Генерация CAR Т-клеток в усыновители терапии в контексте глиобластомы стандарт медицинской помощи

Резюме

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Аннотация

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

Введение

Глиобластома (GBM) является наиболее распространенной первичной злокачественной опухоли головного мозга и приводит к летальному исходу. Хирургическая резекция в сочетании с неспецифической стандарт медицинской помощи химиотерапии и лучевой терапии не удается полностью устранить злокачественные клетки, в результате чего плохим прогнозом менее 15 месяцев у пациентов с этим заболеванием ^1. В отличие от этого, иммунотерапия предлагает точный подход специально для ориентации опухолевые клетки, и, таким образом, имеет потенциал, чтобы служить в качестве весьма эффективного лечения платформе с уменьшенным риском побочного токсичности ^2-4. Т-клетки инженерии экс естественных условиях, чтобы выразить химерных рецепторов антигена (автомобили) предлагают универсальный стратегии иммунотерапии опухолей. ЦАР формируются путем слияния внеклеточный вариабельный участок антитела с сигнальной молекулы одного или более внутриклеточный Т-клеток (ов), вместо полноразмерного главного комплекса гистосовместимости (MHC) -ограниченных Т-клеточный рецептор ^5. Этот режим антитело-антиген, как ждут победитна позволяет реактивные антиген-специфические Т-клетки, чтобы распознавать и реагировать на опухолевых антигенов в отсутствие МНС и может быть адаптирована для практически бесконечного антигена репертуара.

CAR Т-клетки инженерии против различных опухолевых антигенов показали доклинические эффективность и высокую обещание в клинике ^6-9. В частности, в контексте GBM, ориентации АВТОМОБИЛЯ Т платформа клеток рецептор эпидермального фактора роста вариант III (EGFRvIII), мутация опухоли конкретных экспрессируется на клеточной поверхности ^10, как было показано, продлить выживание в глиомы мышей, несущих ^11. Несмотря на универсальность, однако, клиническая польза CAR приемной терапии не были полностью реализованы, отчасти из-за опухоли связано иммуносупрессии и иммунной уклонения ^12-16, а также проблемы в установлении и поддержании антиген-специфические Т-клетки в живом организме. Используя стандарт медицинской помощи (SoC) с иммунотерапии потенциально может преодолеть некоторые из этих лимитации, приводит к повышению эффективности в обоих доклинических и клинических условиях.

SOC для Пострезекционные GBM состоит из высоких доз темозоломида (ТМЗ), ДНК алкилирующим агентом ^17, и облучения всего головного мозга (ИВБ) ^1. Эти процедуры, как предполагается, быть согласованы с противоопухолевых вакцин с помощью повышающей регуляции опухолевого МНС выражения ^18-20 и пролития антигенов мертвых опухолевых клеток ^17,19,21,22. Действительно, добавление ТМЗ ^20,23 или ^18,24 ИВБ приводит к повышенной противоопухолевой эффективности иммунных основе процедуры в доклинических настройки. Кроме того, как много неспецифических цитотоксических химиотерапевтических, ТМЗ, как известно, вызывают системное лимфопения ^25,26, которые могут быть использованы в качестве средства принимающей кондиционирования для приемных платформ терапии ^27-29. ТМЗ-опосредованной lymphodepletion было показано, что повышение частоты и функцию антиген-специфических Т-клеток, что приводит к увеличению эффективности в adopный платформа терапия против внутричерепных опухолей ^30. В контексте CAR терапии, lymphodepletion служит в качестве средства для кондиционирования принимающей стороны и уменьшения количества эндогенного супрессоров Т-клеток ³¹ и индуцирующий пролиферацию гомеостатической ³² с помощью пониженном конкуренции за цитокинов ^33, таким образом, повышение противоопухолевой активностью ^11,34. Учитывая синергетический отношения между GBM ШОС и иммунотерапии платформ, оценивая новые приемных терапии и платформы вакцины в контексте ШОС имеет решающее значение для привлечения значимых выводов относительно эффективности.

В этом протоколе мы опишем метод генерации и внутривенного введения мышиных EGFRvIII-конкретного автомобиля Т-клеток наряду с TMZ и ИВБ в мышей, несущих EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей (рис 1 для лечения сроки). Вкратце, CAR Т-клетки сделаны экс естественных условиях на ретровируса трансдукции. Человек эмбриональной почки (НЕК) 293T клетки трансфицируют с использованием ДНК / липидный комплекс (содержащий вектор машину и PCL-Eco плазмиды), чтобы получить вирус, который затем используется для трансдукции активированных мышиных спленоцитов, которые собирали и культивировали в параллель. В ходе поколение автомобиля, мышиные хозяева, несущие EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей вводят фракционированного всего головного мозга рентгеновского излучения и системное лечение ТМЗ в дозах, сопоставимых с клинической SOC. CAR Т-клетки затем доставляются внутривенно lymphodepleted хозяев.

Следующая процедура описана в семи отдельных фаз: (1) Администрация Темозоламид для мышей с опухолями, (2) весь мозг Облучение опухоли мышей (3) трансфекции, (4) спленэктомия и Т-клеток Подготовка, (5 ) трансдукция, (6) Культура CAR Т-клеток и урожай, и (7) управление CAR Т-клеток в опухоли мышей. Эти фазы состоят из нескольких этапов, которые охватывают 6-7 дней и выполняются одновременно.

протокол

Этот протокол основан на экспериментальной конструкции, где 10 мышей обрабатывают 10 ⁷ CAR Т-клеток в каждой. Это означает, что 10 ⁸ АВТОМОБИЛЯ Т-клетки будут необходимы; выход должен быть завышены 5 х 10 ⁷ -1 × 10 ⁸ для учета потери жизнеспособности. Следующий протокол масштабируется для получения примерно 200 х 10 ⁶ клеток. Затем клетки вводили внутривенно женского C57BL / 6 мышей с 9-й день, установленных сингенных EGFRvIII-положительных внутричерепными опухолями, разработаны на основе существующих KR158B астроцитомы или В16 линий клеток меланомы. Одновременно с автомобилем Т поколения клеток, опухоль мышей вводят клинически значимых доз lymphodepletive ТМЗ (60 мг / кг) и Институтом Всемирного банка (16,5 Гр).

Мыши были сохранены и выращивают в свободных от патогенов условиях в Университете Дьюка Медицинского центра (DUMC). Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными Университета Дьюка институтааль Уход за животными и использование комитета (IACUC).

1. Администрация Темозоламид для мышей с опухолями

Дни от 0 до 4:

1. Рассчитать общее количество мышей, который будет введен и умножить это на 0,5, чтобы определить объем ТМЗ решения, необходимого (например, 30 мышей х 0,5 мл = 15 мл ТМЗ) и добавить 1,5 мл до этого объема для учета перетекания (16,5 мл TMZ ).
2. Умножьте это общий объем на 3 мг / мл для определения веса лиофилизированного TMZ необходимости (например, 16,5 х 3 = 49.5 мг ТМЗ). Взвешивание это в 50 мл коническую.
   ВНИМАНИЕ: ТМЗ является токсичным при вдыхании, попадании внутрь и контакте с глазами, кожей и слизистой оболочки. Проконсультируйтесь с охраны труда учреждения и / или окружающей среде, здоровья и благополучия отдела рекомендаций по снижению риска заражения.
3. Умножьте общий объем на 0,15, чтобы определить объем диметилсульфоксида (ДМСО), которые необходимы (например, 16,5 х0,15 = 2,475 мл ДМСО). Фильтр стерилизовать такой объем ДМСО (плюс дополнительные 2 мл для учета трансмиссионные) через 0,2 мкм фильтр в стерильную пробирку. Добавить 2,475 мл стерильной ДМСО к порошку ТМЗ.
4. Поместите раствор ТМЗ / ДМСО в химический стакан с водой над горячей плите при 65 ° С в течение 10-15 мин. После того, как ТМЗ полного растворения, раствор должен стать бледно-желтого цвета; Если раствор становится розовым, то ТМЗ ухудшается, и новое решение должно быть подготовлено со свежим много TMZ.
5. Рассчитать соответствующий объем стерильного физиологического раствора, необходимого путем умножения 0,85 от общего объема (0,85 х 16,5 мл = 14,025 мл физиологического раствора). Добавить 15 мл стерильного физиологического раствора к 50 мл коническую. В то время как ТМЗ растворяется в ДМСО, тепла солевым раствором до 65 ° С.
6. Вихревой / ДМСО раствора ТМЗ, чтобы гарантировать, что порошок ТМЗ полного растворения и медленно добавляют подогретое физиологический раствор в / ДМСО раствора ТМЗ.
7. Сразу же после приготовления, полностью загрузить 15 х 1 мл туберкулина SyringES ТМЗ решения для введения 4 дня, установленного с опухолью мышей.
8. Повторите эту процедуру в дни с 1 по 4 на общую сумму пять ТМЗ администраций.

