Поверхностный потенциал Измерение бактерий с помощью зонда Кельвина силовой микроскопии

Резюме

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Аннотация

Потенциал поверхности часто забывают физическая характеристика, которая играет доминирующую роль в адгезии микроорганизмов к поверхности подложек. Зонда Кельвина-силовая микроскопия (KPFM) является модуль атомно-силовой микроскопии (АСМ), который измеряет контактной разности потенциалов между поверхностями на нано-масштабе. Сочетание KPFM с АСМ позволяет одновременной генерации поверхностного потенциала и топографических карт биологических образцов, таких как бактериальные клетки. Здесь мы используем KPFM для изучения влияния поверхностного потенциала на микробной адгезии к медицинским соответствующих поверхностей, таких как нержавеющая сталь и золото. Поверхностного потенциала карты выявлены различия в потенциале поверхности микробных мембран на различных материальных субстратов. Шаг высота график, был создан, чтобы показать различие в поверхностного потенциала в граничной области между поверхностью подложки и микроорганизмов. Изменения в клеточной мембране поверхностного потенциала были связаны с изменениемс в клеточного метаболизма и подвижности. Таким образом, KPFM представляет собой мощный инструмент, который может быть использован для изучения изменений микробной мембраны поверхностного потенциала от адгезией к различным поверхностям подложек. В этом исследовании мы демонстрируем процедуру, чтобы охарактеризовать потенциал поверхности отдельных метициллин-устойчивый золотистый стафилококк USA100 клеток нержавеющей стали и золота с использованием KPFM.

Введение

Биопленки изготовленные на поверхностях оборудования и в кожных ран представляют проблему для медицинской промышленности, как биопленки непокорных снятию и может привести к увеличению темпов передачи заболевания и антимикробной резистентности. Привязанность является первым шагом в формировании биопленки и самый важный шаг из-за его обратимости ^1-3. Поверхности подложки характеристики играют решающую роль в микробной привязанности. Такие факторы, как твердость поверхности, пористости, шероховатости и гидрофобности, как было показано, чтобы осуществить крепление микроорганизмов; Однако, мало исследований изучение роли поверхности подложки потенциала (ИП) на микробной адгезии было сделано ^4,5. Отрицательно заряженные поверхности предотвратить прикрепление Bacillus Thuringiensis спор слюды, кремния и золота ^6. Изменения в клеточном мембранного потенциала свидетельствуют об изменениях в клеточном привязанности и подвижности ^5,7. Было отмечено, что электрически Хомogeneous поверхности с большей готовностью содействовать микробной адгезии ^5. Определение характеристик поверхностного потенциала бактерий на наноуровне может обеспечить новый способ понять адгезии кинетику бактерий к различным поверхностям, и, таким образом, может помочь в разработке анти-обрастания стратегии. В отличие от других методов, используемых для характеристики электро кинетики бактерий, таких как электрофореза рассеяния света, дзета-потенциала и определение изоэлектрической точки, зонда Кельвина-силовая микроскопия (KPFM) позволяет для рассмотрения отдельных клеток, а не целых культур ^8-11. Это выгодно, когда требуется сравнить клетка-клетка или биопленки электрические характеристики с высокой точностью и точностью.

KPFM является модуль атомно-силовой микроскопии (АСМ). АСМ был разработан как прямой результат сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) ^12. Первые опубликованные изображения, используя СТМ было сделано Герд Биннигом и Генрих Rorhrer в 1982 году ¹² . Их изобретение было в состоянии решить атомные структуры на растра сканирования резкое проводящего зонда над проводящей поверхностью в воздухе. Последствия достижения изображения с высоким разрешением, возбуждаемые биологов, которые быстро попытались использовать СТМ изображения сухих образцах ДНК, белков и вирусов ^12. STM также может быть сделано в жидкостях с использованием специализированных зонд советы ^13. Это было показано Линдсей и др., Которые использовали СТМ и АСМ с молекулами ДНК изображение в 10 мМ HClO ₄ и в воде, на золотых электродов ^13. KPFM была продемонстрирована при определении поверхности потенциалы ДНК и белков анализ ²⁵ и биомолекул взаимодействия с лигандами ^26.

