В Utero Intra-сердечная томатно-лектин инъекций по эмбрионов мыши, чтобы измерить почек кровотока

Резюме

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Аннотация

Формирование и перфузии развития почечной кровеносные сосуды (кроме клубочков) значительно изучено недостаточно. Как сосудистой развивается с помощью ангиогенеза (который ответвляется крупных сосудов) и васкулогенез (De Novo образования сосудов), методы картирования перфузии, такие как смолы слепков, в естественных условиях ультразвуковой визуализации и микро-рассечение были ограничены в демонстрации интимных отношений между эти два процесса и развития почечной структуры в зародыше. Здесь мы опишем процедуру внутриутробному внутри сердца под ультразвуковым контролем FITC-меченных томатов лектин микроинъекций на эмбрионах мыши, чтобы измерить онтогенез почечной перфузии. Томатный лектин (TL) заливают по всему эмбриону и почек урожая. Ткани совместно окрашивали для различных структур почек, включая: нефрона предшественников, нефрона структур, мочеточника эпителия и сосудов. Начиная с E13.5 крупных сосудов калибра перфузировали, однако периферическойсосуды оставались unperfused. По E15.5 и E17.5, небольшие периферические сосуды, а также клубочки начал становиться перфузии. Это экспериментальная методика имеет решающее значение для изучения роли сосудистой и кровотока во время эмбрионального развития.

Введение

Во время эмбрионального развития два дискретные, но одновременно, сосудистые процессы происходят: ангиогенез, процесс, при котором сосуд растет от основной предварительно существующего судна, и васкулогенезе, который заново образование сосудов из жилых эндотелиальных клеток-предшественников ^1,2. Соответственно, первое является синонимом кровотока, а второй, как полагают, в значительной степени имеют место в отсутствие него.

Одновременно с образованием кровеносных сосудов, циклический и динамичный процесс синтеза почек клеток-предшественников, пролиферации и дифференцировки начинает разворачиваться на день эмбрионального 9,5 (E9.5). На данный момент мочеточника бутон (UB) вторгается дорсально в окружающую метанефрической мезенхиму (мм), и продолжается до рождения ^3. Повторное разветвление UB в быстро конденсации метанефрической крышки мезенхимы начинается формирование функциональных подразделений почек, нефрона. С каждым новым поколением УБ и НефРон, старшие поколения смещаются во внутренние коркового и мозгового регионах, где они затем подвергаются дальнейшему созреванию и дифференциации в первую очередь сосудисто-плотных средах. Как видно из Дресслера и др., ^3, этот процесс эмбрионального осаждают индуктивной передачи сигналов, таких как перекрестные помехи между UB и ММ, и множество внеклеточных факторов ^3-6. Два недавно исследовали внеклеточные факторы в рамках развивающегося поджелудочной железы и почки включают напряжение кислорода и кровоснабжение ^7,8. Последнее будет обсуждаться более подробно ниже со отношению к развитию почек.

Для того, чтобы подвергать индуктивный роль, что поток крови потенциально играют в дифференциации клеток-предшественников нефрона, а также в других процессах органогенеза, точных и точных методов эмбрионального отображения кровотока является обязательным условием.

Альтернативные методы замера кровоток включают рецепт улtrasound изображений и смолы бросает ^9,10. Окончательно, эти режимы, как было показано, чтобы быть по своей природе не хватает в их способности одновременно обнародует временные и пространственные сопоставления между кровотоком и дифференцировку стволовых клеток. Смола отливок, например, обеспечить действительное модель сосуда рисунка в тканях взрослого организма, однако в незрелых сосудов, таких как эмбриональные с моментами времени, сосуды сильно развиты и вытекающей. Таким образом, смола бросает не проведет в крошечных, часто пористый, сосудов.

Для этих очевидных препятствий, в частности, мы решили включить УЗИ наведением в естественных условиях внутри сердца эмбриональных помидор лектина (TL) микроинъекций в наших исследованиях развития почек. В этой процедуре мы используем ультразвуковой зонд синхронно направлять установленный микропипетки иглы, наполненный 2,5 мкл TL раствора в левый желудочек из мышиных эмбрионов в точках E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 и время. E170,5 является последняя возраст развитием, иглы не достаточно сильны, чтобы проникнуть в более развитый эмбрион.

Преимущества этого метода микроинъекции в изобилии. Ультразвуковая руководствуясь микроинъекции позволяет точно позиционировать иглу для инъекций в течение эмбрионального левого желудочка, пассивный и контролируемое изгнание раствора в бьющееся сердце животного, минимальным ущербом для сердца и окружающих тканей, и во избежание внезапной сердечной недостаточности и смерти эмбрион до полного тела перфузии. С использованием FITC-меченого TL, любой перфузии сосудистой будет поддерживать маркер вдоль ее эндотелиальной апикальной мембране. В сочетании с иммуногистохимии, используя PECAM (CD31, тромбоцитов эндотелия молекулы клеточной адгезии) и различные другие сосудистые маркеры, мы можем четко различать перфузируемые и ООН-перфузии сосудов, а также охарактеризовать любые аберрантные окрашивание окружающих тканей.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Питтсбургского университета Институциональные животных уходу и использованию комитета утвердил все эксперименты.

1. Подготовка Ультразвуковая микроинъекции инструменты и эмбрионов

1. Настройка этап, горы, и зонд (рисунок 1), а также хирургические инструменты (Рисунок 2). Место фосфатный буферный раствор (PBS) раствор (рН 7,4) в C потепления бане 37 °. Заполните микроинъекции иглы полностью с минеральным маслом, с использованием 1 мл шприц, присоединенный к второй гибкой иглы 25 G, через его основание.
2. Fix иглу на вращение крепление руку, и пустой игла раствором минеральной нефти. Залить 2,5 мкл TL решения. Убедитесь, что пузырьки воздуха не присутствуют в инъекционной иглы. Поверните иглу руку по направлению к стене, подальше от сцены.
3. Обезболить беременной матери в анестезии камеры посредством непрерывной инфузии изофлюрана. Когда мать потерял сознание, перенести наркоз, нос трубки, расположенной на сaudal сторона сцены, и место матери в положении лежа на спине с рыла носом трубы, чтобы продолжение полностью под наркозом государства.
4. Ленточные конечности в 45 °, или с руками и ногами отдохнувшим и позиционируется возвышаться ЭКГ вкладки / монитор температуры. Важно, что беременной плотины постоянно контролироваться, чтобы гарантировать, что анестезии является достаточным и что мазь, приложенного к глазам, чтобы уменьшить сушки.
5. Применить Удаление волос по всей нижней части живота матери, нежно протрите сухим ватным тампоном, а затем снова с 70% этанола, насыщенных ватные тампоны, чтобы удалить излишки продукта и волосы. Убедитесь, чтобы очистить брюшную кожу от всех волос на месте разреза (рис 3).
6. Выполните лапаротомии на беременной матери Использование тонких хирургических щипцов и ножниц. Будьте осторожны, чтобы избежать сокращения каких-либо серьезных судов или внутренних органов. Сделайте первый, прямой разрез эпидермиса 1,5-2 см выше влагалища и продолжают резать к ребрами для approximatЭли 2-3 см. Expose подкожной мембрану, найдите белой линии ("Белая линия") (Рисунок 3), и параллельно начальной разрез вдоль той же длины, чтобы разоблачить внутренний внутренних органов и матки мешочки.

2. Добыча эмбрионов

1. Используйте 6-дюймовые ватным аппликаторы для маневра мать и эмбрионов. Аккуратно надавите (не заставляйте) на коже с аппликатором, чтобы манипулировать первый зародыш из отверстия разреза. После извлечения первого эмбриона мешочка, медленно и осторожно потяните оставшуюся часть рога матки через и на внешности матери. Избегайте потянув кишечника или других органах, через разрез на данном этапе.
2. Количественная эмбрионов и осторожно положите левый рог матки обратно в матери. Тогда начнет размещение правильный рог матки обратно в матери, начиная с эмбриона мешочек, наиболее удаленном от влагалища на рога и двигаться вниз. Продолжайте это до тех пор только два эмбриона остаются открытыми (Fiфигура 4). Наконец, эмбрионы позиции в столбце выше и параллельно линии разреза, будучи осведомленным не отрезать приток матки.
3. Поместите глиняных блоков и положение между руками и туловищем, а также ноги и хвост. Убедитесь, что глинистые поверхности примерно на одном уровне с лапаротомии разрез. Смочите Фенестрированные чашку Петри с 37 ° C PBS.
4. Возьмите, проходящих щипцы с правой стороны, и Фенестрированные чашки Петри с левой стороны (фенестрация параллельно эмбрионов) и принести закрытую щипцы ~ 5 см через оконных, из верхней части чашки Петри. Открытые щипцы полностью, не разрывая светопрозрачных сетку.
5. Маневр руки над эмбрионами и сосредоточиться взгляд на двух эмбрионов мешочков. Без (или слегка) касание мешочки с оконных сетки или пинцетом, сдвиньте их через щель и установить чашку Петри на животе матери. С щипцы еще расширен, манипулировать Фенестрированные сетку, чтобы усадить его на обе стороны, и в основании каждого эмбриона (рис 5 ) и потяните щипцы из отверстия щели.
6. Далее, поместите синий каучук, содержащий стену в чашку Петри, без защемления или ранения эмбрионов (Рисунок 6). Убедитесь, что глиняные блоки прочно балансировки чашку Петри, эмбрион, резино-содержащие стену. Наконец, заполнить чашку Петри с 37 ° C PBS до эмбрионы полностью погружены (рисунок 6), в то время как контроль на герметичность в фенестрированной сетки.

Процедура 3. Инъекции

1. Нижняя ступень впрыска с матерью и эмбрионов вниз, используя ручку регулировки Z-уровень (Рисунок 1), а затем поверните инъекционной иглы и установите руку и выстраиваются непосредственно с ультразвукового зонда, с иглой ½ см слева и под зонда (рис 7) , Нажмите игольчатые руку (не иглы) 45 ° вдали от зонда. Будьте осторожны, чтобы не ударить кончик иглы с блюдом или ультразвукового зонда.
2. Поднимите этап инъекций Вернуться к первоначальной высоты, с ультразвуковым рхалат прямо над эмбрионов зонд должен быть слегка погружен в пределах 3-4 мм от эмбриональной ткани. Использовать рентгеновские & Y ступень регулирующего ручки (Рисунок 8) внести изменения в положение эмбриона / мать / Stage систематически местонахождение избиения эмбрионального сердца.
3. Непосредственно центр ультразвуковой экране наблюдать черную центр целевой маркер обращается (*). Найдите левого желудочка (предпочтительно) или атриум с помощью ручки регулировки этап X и Y (рис 8), а затем поднять или опустить стадию с использованием ручки вращающийся на сцену, чтобы конечное положение впрыска точно над черным центрального маркера на экране ультразвука.
4. Используйте ручку регулировки этап X, чтобы переместить эмбрион вправо, от экрана ультразвука. Повторно микроинъекции иглу и руки обратно на место, ½ см от 90 ° до ультразвукового зонда (рис 7).
5. Использование микроинъекции крепления ручек регулировки (рис 9C-G), то положение иглы с наконечником ясно альigned с центральной маркера. Отрегулируйте угол впрыска (с помощью ручки на рисунке 9C и EG), и X, Y, и Z векторы микро-иглы для обеспечения кончик иглы ориентирована в правильном плоскости. Уберите микроинъекции иглу с помощью исключительно на "инъекцию" ручку (рис 9F), стараясь не изменить другие размеры.
6. Опять же, используя исключительно X тонкой ручкой регулировки этап перемещения эмбриона обратно под зондом, с целью точно на центральной меткой на экране ультразвука. Убедитесь, что левый желудочек теперь точно на том же X, Y, и Z плоскости.
7. Далее, только с "инъекции" ручку на микроинъекции крепление, медленно проколоть эмбриона с микроинъекции иглы и постепенно довести наконечник в левый желудочек. Вводите полные 2,5 мкл TL раствора в левый желудочек или до пустых звуков предупреждающий сигнал, путем проведения "пустой" и нажав "заполнить" один раз (рис 2А & B). В это времявпрыска наблюдать тень, исходящую от кончика иглы, которая TL ввода в сердечной камеры (рисунок 10). В обратном направлении, быстро убрать микроинъекции иглу вращающийся "инъекции" ручку (рис 9F) на микроинъекции установить, когда инъекция завершена.
8. Продолжить на следующей эмбриона и повторите эту процедуру для оставшихся эмбрионов, следующих за этим ряд шагов, и, наконец, поставить окончательные эмбрионов обратно в живот плотины. Включите анестезии в камеру коробки и осторожно двигаться сюда мать в течение 15 мин со времени последней инъекции.

4. Сбор эмбрионов и анализ

1. Жертвоприношение плотину с помощью смещения шейных позвонков. Развернуть лапаротомия разрез с легкостью удалять рога матки от матери. Держите эмбрионов в матки мешка. Поместите эмбрионы в охлажденном PBS.
2. Проанализируйте эмбрионов из матки мешка (при необходимости собирать ткань для генотипирования) и поместите весь эмбрион яп 4% параформальдегид (PFA) в течение ночи, а затем в 30% сахарозы в одночасье, заморозить в криостат секционирования среду. Затем вырежьте cryosection и поместить его на слайды для иммуногистохимического анализа. Возможно, использовать ткани для целого монтажа путем дегидратации в 100% метанола, после фиксации в 4% PFA.
3. Для иммуногистохимического анализа поместить криосрезы в PBS, чтобы удалить октября Затем блок секции 10% нормальной сыворотки осла в течение 30 мин. Затем добавить РЕСАМ первичного антитела в разведении 1: 100 в течение ночи при 4 ° С. На следующий день, мыть слайдов в PBT 3 раза по 10 мин каждый и добавить осла против крысу 594 среднее и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень требовательных техника требует оптимизации и координации ультразвука и микроинъекции. Существует очень крутой кривой обучения, связанные с этой технологией и требует 5:56 недель обучил инъекций, прежде чем становится опытным.

Результаты

Сосудистые образования предшествует поток в развитии почек

Большинство из эмбриональной ткани (в том числе почки) содержит плотную сосудистую (как unperfused и перфузии), даже на ранних эмбриональных моменты времени. Чтобы лучше калибра и анализа кровотока в развивающихся п...

Обсуждение

Микроинъекция анестезия и временные рамки

Что касается анестезии матери, важно, чтобы поток воздуха константу (2-3 л / мин) и при низкой PSI. Поток успокоительное должно быть проведено примерно в 1.75-2 л / мин. Одновременно, сроки, в которых инъекции происходят должны быть тесн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10