2. весь мозг Облучение опухоли мышей

Дни со 2 по 4:

1. Включите рентгеновского излучателя и дайте ему прогреться до полного напряжения. Убедитесь, что соответствующий фильтр на месте и ввода нужного напряжения и текущих настроек (Рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: дозиметрии облучателя должны быть установлены заранее определить соответствующие параметры напряжения и сетка макета (2А, Б).
2. Рассчитать продолжительность времени, которое необходимо, чтобы привести в 5,5 Гр рентгеновского облучения. Например, если Х-лучи доставляются в размере 2 Гр / мин, затем 2,75 мин необходимо доставить в общей сложности 5,5 Гр. Вход необходимости длительность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 2 приведены мыши ИВБ дозыой их клинические эквиваленты в организме человека. В контексте высококачественных глиомы, 60 Гр фракционированию WBI (2 Гр фракции, 5 дней / неделю в течение 6 недель) является клинический стандарт медицинской помощи, и мышиный эквивалент, используемый здесь, 16,5 Гр (5,5 Гр х 3).
3. Подготовка свежий раствор кетамина / ксилазина для системного анестезии путем добавления 2 мл кетамина и 1 мл ксилазина к 17 мл физиологического раствора таким образом, что конечный раствор 10 мг / мл кетамина и 1 мг / мл ксилазина.
4. Взвешивание мышей и управлять 10 мкл кетамина / ксилазина внутрибрюшинно на грамм веса тела таким образом, что животные получали дозу кетамина в дозе 100 мг / кг и 10 мг / кг ксилазина. Мыши должны быть полностью в отключке и заметно дыхание в течение 2 мин кетамина администрации / ксилазина.
5. Для поддержания глазной влаги в седативных животных, мягко втирать небольшое количество искусственных слез мази на каждый глаз.
6. Поместите седации мышей на сетке, так что головки позиционируются в области, которая получает наибольшее рентгеновского излучения винтенсивность (фиг.2В, С). Щит органы от шеи вниз с соответствующим размером ведущую трубу, чтобы заблокировать системную доставку X-лучей (рис 2D).
7. Поместите расположенные мышей под рентгеновского луча таким образом, что лазерный обозначающий фокус на рентгеновского пучка в начале координат (0,0) на макет сетки. Начните доставку X-Ray.
8. При подаче Рентгеновский удалим животных от облучателя и место на теплую грелку. Не дом седации животных с сознательными животных, пока животные не восстановили достаточно сознания, чтобы сохранить грудины отдохновение. После того, как животные могут поддерживать грудины отдохновение, место сознательные животных обратно в их соответствующих клетках.
9. Повторите эту процедуру на 3 и 4 на общую сумму три фракционированных доз радиации.

3. Трансфекция

День -1:

1. Подготовка D10 носитель путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 500 мл Дульбекко Мodified Eagle Medium (DMEM).
2. Подготовка Т-клеток носитель (TCM), добавляя 5,5 мл L-глутамина, 5,5 мл пируват натрия, 5,5 мл несущественные аминокислоты и 5,5 мл pencillin / стрептомицин (ручка / стрептококк) с 500 мл среды RPMI-1640. Затем добавьте 550 мкл 2-меркаптоэтанола и 550 мкл гентамицина. И, наконец, добавляют 50 мл FBS.
3. Урожай в пробирке, культивируемые клетки HEK293T и довести до концентрации 7,5 х 10 ⁶ клеток / мл в D10 СМИ.
4. Пластина 10 мл D10 медиа и добавьте 1 мл суспензии HEK293T клеток в каждом из 16 х 10 см поли-D-лизина (PDL) Плиты покрытием.
5. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% СО _2.