KPFM работает путем измерения контактной разности потенциалов (CPD) между проводящей острия кантилевера АСМ и идеально проводящей образца (рис 1, я) ^14,15. Образцы, не обязательно должны быть проводящим (т.е. биологических SAMPLES). Изображений может осуществляться на слюде, стекла и поверхности кремния (непроводящих) до тех пор, как непроводящий поверхность тонкой и есть основная проводящий материал ^6,7. ДСП эквивалентно потенциального напряжения поверхности и может быть описана как разница в рабочих функций между наконечником (φ _{наконечника)} и образца (φ) _{образца,} деленная на отрицательного заряда электронов (- е). При проводящий наконечник АСМ подносится близко к поверхности образца (разделены расстоянием D), электростатическая сила (F _ES) генерируется за счет разницы в энергии Ферми (рис 1, II, в) ^15. На данный момент, вакуумные энергии зондом и образцом (E _V) находятся в равновесии и выровнены. После чего наконечник ближе к поверхности образца, зонда и образца поверхность вступают в электрический контакт и действовать в качестве параллельных конденсаторов пластины (фиг.1, II, B ) ^14,15. В точке, энергии Ферми наконечника и на поверхности образца становятся выровнены, достигая стационарного равновесия (рис 1, II, б). Зонда и образца поверхность будет заряжена и V _CPD образуют из-за разницы в _е + е ~ 'ы и рабочих функций. F _ES действует на электрической контактной области из-за образовавшегося V _ДСП. Эта сила впоследствии недействительным путем применения внешнего _{постоянного тока} до кончика, который имеет ту же величину, как и образовавшегося V _ДСП (рис 1, б, в). Это приложенное напряжение постоянного тока устраняет поверхностный заряд в области электрического контакта, и количество _{постоянного тока} необходимо устранить F _ЭС V _CPD равна разности работ выхода между SAmple поверхности и кончик ^15. Следует отметить, что работа выхода наконечника известно и это предусмотрено производителей. Во всех методах KPFM, напряжение переменного тока _(AC, примерно 100 - 500 мВ) также применяется к кончику, чтобы произвести колебательные электрические силы, действующие между зондом и образцом ^14. Это обеспечивает более высокое разрешение при измерении изменения в V _ДСП и / или F _ES. В связи с этим, изменение частоты или амплитуды колебаний электрического может быть исправлена ​​путем _{постоянного тока,} и потенциал поверхности карты могут быть получены. Данные из конкретных областей этих карт могут быть дополнительно проанализированы с целью обеспечения электрической информацию о конкретных топографических особенностей.

KPFM может работать в трех режимах: (1) Режим подъема, (2) с амплитудной модуляцией (AM), режим и (3) частота модуляции (FM) режиме ^14,16. Режим подъема был первоначальный Incarnation из KPFM. Режим подъема опирается на метод двух частот, в которой колебались наконечник тащили по всей поверхности, чтобы получить топографическую изображение. Для второго прохода наконечник поднял заданное расстояние над образца (10 - 100 нм) и сканируют назад по тому же области. С помощью этого метода два прохода, режим подъема, по сравнению с избыточное и FM-KPFM, занимает наибольшее время для получения изображения. Повышение наконечник от поверхности гарантирует, что только дальний F _ES измеряется. Кроме того, перекрестные помехи между топографией и при измерениях поверхностного потенциала отделяется за счет увеличения пространственным разрешением и чувствительностью.

AM-KPFM улучшает боковую разрешение и чувствительность с помощью Dual-частоты для одновременного измерения рельеф образца и поверхностного потенциала (за один проход сканирования) ^14. В режиме AM, консольные механически колеблется, как правило, 5% ниже первой резонансной частоте (F _0), и электрически возбуждению (тhrough в V _AC) на его второй резонансной частоты (F _1). Изменения в амплитуде F ₀ приводят к генерации топографических данных, а изменения в амплитуде F _1, в связи с изменениями в F _ES и V _ДСП, дать потенциальным данные измерений на поверхности. F ₀ и F ₁ кантилевера разделены значительными частот и энергий, которые сигнализируют перекрестные помехи к минимуму ^14. Напорный ящик электроника (Евр) АСМ выделяет два сигнала, чтобы дать как топографическая и поверхностного потенциала данных одновременно в одном цикле. FM-KPFM повышает разрешение еще ​​дальше, чем АМ-KPFM на биологические поверхности ^14. FM-KPFM работает иначе, чем АМ-KPFM в том, что он измеряет изменения в электростатических градиентов сил, а не силы электростатического (F _ов) ^15. Как и в режиме АМ, ЧМ-режиме использует Dual-частоты и оде проход сканирующий механизм, чтобы получить топографическое и поверхностного потенциала данных одновременно ^14. В режиме FM, консольные механически колеблется на F ₀ и электрически колебались на низком модифицированной частоты (F _мода, как правило, 1 - 5 кГц). По электростатических взаимодействий, F ₀ и ф _мод смеси для получения боковые полосы F ₀ ± ф _мод. Эти боковые полосы очень чувствительны к изменениям в электростатической силы, и может быть отделена от F _{0 до} СЭП АФМ-х годов. Так как программа FM-KPFM измеряет изменения в градиентов силы электростатического, советы вершина форма и ее обслуживание / целостность играть ключевую роль в общем поверхностного потенциала разрешением ^{14, 15.} Поверхностного потенциала разрешение в AM и режимы FM в диапазоне от 1 нм в поперечном направлении ^{14 -16.} Следует отметить, что изображения KPFM может быть сделано в неполярных жидкостей, а в последнее время, как было показано, быть сделано в условиях низкой ионной (<10 мм) полярных жидкостей (вс открытым контуром режимы KPFM, которые не требуют обратную связь смещения, что исключает применение постоянного напряжения смещения), такие как MilliQ воды; Однако, работы с изображениями KPFM еще предстоит сделать на живые клетки в полярных решений ^17-20. Дополнительные проблемы, связанные с изображениями SP в жидкости, что растворы обычно используются для поддержания клеток (т.е., забуференный фосфатом физиологический раствор) имеют высокие концентрации подвижных ионов, что приведет к фарадеевского реакций, динамики заряда смещения, вызванного и диффузии ионов / перераспределени ^20. Таким образом, для данного эксперимента, измерения были сделаны из высушенных и мертвых клеток MRSA на поли-L-лизин функционализированных стали и золота поверхностей из нержавеющей условиях окружающей среды. Изображений может быть проведена на воздухе или в условиях вакуума на биологических образцах, которые были предварительно высушенных или иммобилизованных на поверхности ^20. Влажные условия также было показано, влияют KPFM изображений поверхностей ^6.

В этом исследовании мы использовали FM-KPFMи АСМ для изучения роли С.П. крепления метициллин-устойчивый золотистый стафилококк USA100 (MRSA) с поли-L-лизин функциональными нержавеющей стали и золота поверхностей. MRSA недавно получил статус с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) "Superbug" в связи с естественным выбранной его устойчивость ко многим β-лактамных антибиотиков и цефалоспоринов ^21. MRSA инфекции в настоящее время более сложной, трудно, и превосходно для лечения, что приводит к использованию более жестких противомикробных препаратов, таких как ванкомицин или оксазолидинонов, имеющих более высокие уровни токсичности в организме человека, и поэтому не может быть использован в качестве длительного лечения ^22. Нержавеющая сталь была выбрана из-за ее медицинской значимости и общего пользования в качестве материала в иглы для подкожных инъекций, подкладные судна, дверные ручки, раковины и т.д. золото было использовано в качестве сравнительного металла. FM-KPFM была использована для изучения, если микробная мембрана SP изменяется при добавлении к субстратов.

протокол

1. Подготовка посуды и культур

1. Прежде чем приступить к этой эксперименте, подготовить кровяной агар 5% овечьей (SBA) Плиты для выращивания MRSA. Инкубируйте пластины SBA в течение 24 ч при 37 ° С. По истечении этого времени, одиночные, хорошо изолированных колоний должны присутствовать, чтобы быть использованы для последующих прививок в жидких средах. Магазин прожилками SBA пластины с одной колонии при 4 ° С в течение 1 - 2 месяцев.
   Примечание: чашках с кровяным агаром овечьей приходят в готовых упаковках, содержащих от 20 - 25 пластин на основе производителей, и, как правило, состоят из трипсинового соевого агара основе с добавлением 5% вес / V крови овцы.
2. Сделать 500 мл трипсинового соевого бульона (ТСБ), дополненной 1% глюкозы и 0,1% NaCl. После этого соберите и очистить 2 стеклянные пробирки. Если автоклавируемые крышки недоступны для пробирок, использовать алюминиевую фольгу в качестве крышки. Автоклав TSB и пробирки вместе с коробкой 1 мл наконечники пипеток.
3. Под кабинета биобезопасности или рядом с Булочкиан горелки, пипетки 5 мл TSB ранее в автоклаве в автоклаве пробирках. Будьте внимательны к тому, что достаточно времени было уделено пусть БСЭ и пробирки остыть до комнатной температуры. Из ранее тенрек 5% SBA пластины, инокуляции одну колонию в 6 мл TSB бульоне. Одна будет содержать MRSA, а второй пробирке будет использоваться в качестве отрицательного контроля, чтобы обеспечить стерильность.
4. Возьмите засеянные пробирки TSB и поместить их в ответном инкубаторе в течение 24 ч при 37 ° С и при 200 оборотах в минуту. По истечении этого времени микробный рост должно быть очевидно, в испытательной MRSA трубки, а никакого роста не должно иметь место в испытательной трубке управления.
5. Принимать по 1 мл из 24 ч культуры и пипеткой в ​​6 мл свежего БСЭ. Инкубируют при 37 ° С в течение 6 ч при 200 оборотах в минуту.
6. Внесите 1 мл 6 ч субкультуры в 1,5 мл пробирке. Центрифуга в течение 3 мин при 850 х г. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 мл деионизированной H ₂ O. Центрифуга повторяю, и вновь приостановить.

2. Очистка и Прививка из нержавеющей стали и золота субстратов

1. Взять из нержавеющей стали и образцы дисков золота АСМ (20 мм и 10 мм, соответственно диаметры) и очистить с каждой стороны 5 мл деионизированной H ₂ O. Удержание образцы дисков в доминирующей рукой с пинцетом и использовать субдоминанты руку пипетки 5 мл на каждой стороне образца диска. После мытья обеих сторон, место примеры диски в стакан, содержащий 20 мл деионизированной H ₂ O с последующей обработкой ультразвуком в течение 1 мин.
2. После использования ультразвуком щипцов для удаления образца диски из стакана. Поместите диски таким образом, что они опираются на угол 60 ° по отношению к краю открытой чашки Петри на бумажное полотенце. Использование крышку чашки Петри, чтобы покрыть сушки диски. Пусть диски высохнуть полностью, прежде чем продолжить. Время высыхания может изменяться в пределах от 4 - 8 час.
3. После высыхания, используйте пинцет, чтобы разместить образцы дисков в чашку Петри.
   1. При желании, функционализации поверхностей образцов дисков с любым материалом (например, коллаген, гиалуроновая кислота, серебро наночастицы и т.д.).
   2. Для этого эксперимента, используют поли-L-лизин для покрытия поверхности подложки. Для поли-L-лизина функционализации, пипетки 200 - 400 мкл 0,1% поли-L-лизина (в H ₂ O) на выборочных дисков, и пусть инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре в чашке Петри.
   3. После 1 часа, использовать пинцет, чтобы удерживать образец диска и промывают 1 мл деионизированной H ₂ O. Пусть сушат на бумажных полотенцах, как описано в стадии 2,2.
4. Возьмите 2x промывают повторно приостановил клеток и пластины 200 - 400 мкл на выборочных дисков внутри биозащитой. Если образец диски, покрытые поли-L-лизин, инкубировать в течение 0,5 ч при комнатной температуре.
5. После инкубации клеток по образцу дисков, мыть образцы дисков осторожно 1 мл деионизированной H ₂ O. Пусть диски высохнуть в течение ночи перед визуализации.

3. KPFM изображений

Примечание: В этом эксперименте,использовать Agilent серии 5500 ILM-АСМ.

1. Чтобы начать АСМ, включите компьютерного блока вместе с ВЭП и MAC III контроллера АФМ-х годов. ПО для обработки изображений Open АСМ (например, PicoView компании Agilent). Будьте уверены, чтобы сначала выбрать ACAFM или в зависимости от того правильное обозначение находится на AFM для работы с изображениями в режиме прерывистого контакта.
2. Использование АСМ щипцы в доминирующую руку и, держа пружинный держатель-клипса открыта с субдоминантовом стороны, поместить консоль KPFM в в головном уборе. Будьте осторожны при обращении с и передачи АСМ головного убора в АСМ для данного аппарата (по крайней мере на 5500 ILM-AFM) содержит хрупкую пьезо кристалл устройства, которое управляет X, Y, и Z сканирования directionalities.
   ПРИМЕЧАНИЕ: KPFM консоли, используемые в данном случае были Mikromasch проводящий DPE (с низким уровнем шума) Кронштейны со средним резонансных частот 80 кГц и весенних констант 2,7 Н / м. Кронштейны с этими резонансных частот и жесткости пружины были выбраны из-за их легкости в использовании.Кронштейны с большими пружинными констант и высших резонансных частот также может быть использован для работы с изображениями.
3. Тщательно загрузить головного убора в АСМ и подключите соответствующие провода (в данном случае два провода должны быть подключены в: лазерного света и подъема двигателя этап).
4. Выравнивание лазер на кончике кантилевера. В некоторых номерах содержат функциональность камеры, которая позволяет для более легкого выравнивания. Если функциональность камеры нет на AFM, выровнять на острия кантилевера, как описано в следующем:
   1. Поверните ручку по часовой стрелке спереди-сзади, чтобы переместить лазер возвышаться чипа кантилевера. Когда лазерный достигает чип будет заблокирован и больше не будет видна. Только нужно повернуть селектор несколько раз.
   2. Поверните ручку спереди-сзади против часовой стрелки до тех пор, лазерное пятно не появится. Лазер теперь на краю чипа.
   3. Поверните налево-направо ручку позиционировать лазер на консоли. Как лазер проходит над консолью будет исчезать и появляться Iп быстрой последовательности. Лазерное пятно должно быть видно в матовом стекле обложки, на которой фотодиод устройство позже сидеть.
   4. Поверните ручку спереди-сзади против часовой стрелки, чтобы переместить место вниз кантилевера к кончику, пока пятно на матовом стекле не исчезнет.
   5. Поверните спереди-сзади ручку по часовой стрелке лишь немного для того, чтобы позиционировать лазер так, что он просто сидит на кончике кантилевера. Лазерное пятно будет появляться на матовом стекле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это способ позиционирования лазера для дайвинга пансион консолей. Для треугольных кронштейнов, процесс выравнивания отличается незначительно.
5. После того, как лазер выравнивается, удерживая высоту подъема двигателя в положение «открыто» в течение 10 сек, чтобы обеспечить достаточное пространство между консолью и образца при установке образца в АСМ.
6. Поместите образец на предметный столик KPFM. Обоснуйте образце с помощью медной проволоки. Подключите соответствующие провода от АСМ на сцену образца. Подключите STAGE в АСМ. В большинстве случаев этап проводится на месте с помощью магнитов.
7. В программном обеспечении АФМ, настройка консольные а затем начинают подход наконечника кантилевера к образцу. Убедитесь, что время установления установлен на уровне не более 10 мс, и что скорость приближения не превышает 2,0 мкм / сек для того, чтобы избежать повреждения наконечника.
8. После того, как острие кантилевера на поверхность образца, выберите размер окна изображения и идеально площадь изображения. Оптимизация прибыли и р вместе с консольные уставки, так что топографические изображения оптимизирован.
   1. После того, как топографическая изображений оптимизирована, включите модуля KPFM (либо FM или АМ режиме, здесь используется режим FM). Следует отметить, что изображения KPFM является очень сложным пределами окна визуализации х 5 мкм 5 мкм. Кроме того, для оптимального изображения KPFM, используйте разрешение 512 х 512 с медленных Скорость сканирования (0,02 - 0,05 линий / сек).
9. Для настройки FM-KPFM (не ACAFM настройки), установите диск процентов в период между 5 - 10%. Установите консольную FRequency между 1 - 5 кГц с полосой пропускания 2 кГц. Установите и р выгоды для настройки FM-KPFM до 0,3%.
   1. Вары полосу пропускания сигнала и я, и P прибыли между поверхности образцов. Для оптимизации изображений SP, дополнительно настроить полосу пропускания сигнала и я, и P прибыли для получения оптимальных изображений. Рекомендуемый диапазон доходов I и Р от 0,22 - 0,35%.
10. Обработка и анализ собраны KPFM изображения с помощью программного обеспечения для обработки после изображения, чтобы собирать данные SP.

Результаты

Возможность измерения с помощью SP KPFM опирается на принципе, что и поверхность образца и кантилевера наконечника являются проводящими, в некоторой степени. Нержавеющая сталь и золото выступал в качестве проводящих поверхностей, к которым MRSA были прикреплены. KPFM изображения были взяты ?...

Обсуждение

KPFM был использован в качестве нового метода для получения поверхности электрические данные. Он обычно используется в качестве метода для изучения распределения заряда в области химии и только недавно начали применяться и для исследования биологических систем на микро- и нано-масштаб...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.