Высокоточных измерений Цинк Изотопные Применительно к мыши органов

Резюме

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Аннотация

Мы представляем процедуру измерения с высокой точностью соотношения изотопов цинка в органах мыши. Цинк состоит из 5 стабильных изотопов ⁽⁶⁴ Zn, Zn, ^{66 67, 68} Zn Zn и ⁷⁰ Zn), которые, естественно, фракционированных между органами мыши. Покажем сначала, как распустить различные органы для того, чтобы бесплатно атомы Zn; Этот шаг реализуется с помощью смеси HNO ₃ и H ₂ O _2. Затем очистить атомов цинка от всех других элементов, в частности, из изобарических помех (например, Ni), с помощью анионообменной хроматографии в разбавленных HBr / HNO ₃ среде. Эти первые два шага выполняются в чистом лаборатории с использованием химических веществ с высокой степенью чистоты. Наконец, изотопные измеряются с помощью мульти-коллектор с индуктивно-связанной плазмы масс-спектрометр, в низком разрешении. Образцы вводят с помощью камеры распыления и изотопного фракционирования, вызванную масс-спектрометра является correcTed, сравнивая соотношение количества образцов в соотношении стандарта (стандартной методике вилка). Это полный Типичная процедура производит соотношение изотопов с 50 млн (2 SD) воспроизводимости.

Введение

Измерение высокой точности (лучше, чем 100 частей на миллион / атомная единица массы) цинка стабильный изотоп состав было возможно только в течение примерно 15 лет благодаря развитию мульти-коллекторных плазменный источник масс-спектрометров и с тех пор в основном применяются в Земле и планетарных наук. Приложения к области медицины являются новыми и имеют большой потенциал в качестве биомаркеров для болезней, которые изменяют метаболизм цинка (например, болезни Альцгеймера). Эта статья сообщает метод измерения с высокой точностью природных стабильных изотопов цинка в различных органах мыши. То же самое применимо к образцам человека. Суть метода состоит в растворении органов, химической очистки цинка из остальных атомов, а затем в анализе соотношение изотопов на масс-спектрометре.

Качество Zn изотопных измерений зависит от качества химической очистки (чистоты Zn, низкое пустым оценочногоared к количеству Zn, присутствующего в образце, с высоким химический выход из процедуры) и на контроле инструментальной смещения. Высокой чистоты конечного Zn фракции необходимо удалить обе изобарических помех и неизобарических помех, которые создают эффект матрицы. Изобарические нуклиды создать прямые помехи (например, ⁶⁴ Ni). Неизобарических помехи генерируют так называемую "матрицу" эффект и изменить аналитическую точность измерений при изменении состояния ионизации по сравнению с чистого цинка стандарта, к которому образцы по сравнению с ^1. Низкий пустым (<10 нг) указывает, что нет загрязнение образцов внешним Zn, которые смещения измеренного изотопного состава. Как Zn изотопы могут быть фракционированию во ионообменной хроматографии ^2, совокупность всех атомов Zn гарантирует, что изотопный фракционирования не происходит, что означает, что химическая процедура должна иметь полный выход, Наконец, коррекция инструментальной изотопного фракционирования при измерении масс-спектрометрии делается с помощью метода "стандарт" брекетинга.

Таким образом, основные трудности для получения точных измерений контролируют внешнего загрязнения (т.е. низкой пустым), производя полный выход химическую очистку, которая очищена от каких-либо других атомов или молекул, и коррекции инструментальный изотопного фракционирования на массового спектрометра. В этой статье мы опишем наш аналитический протокол, чтобы отделить Zn из органов мыши, а также измерений масс-спектрометрические.

Добыча производится с использованием малое количество разбавленных кислот (HBr / HNO ₃ СМИ) на микро-колонки (0,5 мкл и 0,1 мкл) анионообменной смолы. Он имеет полное выход и измерения имеют внешний воспроизводимость лучше, чем 50 частей на миллион по соотношению ⁶⁶ Zn / Zn ^64. Еще одно преимущество метOD, что это очень быстро. Способ, таким образом, очень хорошо адаптированы к медицинских наук, в которой нужно анализировать большое количество образцов по сравнению с геонауках, где были разработаны эти аналитические методы.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры с участием животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) в Университете Париж Дидро в.

1. Подготовка материалов

1. Суб-кипят перегонять 1 л кислот (HNO _3, HBr) для того, чтобы очистить их от примесей.
2. Очистите стаканы и наконечник адаптер в горячей (~ 100 ° С) сосредоточены ванну HNO ₃ кислоты, по крайней мере два дня.
3. Вымойте наконечники в холодной 3 н HNO ₃ бане в течение нескольких дней и промыть отдельно три раза деионизированной водой.

2. Подготовка образцов

1. Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина. Оценка анестезии по методу палец пинча.
2. Собирают кровь сердечной пункцией в присутствии гепарина в 1,5 мл пробирки.
3. Отделите плазму от клеток крови центрифугированием (10 мин, 1500 мкг) и передать плазму полипропилена Cryogenic флаконы, используя подсказки полипропиленовые.
4. Удалите остатки крови из органов за счет сокращения печеночных вен и инъекционных DPBS через сердце. Оценка гибель мышей путем смещени шейных позвонков.
5. Урожай органы стерильными инструментами из нержавеющей стали, освободить их от окружающих жир, если таковые имеются, и оснастки заморозить их в полипропиленовые флаконы криогенных.