День 0:

6. Замените носитель с 10 мл свежего D10, по крайней мере 30 минут до трансфекции клеток.
7. Определить количество векторной плазмиды, PCL-Eco вектор, липосомной трансфекции реагента, необходимого для трансфекции путем умножения общего количества пластин + 1 (16 + 1 = 17) 14,1 мкгплазмидный вектор (14,1 х 17 = 239,7 мкг), 9,9 мкг PCL-Eco вектор (9,9 х 17 = 168,3 мкг) и 60 мкл липосомальной трансфекции реагента (60 х 17 = 1020 мкл). Все реагенты должны быть комнатной температуры перед приготовлением растворов.
8. Этикетка две трубки А и В. В трубе А, добавьте 239,7 мкг векторной плазмиды и 168,3 мкг PCL-Eco вектора (1,5 х 17) мл, с пониженным содержанием сыворотки модифицированной среде орла (RS-MEM). В трубе Б, добавить 1020 мкл липосомальной трансфекции реагента (1,5 х 17) мл RS-MEM.
9. Инкубируйте А и В по отдельности в течение 5 мин при комнатной температуре.
10. Смешайте А и В вместе аккуратно (вихрь в течение 1-2 сек или инвертировать несколько раз) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре с образованием липидов / комплекса ДНК.
11. Добавить липид / ДНК падение сложную стрелке, чтобы HEK293T клеток в 10 см блюдо.
12. Выдержите при 37 ° С в течение 6-8 ч или на ночь (не более 24 ч).
13. После 6-8 часов инкубации, заменить среду с 12 мл свежего TCM для вирусного производства. Это покрыло СМИбудет использоваться на 2-й день, как вирусный супернатант для Т-клеток трансдукции.

4. спленэктомия и Т клеточный препарат

День 0:

1. Налейте 10 мл TCM в коническую 50 мл и место на льду для сбора селезенки.
2. Жертвоприношение соответствующее количество животных СО ₂ удушья и среднего обезглавливания: Место животных в клетке принимающей CO ₂ при расходе 10-30% клетки объем / мин, в руководящих Американская ветеринарная медицинская ассоциация (не более 5 животных не может быть не приносится в жертву одновременно) до тех пор, дыхания прекращается и в течение двух минут после этого. Удалить животных из CO ₂ камеры и обезглавить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один селезенка 6-12 недельных самок C57BL / 6 мыши получается примерно 4,5-5 х 10 ⁷ спленоцитов. Здесь четыре селезенки будет собрано около 200 × 10 ⁶ клеток.
3. Положите мышь так, чтобы его правая сторона обращена вверх, испрей с 70% этанола. С помощью пинцета, возьмите тонкую складку кожи под левой грудной клетки и вырезать небольшой разрез с помощью ножниц. Отогните кожи, тщательно захватить тонкую складку брюшины щипцами, и вырезать небольшое углубление.
4. Селезенка небольшой, удлиненные, темно-красный орган, который напоминает сплюснутый боб; деликатно захватить селезенки с пинцетом и акциза путем срезания окружающую соединительную ткань. Поместите вырезали селезенки в коническую, содержащей 10 мл TCM на льду.
5. Налейте селезенки более сито сетка клетки 70 мкм с разбивкой по признаку пюре с тупым концом внутренней 5 мл шприц, чтобы создать один-клеточной суспензии. Не более двух селезенки должны быть разбиты на сито петли.
6. Используйте небольшой объем TCM тщательно мыть сито следующий разбивку собрать все оставшиеся спленоцитов. Бассейн все разукрупненные селезенки в одной клеточной суспензии. Доведите конечного объема до 50 мл на один TCM стирки сбы вращаться на 300 мкг в течение 10 мин.
7. Приготовьте раствор 1x буфера для лизиса путем добавления 5 мл буфера для лизиса 10x в 45 мл стерильной воды. Для устранения красных кровяных клеток, ресуспендируют осадок в 5 мл 1x буфера для лизиса в селезенке в 50 мл конические, хорошо перемешивая, осторожно пипеткой вверх и вниз. Если более 5 раздражительность, используйте 250 мл центрифужную пробирку. Поместите коническую центрифужную пробирку или в C водяной бане 37 ° С в течение 5 мин.
8. Удалить реакцию лизиса из водяной бани и добавить TCM в соотношении 1: 1 с буфером для лизиса для нейтрализации реакции. Вымойте спиннинг в 300 мкг в течение 10 мин.
9. Отберите супернатант и полностью ресуспендируют осадок в традиционной китайской медицине (2 мл / селезенка, 8 мл Всего за 4 селезенки) с помощью пипетки вверх и вниз.
10. Количество клеток путем добавления 10 мкл клеточной суспензии в 190 мкл трипанового синего (1:20 разбавление). Умножьте полученную в одном из четырех сетчатых квадратов 20 х 10 ⁴ х общего объема (8 мл) номер, чтобы получить общее количество клеток (например, 125 клеток х 20 х 10 ⁴ х 8 мл = 200 х 10 ⁶ спленоцитов).
11. Развести клетки в концентрации 2 × 10 ⁶ клеток / мл в TCM, с добавлением 2 мкг / мл конканавалин (ConA) и 50 МЕ / мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (чрИЛ-2). Таким образом, для 200 х 10 ⁶ спленоцитов, добавить 92 мл средства массовой информации в 8 мл клеток, 200 мкг coña и 5000 МЕ рИЛ-2.
12. Добавить 2 мл клеток в каждую лунку 24-луночных тканевых культур, обработанных пластин, таким образом, что 4 × 10 ⁶ клетки в каждой лунке (например, 100 мл клеток потребуется примерно 4 пластины).
13. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% СО _2.

5. Трансдукция

День 1:

1. Рассчитать количество не тканевой культуры рассматриваются 24-луночных планшетах, необходимые для трансдукции путем умножения количества селезенки собирали 2 (8 пластин, необходимых для 4 селезенки).
2. Затем вычислите необходимый объем рекомбинантный фрагмент человеческого фибронектина решения (RHFF)необходим для покрытия пластин путем умножения (общее количество скважин + 3) х 0,5 мл (8 пластин х 24 скважины = 192 + 3 = 195) х 0,5 мл = 97,5 мл.
3. Подготовьте 97,5 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащего RHFF в концентрации 25 мкг / мл путем умножения суммарного объема на 25 мкг (97,5 х 25 = 2437,5 мкг). Добавить такое количество RHFF 97,5 мл PBS.
4. Шерсть без тканевой культуры обрабатывают 24-луночных планшетах путем добавления 0,5 мл PBS / RHFF решение на лунку.
5. Инкубируют в течение ночи при 4 ° С.

День 2:

6. Кузов раствор PBS / RHFF от не-культуре ткани обрабатывают 24-луночных планшетах.
7. Добавить 1 мл / лунку 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
8. Удалить BSA, крепко переворачивая плиту. Промыть добавлением 2 мл PBS.
9. Сбор вируса супернатант перенос носитель из каждого HEK293T PDL пластины в 250 мл центрифужную пробирку и спин 10 мин при 500 х г.
10. Тщательно передачи вируса SUpernatant в свежем 250 мл центрифужную пробирку, будучи уверенным, чтобы не нарушить клеточный осадок, которые могли образоваться.
11. Добавить свежий TCM к вирусным супернатантом, так что конечный объем 3 мл больше, чем количество, необходимое для RHFF покрытием скважин. Например, для 192 скважин RHFF покрытием, довести объем вирусного супернатанта с 192 мл + 3 = 195 мл.
12. Удалить культивируемые спленоциты из инкубатора и ресуспендируют, осторожно пипеткой вверх и вниз 2 - 3 раза в каждую лунку. Переход к 250 мл конической. При использовании многоканальной пипетки, используя стерильный резервуар перед передачей поможет ускорить этот шаг. Граф, как описано выше, и спина при 300 мкг в течение 10 мин.
13. Добавить чрИЛ-2 вирусной супернатанта при концентрации 50 МЕ / мл. Например, добавьте 50 х 195 = 9750 МЕ чрИЛ-2 до 195 мл вирусной супернатант.
14. Ресуспендируют спленоцитов вирусной супернатанта на 1 х 10 ⁶ клеток / мл
15. Добавить 1 мл / лунку спленоцитов суспензии RHFF покрытием 24-луночных планшетах.
16. Спин в течение 90 мин в соответствии со следующими настройками: 770 мкг, ускорение = 4, тормоз / торможение = 0, 32 ° C.
17. Подготовьте TCM решение с 50 МЕ / рИЛ-2 мл. Например, приготовить раствор 200 TCM добавлением 10000 МЕ чрИЛ-2. Добавить 1 мл рИЛ-2 / TCM в каждую лунку после центрифугирования.
18. Культура в течение ночи при 37 ° С в 5% СО _2.

6. CAR Т-клеток Культура и урожай

Дни 3 и 4:

1. Если Т-клетки достичь> 80% слияния, клетки могут быть разделены (обычно это происходит в день 3 или 4 день). Чтобы разделить клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз в каждой лунке 2-3 раза, а двигаться 1 мл из каждой лунки в новые лунки свежего 24-луночного культурального-обработанной пластины. Затем добавляют 1 мл свежей TCM 50 МЕ / мл IL-2 в каждую лунку так, чтобы конечный объем составляет 2 мл во всех скважинах.
2. Если клетки не достигают> 80% слияния, выполнить половину изменение медиа медленно пипетки с 1 мл среды из каждой лунки. Избегайте Disturbing клетки оседали на дно, удаляя СМИ. Добавить 1 мл свежей TCM, содержащей 50 МЕ / мл чрИЛ-2.

День 5:

3. Ресуспендируйте CAR Т-клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз 3 раза в каждую лунку и перенести в 250 мл центрифужную пробирку. Спин клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
4. Полностью аспирация супернатант, не нарушая гранул. Промывают один раз PBS, рассчитывать клеток, как описано ранее, и промывали PBS во второй раз. Типичный выход CAR Т-клеток составляет примерно 1 × 10 ⁶ клеток на лунку (8 пластин х 24 скважин = 192 х 10 ⁶ CAR Т-клетки).
5. Ресуспендируют клеток в PBS в концентрации 5 х 10 ⁷ / мл для инъекции 1 × 10 ⁷ в объеме 200 мкг (например, для 192 × 10 ⁶ CAR Т-клеток, ресуспендируют осадок промывали в 3,84 мл PBS).

7. CAR T Администрация ячейка мышей с опухолями

День 5:

1. TranspoRT клетки на льду за животными для внутривенных инъекций. Добавить 500-1000 мкл в инсулиновый шприц с 27 - 31 г иглы, гарантируя, что все пузырьки исключен.
2. Возьмите мыши в основание хвоста и разместить в трубе фиксатор.
3. Потяните хвост в натянутом состоянии, с вены обращена вверх, и скользить иглу примерно 1-2 мм под кожу в вену, вставив его параллельно в хвостовую вену. Медленно высылать 200 мкл в вену. Если игла вставлена ​​правильно в вену, объем будет легко течь в; в противном случае будет сопротивление и игла должны быть удалены из хвоста и вновь установлена ​​правильно.

Результаты

CAR Т-клетки генерируются трансдукции ретровируса вектора EGFRvIII CAR ^11. Этот вектор, MSGV1, был разработан на основе SFGtcLuc_ITE4 вектора ^35, который содержит вирус мышиного стволовых клеток (MSCV) длинные концевые повторы, расширенный кляп область и конверт сайта сплайсинга (разъем доноро?...

Обсуждение

Лечение график описано здесь был разработан, чтобы моделировать клинический стандарт медицинской помощи и использовать его последствий для автомобиля приемной терапии. CAR Т-клеток дозы, ТМЗ схемы, и администрация лучевая терапия могут быть изменены для повышения в естественных усл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector	Imgenex	10045P	Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A	Sigma Aldrich	C2010	Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin	ClonTech/Takara	T100B	Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019	Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate	Life technologies	11995-065	HEK293 culture media
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life technologies	11058-021	Transfection media
200 mM L-Glutamine	Life technologies	25030-081	T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate	Life technologies	11360-070	T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life technologies	11140-050	T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol	Life technologies	21985-023	Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life technologies	15140-122	T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml)	Life technologies	15750-060	T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products	100-500	Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade	Gemini Bio Products	700-100P	Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate)	BD Biosciences	555899	Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers	Corning	352350	Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine	Corning	356469	Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
[header]
Temozolomide	Best Pharmatech	N/A	Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Life Sciences	D2650	Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline	Hospira	IM 0132 (5/04)	Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl	Henry Schein Animal Health	11695-0701-1	Ketamine solution
AnaSed	Lloyd Inc	N/A	Xylazine sterile solution 100 mg/ml