времени, технически сложно, и может привести к потере ценной информации. Таким образом, мы разработали метод, который может быть использован с мышиной модели ЦНС токсоплазмоза и позволяет изображению полноту инфицированных нейронов без их или иммуногистохимии (IHC). Развивая такую ​​технику, мы можем начать изучение клеточного отношения между инфицированной клетки и кисты относительно быстро и недорогим способом.

Метод, который мы разработали сочетает в себе новые технологии для оптически очистки и толстых срезов головного мозга визуализации с помощью конфокальной микроскопии ⁸ с системой, которая отмечает в естественных условиях клетки, которые были введены с паразитов белков ^9,10. В этой системе, мы заражают Cre-репортер мышей, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) только после того, как Cre-опосредованного рекомбинации ¹¹ с Toxoplasma Штаммы, которые выражают красный флуоресцентный белок (RFP) и инъекционные Cre рекомбиназу в клетках-хозяевах ^9. Это сочетание позволяет нам использовать зараженный мозг мыши после инфекции ЦНС установлено, вырезать толстые срезы головного мозга, и быстро идентифицировать соответствующие области, чтобы изображение путем нахождения RFP ⁺ кисты. Важно отметить, что, как клетка-хозяин выражение GFP зависит только от инъекции Cre паразитами, а не на инфекции, количество GFP ⁺ клеток не содержат паразитов ^10. Поскольку целью данного протокола является, чтобы иметь возможность изображения целых инфицированных нейронов, в центре внимания находится только на GFP ⁺ нейронов, которые также содержат ППП ⁺ кисту, но протокол также может быть использован для изображения GFP ⁺ / RFP ^- нейроны.

После того, как зараженный мозг собирают и срезы, срезы оказываются прозрачным глицерина очистки. Соответствующие регионы разделах затем полученную с конфокальной микроскопии, альмычание беспрецедентный визуализация инфицированных клетках-хозяевах и осумкованный паразитов во всей их полноте. Здесь мы предлагаем полный протокол для выявления оптически клиринга и обработки изображений заражены нейронов.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были выведены и поддерживаются в контролируемой температурой и влажностью комнате с 12 ч вспять светлые / тёмные циклы с пищей и водой, доступными по желанию в университете Аризоны. Эксперименты проводились на основе принципов и утверждения уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Аризоны. Все усилия были сделаны, чтобы минимизировать страдания. В Cre-репортер мышей на C57BL / 6 фоне ¹¹ и коммерчески доступны.

1. Мышь инфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: способ заражения мыши с Токсоплазма описано ниже был использован в исследованиях опубликованных ранее ^{10 - 12.}

1. Выращивают штаммов Toxoplasma в фибробласты крайней плоти человека (HFFS) культивировали в Дульбекко с высоким содержанием глюкозы Модифицированный орлов Средний (DMEM), дополненной 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мг / мл streptomycin, и 2 мМ L-глутамина (cDMEM) в Т-25 колбу внутри 5% CO ₂ инкубаторе до паразиты создали большие паразитофорной вакуоли.
2. Шприц высвобождением паразиты путем соскабливания клеток со дна колбы и попутные полученного раствора через иглу калибра 25, соединенной с 3 мл шприца 2 раза в колбе затем передать всю раствора в 5 мл случае шприца, соединенного с иглой 27, что был перевернут в 15 мл коническую пробирку. Подключите поршень шприца и передать паразита решение в конической трубе.
3. Центрифуга трубки в течение 10 мин при 300 х г. Аспирата супернатант затем ресуспендируют осадок в 4-6 мл стерильной класса USP 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), рН 7,4 (маточный раствор).
4. Загрузите гемоцитометр с 10 мкл раствора, подождать 5-10 мин для паразитов урегулировать затем подсчитать количество паразитов в четырех угловых и центральных площадях средней большой площади.
5. Развести пунктСайты в соответствующего размера инокул та 100K / 200 мкл 1X PBS затем вводят мышам внутрибрюшинно (IP) при общем объеме 200 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры, мыши были привиты с 100K Тип III (КЭП) ¹³ тахизоитами в 200 мкл 1x PBS. При заражении мышей с другими штаммами токсоплазм, концентрация инокулята, возможно, потребуется скорректировать с учетом уровня вирулентности.

2. перфузии и мозг Сбор

Примечание: Этот протокол был проведен на 21 день после заражения (точек на дюйм), так как это представляет собой момент времени, в котором пик количество цист, найденный в головном мозге мыши, но можно использовать и другие моменты времени. Размер, количество, расположение, наличие или отсутствие кисты зависит от многих факторов, в том числе линии мышей, паразитов типа деформации, а также размер посевной ^{7,14 - 17.} Исследователи должны будут индивидуально определить соответствующий инокулята для мыши и Toxoplasма деформации он / она использует.

1. Настройка все хирургические инструменты сбора урожая (Рисунок 1).
2. Для каждой мыши, подготовить и держать на льду: 20ml шприц с 0,9% хлорида натрия (NaCl) + 10 МЕ / мл гепарина в 1x стерильной класса USP PBS (гепарин / солевой раствор); 20 мл шприц, наполненный 4% параформальдегида (PFA); Сцинтилляционный флакон с 15 мл 4% PFA. Для нескольких мышей, подготовить стакан, наполненный всей суммы каждого решения, необходимого для всех мышей, то составить свежий шприц с раствором для каждого перфузии.
3. Обезболить IP мыши с 200 мкл / 25 г веса тела кетамина / ксилазина коктейль (24 мг / мл и 4,8 мг / мл соответственно) в день интерес. Монитор мыши для уровня анестезии, проверяя ног щепотку рефлекс. Продолжить с протоколом только один раз мышь не показывает никакого ответа на твердой ног крайнем случае.
   Примечание: Другие методы анестезии могут быть использованы при условии, что соответствующий уровень анестезии достигается, преждеприступить к протоколу.
4. Наведите в положении лежа на спине на крытой площадке пены. Pin все четыре конечности при этом ступни спрей грудь и живот с 70% этанола (этанол) (рис 2а). Добавление нескольких стерильных бумажных полотенец под мышкой могут быть использованы, чтобы помочь поглотить переполнение перфузии жидкости.
5. Подтяжка кожи чуть ниже грудины щипцами затем используйте ножницы, чтобы сделать разрез. Потяните кожу обратно, чтобы разоблачить грудной клетки (рис 2б).
6. Поднимите мечевидного отростка и сделать брюшной разрез чуть ниже диафрагмы, подвергая печень, которая тупо отсечен от диафрагмы. Сделайте два разреза, один слева и один справа через диафрагму и в нижней части ребер. Продлить слева и справа разрезы примерно 1 / 2-2 / 3 вплоть грудную клетку, которая затем отражается обратно, чтобы открыть сундук полость (рис 2С).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы не резать любые органы или крупные кровеносные сосуды дюкольцо эту процедуру так как это поставит под угрозу качество перфузии.
7. Заливать транскардиальную 10-20 мл гепарина / солевом растворе с последующим 10-20 мл 4% PFA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если перфузия сделано должным образом, печень изменит цвет с красного до желто-коричневого (рис 2D). Если это не сделано должным образом, кровеносные сосуды будут видны (рис 2E).
8. Переверните мышь на его животе, повторно-контактный ступни спрей голову и шею 70% этанола. Лифт кожу от основания шеи и сделать разрез. Удалить кожу, чтобы выставить череп (рис 2F). Обезглавьте голову на уровне плеч. Удалить череп, аккуратно удалите мозг, и поместить его в сцинтилляционный флакон, наполненный 4% PFA (рис 2G-H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если перфузиии, мозг будет казаться белым, без видимых кровеносных сосудов (рис 2i). Если мозг не очень хорошо перфузии, кровеносные сосуды будут видны (рис 2J).
9. Поместите крупицыции флакона с мозга в 4% PFA при 4 ° С в течение ночи, покрытые от света. Промыть мозг в не USP класса 1x PBS и переход к новой сцинтилляционный флакон, наполненный охлажденной 1x PBS. Хранить в мозг в 1x PBS при 4 ° С, покрытый от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное очистки и томографии было сделано с разделами, хранящихся в 1x PBS в течение одного месяца, но лучше разделе мозг в течение нескольких дней, как длительное хранение в PBS будут восстановлены фиксацию PFA и может привести к менее оптимальных изображений , Автофлуоресцентной и увеличение размытия были отмечены в некоторых разделах отображенных после хранения в 1x PBS в течение одного месяца или дольше.

3. мозга секционирования

1. Удалить мозг от 1x PBS и поместите его в матрицу мозга (рис 3а) в целях обеспечения более точной и даже прорезает мозга. Обрезать мозжечка и обонятельных луковиц, если они присутствуют, а затем вырезать мозг коронки в 2 или 3 части.
   Примечание: Обрезка и резка мозга может быть сделано без помощи матрицы мозга. Количество секций, вырезанных коронки будет зависеть от режущей расстояния Vibratome используется. Мозг может быть секционного в любой ориентации, хотя сагиттальной и корональной разделы наиболее часто используется для нейроанатомической идентификации.
2. Прикрепите каждую секцию головного мозга на образце монтажа блока с цианоакрилату. Прикрепите маленький блок 5% агарозном геле за раздел мозга на поддержку (рис 3б).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие механизмы поддержки могут быть использованы, но без поддержки, Vibratome может подтолкнуть на мозг, вызывая неравномерное секционирования.
3. Вырезать ткани в 160 мкм (рабочее расстояние объектива, используемого для формирования изображения) толстые секции с Vibratome установленной на скорости 4 и амплитуды 9.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки скорости и амплитуды можно регулировать в зависимости от конкретной машины используются для того, чтобы получить даже, гладкие участки. Если настройкине правильно, результат может быть неровно, разрыв тканей или зазубрин.
4. Сбор срезах тканей в сцинтилляционный флакон, наполненный свежие, охлажденные 1x PBS, если они будут очищены в течение одной недели. Если разделы не будут очищены в течение одной недели, место секций в 1,5 мл микропробирок, заполненных криоконсерванта решения и хранить при температуре -20 ° C.

4. Оптическое просветление ткани головного мозга разделах

Примечание: Этот протокол был изменен с ранее опубликованным методом ^8.

1. Подготовка 25%, 50%, 75% и 90% об / об глицерине в 1x PBS + 2% Твин-20 (GL / PBST).
2. Удалить секции из 1x PBS, или, если в криоконсерванта, промыть в 1x PBS и переносят в сцинтилляционный флакон, содержащий 10 мл 25% GL / PBST. Место флакона на качалке при 4 ° С, покрытой от воздействия света, в течение 12 часов.
3. Убедитесь, что все разделы канули в боttom флакона. Аспирируйте 25% GL / PBST, оставляя достаточно, чтобы покрыть участки затем заполнить флакон с 10 мл 50% GL / PBST и место на шейкере при 4 ° С, покрытый от воздействия света, в течение 12 часов. Повторите этот процесс для 75% Gl / PBST затем 90% GL / PBST. Оставьте секций в 90% GL / PBST в течение 24 часов, чтобы достичь максимальной клиринга. В течение процесса очистки, соблюдайте постепенное оптического просветления (рисунок 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс может быть ускорен, если решения будут изменены сразу после разделы канули на дно флакона. В 75% и 90% растворы, участки не будут погружаться весь путь до дна флакона, но будет плавать в середине.

5. Монтаж мозговой ткани Разделы

1. Вырезать No. 1,5 покровное на 5 частей, чтобы создать прокладку. Используйте линейку и алмазный карандаш, чтобы забить и сломать покровное по пунктирным линиям, показанных на рисунке 5А. Отменить тон часть центра, организовать 4 внешних частей на равнине стекло, чтобы создать окно, а затем почистить ясный лак для ногтей на швы придерживаться куски распорки к слайду в правильной конфигурации (рис 5б).
   ПРИМЕЧАНИЕ: прокладка будет использоваться для создания необходимого пространства между предметным и покровным для установки очищенные участки. Покровное могут быть сокращены в различных способов создания любого окна размера необходимо. Pre-Cut пены прокладки также имеются в продаже. Чтобы лак полностью высохнет, лучше сделать слайды с прокладками, по крайней мере за один день до монтажа секций.
2. Передача разделы на слайд с помощью пластиковой передачи пипетки с наконечником отрезаны. Убедитесь в том, чтобы заполнить окружающее пространство 90% GL / PBST. Осторожно опустите покровное над секциях, убедившись, что не вводить пузырьков. Избыток Gl / PBST может быть злой покончить с ворса протрите.
3. Изображение GFP ⁺ нейроны, содержащие RFP ⁺ Токсоплазма кисты с конфокальной микроскопии немедленно (7А-В), то магазин скользит плоской и покрытой от света месте при температуре 4 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, уплотнение скользит полностью вокруг все ребра для хранения и вошедшие в более позднее время. Использование прозрачного лака для ногтей, чтобы запечатать слайд не является обязательным и может сделать его более трудно удалить покровное если кто-то, чтобы удалить разделы из слайда на более поздний срок для дальнейшей обработки.

6. изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Любая микроскоп может быть использован, который имеет возможность получения высокого разрешения Z-стеки.

1. После первоначального поиска в фокальной плоскости в 10 раз, изменить к цели 20Х и сканирования через секцию, чтобы определить кисту, расположенный внутри GFP ⁺ клетки. Сосредоточьте область интереса (ROI) в поле зрения.
2. Изменить к цели в 40 раз. Фокус вверх и вниз по всей ROI, чтобы убедиться, что все клетки и суул видны.
   Примечание: Изображения были получены с использованием конфокальной микроскопии с 40X / 1.30 Нефть DIC M27 цели.
3. Использование установленное программное обеспечение визуализации, получить Z-стек, который включает в себя всю клетку с кистой. Средние параметры, используемые для получения изображения, показаны на рисунке 6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от каждого следователи срезов ткани и возможностей микроскопа.
4. Получить максимальную проекцию образа Z-стека, установив число проекций 1. Получить полный вращения вид, установив число проекций до 64.
   Примечание: Другие программные пакеты доступны и могут быть использованы для получения максимальной проекции, вращения, а также другие виды изображений Z-стека.
5. Анализ изображения с программным обеспечением для анализа изображений.

Результаты

Рисунок 7 включает в себя представительства изображения двух кисты, содержащие GFP ⁺ нейроны от двух разных 160 мкм толстых секций, а также представительства измерения расстояния от кисты к клетке тела для фигурного 7b. На рисунках 7 и B показывают, ?...

Обсуждение

Учитывая, что клеточные изменения в инфицированных клетках-хозяевах были связаны с результатами болезни при инфекциях с другими внутриклеточными организмами, такими как ВИЧ, бешенство, и Chlamydia ^18,19, мы разработали методику, которая позволила бы нам изучать интимные взаимодействи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System	Technical Products International, Inc.		Other vibratomes are compatible
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Slides	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Coverslips	VWR	48393 251
Diamond Scriber	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment			Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells			These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine	Corning	25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask	Fisher Scientific	1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	VWR	45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade	amresco	K813-500ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials	Fisher Scientific	FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software	Bitplane
Clear nail polish			Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok	VWR	BD309604	Other syringes are compatible
Three-way Stopcock			Any brand is compatible
Hypodermic needle			Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper			Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter	Greiner Bio-One	450099	Other brands are compatible