3. Химическая очистка

1. Во-первых, распустить образцов в смеси ~ 1 мл концентрированной (30%) H ₂ O ₂ и ~ 1 мл концентрированной (~ 15 м) HNO _3. У всех этих шагов внутри вытяжного шкафа.
   1. Поместите весь орган интерес в 15-миллилитровую тефлоновую мензурку. Затем добавьте H ₂ O ₂ / HNO ₃ в стакан ^5. Хранить стакан открыт в течение нескольких минут, чтобы избежать брызг за счет реакции окисления органического вещества и выделением СО _2.
   2. Наконец, поставить стакан на горячей плите при Абоут 100 ° С в течение нескольких часов или до решения совершенно ясно.
2. Открыть стакан и высушить раствор на горячей плите при температуре около 100 ° С.
3. После того, как образец сухой, добавьте 1 мл 1,5 N HBr к образцам; закрыть стакан, и пусть он распустить на горячей плите при 100 ° С в течение нескольких часов.
4. Между тем приготовить 500 мкл колонки.
   1. Добавить 500 мкл сетки смолы AG1X8 200-400 на колонку и положить его на полку колонки с мусорном стакане под ним. Промыть смолы чередованием: 5 мл 18,2 МОм ⋅ см воды, 5 мл 0,5 н HNO _3, 5 мл воды, 5 мл 0,5 н HNO _3, а затем 5 мл воды. Используйте кондиционер смолы с 5 мл 1,5 N HBr.
5. Удалить стаканы из горячей плите и поместить их в ультразвуковой ванне в течение 30 мин, а затем позволить стаканы остыть до комнатной температуры.
6. После того, как стакан охлаждают и смолу промывают, открыть мензурку. Положите адаптер наконечника Тон шприц, добавьте пипетки; пипетки на 1 мл образца и загрузить его на смоле (очень медленно, чтобы не перемешивать смолу).
7. После того как все жидкость проходит через колонку, добавляют 5 мл 1,5 N HBr.
8. После того, как 5 мл 1,5 N HBr через колонку, заменить мусора стакан с чистой 15 мл химический стакан.
9. Добавляют 5 мл 0,5 н HNO ₃ 2,5 мл за один раз. На этом этапе Zn элюируют из смолы.
10. После того, как 5 мл HNO ₃ проходит через колонку, снимите стакан и поместить его на горячей плите при 100 ° С до тех пор, пока сушат.
11. Удалить столбец из держателя колонны; мусор смолы (использовать новую смолу для каждого образца).
12. После того, как образец высохнет, повторите протокол с таким же объемом кислот на меньшем колонке (100 мкл), а затем поместить его на горячей плите, пока не высушили. Образец готов к масс-спектрометрии.

4. Масс-спектрометрия-Измерение

1. Анализ изотопного компо Znложение на нескольких коллектор-индуктивно-связанной плазмы масс-спектрометра (МС-ICP-MS).
   1. Используйте параметры машины приведены в таблице 1.
2. Поместите чашки Фарадея, чтобы собрать в массе (m / z) ⁶² Ni, Cu ^{63, 64} Zn, Cu ^{65, 66, 67} Zn Zn и ⁶⁸ Zn.
3. Приготовьте раствор, содержащий 500 частей на миллиард Zn в 0,1 М HNO ₃ для изотопного анализа.
4. Проанализировать 500 частей на миллиард раствор Zn с помощью распылительной камеры в сочетании с 100 мкл / мин тефлоновой распылитель. Для каждого образца, измерения 30 сканирований (1 блок из 30 циклов), в которых время интегрирования каждой развертки 8,389 сек.
5. Исправьте фон путем вычитания на пик интенсивности нулевые от контрольного раствора (0,1 М HNO ₃ раствора, используемого для повторного растворения образцов).
6. Контроль и правильно можно ⁶⁴ Ni изобарической вмешательство путем измерения интенсивности пика ⁶² Ni.Предположим, что / ⁶² Соотношение ⁶⁴ Ni Ni естественно (0,2548), правильно это значение из инструментальной предвзятости массовой, а затем удалить ⁶⁴ Ni от массы 64, как:
   ⁶⁴ Zn _{реального} = ⁶⁴ Zn _{измеряется} - ⁶⁴ Ni = ⁶⁴ Zn _{измеряется} - ⁽⁶⁴ Ni / ⁶² Ni), _{естественно} х ⁶² Ni _{измерить.}
7. Откорректируйте инструментальную массовое смещение в скобки каждого из образцов с 500 частей на миллиард стандартного раствора стандарта СМК Лион Zn (или другого доступного стандарта, например IRMM-3702). Выполнение стандартного брэкетинг путем деления Zn соотношение образца ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ от среднего значения Zn отношение двух стандартов измеренных до и после образца минус 1 и умноженное на 1000. ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ (смотри уравнение 1). Типичный внешний точность по стандарту СВК Лион Zn 0,05 permil / нуклон (2 стандартное отклонение, 2 SD).

Результаты

В 1,5 N HBr, основные виды цинка (ZnBr3-) формы очень сильные комплексы с анионообменной смолой, тогда как большинство других элементов не взаимодействуют со смолой. Цинк затем извлекают путем изменения среды в разбавленной HNO _3, изменение видообразования Zn в Zn2 ^+, который высвобожда...

Обсуждение

Воспроизводимость измерений оценивается через воспроизведены анализа тех же образцов, проведенных в различных аналитических сессий. Например ^6, мы воспроизвели ту же скалу земной 7 раз, и мы получили результаты, представленные в таблице 2.

Как и ожидалось ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
Teflon beakers	Savillex	200-015-12
In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon