Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Резюме

Способность воспаленной эндотелия на работу лейкоцитов из потока регулируется мезенхимальных стромальных клеток. Мы описываем две модели в пробирке, включающие первичные человеческие клетки, которые могут быть использованы для оценки набора нейтрофилов из потока и изучить роль, которую мезенхимальных стромальных клеток играть в регулировании этого процесса.

Аннотация

Стромальных клеток регулировать набор циркулирующих лейкоцитов при воспалении через кросс-разговоры с соседними эндотелиальных клеток. Здесь мы опишем два в пробирке моделей "сосудистых" для изучения набора циркулирующих нейтрофилов из потока воспаленной эндотелиальных клеток. Основным преимуществом этих моделей является возможность анализировать каждый шаг в каскаде адгезии лейкоцитов в порядке, как имело бы место в естественных условиях. Мы также описать, как обе модели могут быть адаптированы для изучения роли стромальных клеток, в данном случае мезенхимальных стволовых клеток (МСК), в регулировании набора лейкоцитов.

Первичные эндотелиальные клетки культивировали отдельно или вместе с человеческой MSC в непосредственном контакте на Ibidi microslides или на противоположных сторонах фильтра Transwell в течение 24 ч. Культуры стимулировали фактора некроза опухолей альфа (ФНО) в течение 4 ч и включены в поток на основе анализа адгезии. Болюс нейтрофилов перфузиина эндотелии в течение 4 мин. Захват течет нейтрофилов и их взаимодействия с эндотелия визуализировали фазово-контрастной микроскопии.

В обеих моделях, цитокин-стимуляция увеличилось эндотелия набор протекающих нейтрофилов в зависимости от дозы. Анализ поведения завербованных нейтрофилов показал дозозависимое снижение в прокатных и дозозависимое увеличение в переселении через эндотелий. В совместной культуре, MSC подавляется адгезию нейтрофилов к ФНО-стимулированной эндотелия.

Наши модели, основанные спаек потока имитировать начальные фазы набора лейкоцитов из обращения. В дополнение к лейкоцитов, они могут быть использованы для изучения набора других типов клеток, таких как административные терапевтически MSC или циркулирующих опухолевых клеток. Наши многослойные модели Сотрудничество культуры показали, что MSC общаться с эндотелием, чтобы изменить свой ответ на про-воспалительных цитокинов, Alteriнг вербовку нейтрофилов. Дальнейшие исследования с использованием таких моделей требуется, чтобы полностью понять, как стромальных клеток из различных тканей и условий (воспалительных заболеваний или рака) влиять на вербовку лейкоцитов при воспалении.

Введение

Воспаление является защитной реакцией на микробной инфекции или повреждения ткани, что требует ужесточения регулирования въезда лейкоцитов в и выход из воспаленной ткани, чтобы разрешение ^1,2. Перекрестные помехи между эндотелиальных клеток (ЭК), которые выравнивают кровеносные сосуды, циркулирующих лейкоцитов и тканевых резидентом стромальных клеток имеет важное значение для координации этого процесса ^3. Однако, неконтролируемый набор лейкоцитов и их неэффективными оформление лежат в основе развития хронических воспалительных заболеваний ^4. Наша нынешняя понимание набора лейкоцитов в норме и патологии является неполным и более надежные модели необходимы для анализа этого процесса.

Механизмы, поддерживающие набор лейкоцитов из крови через сосудистую ЕС в пост венул были хорошо описаны ^1,2,5. Циркулирующие лейкоциты захватываются специализированных рецепторов (например, VCAM-1, Е-селектина, Р-селектина), которыйповышается, на воспаленную эндотелия. Эти переходные взаимодействия позволяют лейкоциты взаимодействовать с поверхностными связаны хемокинов и липидов, полученных посредников (как эндотелиальных или стромальных происхождения), которые активируют интегрины, выраженные лейкоцитов ^{6- 11.} Это, в свою очередь, стабилизирует адгезию и диски миграции через эндотелий и в ткани ^12-15. В ткани, набранных лейкоциты подвергаются агентов стромальных происхождения, которые влияют на их подвижность, функции и выживания ^16,17. Появляется все больше свидетельств наводит на мысль, что сигналы, полученные на каждом этапе в условиях процесса набора лейкоцитов для следующей. Тем не менее, наше понимание набора лейкоцитов остается неполным и очень мало известно о компонентах формования движения лейкоцитов в ткани.

В Бирмингеме мы разработали несколько в пробирке моделей "сосудистых", чтобы изучить набор лейкоцитов оттечь ^9,18,19. Теперь мы понимаем, что сосудистые акт ЕС как непосредственные регуляторы набора лейкоцитов реагировать на изменения в их микроокружения. В частности, ткань резидентом стромальные клетки могут активно регулировать воспалительный ответ, в части, беседуя с соседней сосудистой ЕС повлиять на их роль в вербовке ^3. Ранее мы показали, что различные стромальные клетки модулировать способность ЕС для поддержки адгезию и миграцию лейкоцитов в ткани-специфическим образом, и что эти эффекты становятся изменены хронических заболеваний ^13,16,20,21. Таким образом, клетки стромы установить тканей "Адрес-коды", которые определяют контекст каждого воспалительной реакции ^22. Совсем недавно мы показали, что костный мозг происходит MSC (BMMSC) мощно вниз регулировать реакцию ЕС на цитокины, что приводит к снижению в наборе обоих нейтрофилов и лимфоцитов ^23.

Механизмы гос, регламентирующими набор освещены в пробирке в основном используется анализов, включающих один тип клеток (например, ЕС) или белок в изоляции. Тем не менее, эти исследования не принимать во внимание последствия локального окружения ткани (то есть, наличие стромальных клеток) о вербовке лейкоцитов и их последующая миграция в ткани. Здесь мы опишем два метода на основе потока, в котором клетки стромы, в частности, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), являются совместном культивировании с ЕС ^23. Такие модели позволяют исследовать влияние стромы ячейки на эндотелиальные ответов, в частности, их способности поддерживать набор лейкоцитов из потока.

протокол

1. Выделение и культуры первичных человеческих эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток

1. Выделение и культивирование человека эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVEC):
   1. Положите пуповину на подносе с бумажными полотенцами и спрей с 70% этанола. Место в капот культуры ткани. Определить вену и иглу на обоих концах. Поместите хомут вокруг канюлированного конце, чтобы закрепить его.
   2. Промойте венозную кровь с PBS с помощью шприца. Заполните шприц с воздухом и пройти через вены удалить и уничтожить остаточную PBS.
   3. Оттепели 10 мг / мл коллагеназы типа Ia и разбавленным 1:10 в PBS (с кальция и хлорида магния) до конечной концентрации 1 мг / мл. Pass раствором коллагеназы в вену, пока обе канюли не будут заполнены. Закрыть зажимы на канюли на обоих концах.
   4. Накройте лоток с тканью и распылите с 70% этанола. Поместите шнур в инкубаторе в течение 20 мин при 37 ° С и 5% СО _2.
   5. Возьмите шнур изинкубатора и затяните хомуты. Массаж шнур аккуратно в течение 1 мин. Промыть клеточной суспензии с 10 мл PBS и собирают в 50 мл центрифужную пробирку.
   6. Заполните шприц с воздухом и пройти через вену, чтобы удалить остатки PBS в два раза, собирая PBS в 50 мл центрифужную пробирку, используемого на стадии 1.1.5. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   7. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл полной среды EC. Средней ЕС состоит из M199 с добавкой 35 мкг / мл гентамицина сульфата, 10 нг / мл человеческого эпидермального фактора роста, 1 мкг / мл гидрокортизона, 2,5 мкг / мл амфотерицина В, и 20% фетальной телячьей сыворотки.
   8. Добавить 4 мл среды EC и подвески ЕС в 25 см ² колбу. Изменение среды на следующий день, а затем каждые 2 дня.
   9. EC проявляют булыжника, как морфология (рис 1ai). Для приклеивания анализов, ЕС, как правило, высевают, когда они достигают 100% слияния (см раздел 1.4 ).
2. Выделение желе мезенхимальных стволовых клеток Уортона (WJMSC) из пуповины человека:
   1. Изолировать желе, полученных MSC Уортон (WJMSC) из свежих пуповины или шнуров, которые уже были использованы, чтобы изолировать ЕС. Вырезать пуповину в 5 см длиной штук. Разрежьте каждый кусок в продольном направлении, чтобы выявить кровеносные сосуды (2 артерии [белый, жесткий] и 1 вену [желтый, растянутый]).
   2. Использование стерильных ножниц и щипцов удалить кровеносные сосуды и выбросить. Вырезать все ткани в 2 - 3 мм ³ шт. Использование щипцов 2 место - 3 мм ³ шт в 50 мл центрифужную пробирку.
   3. Оттепель 100 мг / мл сток коллагеназы типа II и разбавленной 1: 100 в 10 мл PBS до конечной концентрации 1 мг / мл. Оттепель 20000 U / мл стоковый гиалуронидазу и разбавленной 1: 400 до конечной концентрации 50 ед / мл в растворе коллагеназы.
   4. Добавить ферментативной коктейль в центрифужную пробирку, содержащую фрагменты ткани. Инкубируйте ткани ФрагменаTS в течение 5 ч при 37 ° С на медленном ротатора.
   5. Развести клеточной суспензии 1: 5 в ФБР. Поместите мкм пор фильтра 100 в новый 50 мл центрифужную пробирку. Налейте клеточной суспензии на пор фильтра 100 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшееся фрагментов ткани будут сохранены на фильтре и клетки будут собраны в 50 мл центрифужную пробирку.
   6. Отменить фильтр. Центрифуга клеточной суспензии при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок WJMSC в 12 мл полной культуральной среды WJMSC (DMEM низкий уровень глюкозы, 10% FCS и 100 ед / мл пенициллина + 100 мкг / мл стрептомицина Mix).
   7. Семенной все клетки в 75 см ² тканевой культуральной колбы. Смена носителя после 24 ч с 12 мл в комплекте WJMSC культуральной среде. Замените среду каждые 2 - 3 дня. Клетки должны достичь 70 - 80% слияния в течение 2 недель. Прохождение когда WJMSC до 70 - 80% слияния (см раздел 1.4).
3. Расширение мозга, полученных MSC кости (BMMSC):
   1. Изолировать человека из костного мозга MSC (BMMSC), как описано ранее ^24. Добавить 10 мл предварительно нагретой среды роста MSC (MSCGM) в 15 мл центрифужную пробирку.
   2. Оттепель флакон p2 BMMSC путем размещения на водяной бане 37 ° С в течение 2 мин. Добавить подвеску BMMSC в центрифужную пробирку, содержащую MSCGM. Все хорошо перемешать с помощью пипетки.
   3. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Отберите надосадочной жидкости полностью.
   4. Ресуспендируют клеток в 1 мл MSCGM и подсчет клеток с использованием гемоцитометра или цифровой счетчик клеток, таких как cellometer.
   5. Семенной клеток в 75 см ² колбы для культивирования при плотности 5000 - 6000 клеток на см ² в 12 мл MSCGM. Смена носителя после 24 ч с 12 мл MSCGM. Кормовые клетки с 12 мл MSCGM каждые 2 - 3 дней.
   6. Прохождение когда BMMSC до 70 - 80% слияния (см раздел 1.4). Клетки обладают фибробластов морфологию (рис 1Aii).
4. Отряд ЕС и MSC:
   1. Отберите среду из 25 см ² колбах культуры. Добавить 2 мл 0,02% ЭДТА в течение примерно 2 мин. Аспирируйте ЭДТА и добавить 2 мл трипсина (2,5 мг / мл). Посмотреть под микроскопом, пока клетки не становятся круглыми.
   2. Нажмите на колбу для отделения клеток. Инактивации трипсина путем добавления 8 мл культуральной среды (в зависимости от типа клеток; средний EC для ЭКПВЧ, DMEM LG Для WJMSC и MSCGM для BMMSC) в колбу культуры и переноса суспензии в 15 мл центрифужную пробирку.
   3. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок, как описано ниже.
      1. Для пассирования MSC, ресуспендируют осадок в 3 мл культуральной среды. Добавить 11 мл культуральной среды в трех отдельных 75 см ² колбах культуры. Добавить 1 мл суспензии клеток в каждую колбу культуры (1: 3) разделенного. Прохождение WJMSC и BMMSC 3 раз (P3) перед использованием в совместной культуре анализов.
      2. Для посева ЕС или магистра в области адгезии анализов - см Разделы 2 и 3.
   4. Замораживание MSC:
      1. При прохождении 3 отсоединения MSC, как описано в разделе 1.4. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 3 мл охлажденной льдом CryoSFM. Пипетка 1 мл аликвоты клеточной суспензии в 1,5 мл охлажденного льдом криопробирки. Поместить криопробирки в контейнере замерзания.
      2. Хранить контейнер при температуре -80 ° CO / N. Переход к жидким азотом. Оттепель флакон MSC (выполните шаги 1.3.1 - 1.3.6). Ресуспендируйте MSC в 5 мл культуральной среды (выберите соответствующую среду для WJMSC или BMMSC) и семя в 25 см ² колбу.

   2. Создание эндотелия мезенхимальные стволовых клеток сокультурах на Ibidi Microslides

   1. Trypsinize Конфлюэнтную 25 см ² колбу ЕС (~ 1,5 х 10 ⁶ клеток; в качестве раздела 1.4). Ресуспендируйте EC в 380 мкл MSCGM (1 х 25 см ² колбу будет сеять два 6-канальных Ibidi microslides (~ 1,25 х 10 ⁵ / канал), для приклеивания анализов все ячейки тиPES культивируют в MSCGM). Добавить 30 мкл суспензии ЕС к каждому каналу (это покроет площадь роста за счет капиллярного действия). Выдержите Ibidi microslide при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 1 часа.
   2. Добавить 140 мкл MSCGM для каждого канала, а затем аспирации его. Повторите два раза в общей сложности 3 стирок. Добавить 140 мкл MSCGM и место в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 24 часов.
   3. Для сокультурах снять MSC (раздел 1.4). Выполните подсчет клеток с помощью гемоцитометра или cellometer. Отрегулируйте концентрацию MSC 1,5 х 10 ⁵ клеток / мл.
   4. Аспирируйте избыток среды из каналов Ibidi (оставив только области роста канала в среде). Добавить 30 мкл суспензии MSC к каналам Ibidi. Аспирируйте среду, что был извлечен из зоны роста канала и добавить еще 30 мкл суспензии MSC. Повторите еще ​​раз, а затем поместить microslide Ibidi в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO _{2 <}/ SUB> в течение 1 часа.
   5. Добавить 140 мкл MSCGM для каждого канала, а затем аспирации его. Повторите два раза в общей сложности 3 стирок. Добавить конечного объема 140 мкл MSCGM к каждому каналу и место в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 24 ч.
   6. Оттепель 1 х 10 ⁵ ед / мл TNF-alpha запаса и разбавленной 1: 1000 в MSCGM до конечной концентрации 100 ед / мл (эквивалент ~ 10 нг / мл). Выполнение последовательного разбавления путем разбавления 100 ед / мл TNF & alpha; в 1:10 в MSCGM, чтобы получить 10 ед / мл. Развести 10 U / мл TNF & alpha; в 1:10 в MSCGM, чтобы получить 1 Ед / мл.
   7. Treat каналов с ФНО при 37 ° С в течение 4 ч перед анализом. Температурные колебания во время лечения цитокинов изменит моделей набора нейтрофилов наблюдали. Добавить свежие MSCGM с необработанными каналами.

   3. Создание эндотелия мезенхимальных стволовых клеток сокультурах на фильтрах

   1. Снять WJ или BMMSC, как описано в разделе 1.4. Ресуспендируют гранулв 1 мл MSCGM. Выполните подсчет клеток клеток с использованием гемоцитометра или cellometer.
   2. Отрегулируйте уровень громкости, чтобы конечная концентрация 5 × 10 ⁵ MSC в 500 мкл MSCGM.
   3. Использование стерильного пинцета инвертировать 6-а, 0,4 мкм ПЭТ Transwell фильтры и место в стерильном боксе.
   4. Семена 5 × 10 ⁵ MSC на наружной поверхности фильтров. Выдержите фильтры при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 1 часа.
   5. Сбор носитель из наружной поверхности фильтра. Подсчитайте количество неадгезированных MSC в средствах массовой информации. Re инвертировать фильтры с использованием стерильного пинцета и место в совпадающим 6-луночного планшета, содержащего 3 мл MSCGM.
   6. Добавить 2 мл MSCGM на внутренней поверхности фильтра (Фиг.1В). Место в инкубаторе при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 24 часов. Trypsinize Конфлюэнтную 25 см ² колбу ЕС (рис 1ai; в качестве раздела 1.4).
   7. Ресуспендируют ЭК в 8 мл MSCGM (1 х 25 см ² колбу WiLL семян четыре фильтра 6-а; ~ 5 х 10 ⁵ EC / фильтр). Аспирируйте среды из верхней и нижней пористых фильтров. Добавить 3 мл свежего MSCGM в нижнюю камеру (под фильтром). Добавить 2 мл EC суспензии к внутренней поверхности каждого фильтра. Инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С и 5% СО _2.
   8. Отберите среднего смыть неадгезированных ЕС и заменить свежим MSCGM. Установка параллельных EC моно-культуры фильтры путем посева клеток на внутренней поверхности без первого посева MSC. Инкубируйте O / N при 37 ° С и 5% СО _2.
   9. Убедитесь, что монослой ЭК сливной и не содержит пробелов. Суб-сливные монослои не может быть использована для адгезии анализов (фиг.1В).
   10. Лечить верхние и нижние палаты фильтров с 1, 10 или 100 ЕД / мл ФНО (эквивалент ~ 10 нг / мл) при 37 ° С в течение 4 ч до анализа (описанного в разделе 2).

   4. Выделение лейкоцитов

   1. Возьмите венознойКровь от здоровых добровольцев и аликвоты сразу в ЭДТА пробирки. Обратить трубки осторожно перемешать.
   2. Слой 2,5 мл Histopaque 1077 на 2,5 мл Histopaque 1119 в 10 мл с круглым дном трубки. Уровень 5 мл цельной крови на градиенте Histopaque. Центрифуга при 800 х г в течение 40 мин при комнатной температуре.
   3. Урожай периферийные полиморфноядерных нейтрофилов (ПМН) на границе раздела Histopaque 1077 и 1119 (выше эритроцитов слоя). Место в 10 мл с круглым дном трубки и составляют до 10 мл PBSA. Осторожно инвертировать трубку и центрифуге при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   4. Развести 7,5% раствор BSA 1:50 в 100 мл PBS (с кальция и хлорида магния) до конечной концентрации 0,15% (вес / объем; PBSA). Отберите супернатант и ресуспендируют в 10 мл PBSA. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   5. Ресуспендируют в 1 мл PBSA. Возьмем 20 мкл аликвоты клеточной суспензии и добавить к 380 мкл PBSA (1:20 разведение). Граф клеток с использованием гемоцитометра или cellometer. Разбавить до требуемой Concentration (1 х 10 ⁶ / мл для Transwell фильтров и Ibidi microslide) в PBSA. не Поддержание суспензии нейтрофилов при комнатной температуре до анализа.

   5. Сборка Проточная система

   1. Настройте систему потока, как показано на рисунке 1С. Включите нагреватель и установлен на 37 ° C. Прикрепите 20 мл шприц (удалить поршень) и 5 ​​мл шприц с 3-ходовым краном. Прикрепите кран с камерой оргстекла с использованием микропоры ленты.
   2. Отмерьте и отрежьте длинный кусок кремния 2/4 мм (толщина) трубки, составляет примерно расстояние между клапаном и 3-х ходового крана. Вырезать 8 - 10 мм длинный кусок 1/3 мм (тонкий) трубы и вставки в один конец трубы с толщиной. Прикрепите толстой боковой трубки на 3-полосная крана.
   3. Подключите тонкий конец трубки на порту электронной 3-полосная microvalve. Это "Бачок омывателей". Вырезать 6 A - 8 мм длинный кусок толстой и тонкой трубки.
   4. Вставьте тонкую трубку в один конец толстой трубы. AttАХ толщиной трубы заканчиваются на 2 мл шприц (удалить поршень).
   5. Подключите тонкий конец трубки шприца 2 мл на порту электронной microvalve сделать "образец резервуар». Подключите клапан в камеру потока фильтра путем измерения и резки длинный кусок тонкой трубки, которая Расстояние между microvalve и в центре столик микроскопа.
   6. Для модели microslide, приложите 8 - 10 мм кусок толстой трубки к концу тонкой трубки. Разместить Г-образный соединитель до конца толстой трубы. Это будет подключаться к microslide. Для модели фильтра, прикрепить 8 - 10 мм кусок Portex Голубой линии Манометр соединительный трубопровод к концу тонкой трубки.
   7. Поместите тонкий конец трубки на microvalve. Это общий выход для стирки и образцов водоемов. Заполните резервуары с PBSA. Премьер-трубки при протекании PBSA через них, чтобы удалить пузырьки воздуха.
   8. Прикрепите Манометр труб в 29 мм (50 мл) стекла сyringe. Председатель шприц, заполнив 10 мл PBSA. Invert шприц так, чтобы конец соединен с трубкой обращена вверх и вытолкнуть все воздушные пузыри. Залейте 5 мл PBSA.
   9. Только для модели microslide, прикрепить 10 - 12 мм кусок толстой трубки к концу трубки манометра, ведущей к стеклянной шприца. Разместить Г-образный соединитель на конце толстой трубы. Поместите стеклянный шприц в шприцевой насос для инфузий / вывода.
   10. Рассчитайте коэффициент пополнения потока (Q), необходимые для создания напряжения сдвига желательно стены (τ _W в Паскале, ПА) 0,1 Па (Transwell фильтров) или 0,05 Па (Ibidi microslides) с использованием следующих формул:
       γ = _ш (6.Q) / (WH ²⁾
       τ = n.γ
       Там, где W = внутренняя ширина и Н = внутренняя глубина канала потока. N = вязкость протекающего раствора; PBSA п = 0,7 мПа Для проточную камеру плоскопараллельной пластины фильтра, ширина (W) составляет 4 мм, а глубина (Н) 0,133 мм. Depth камеры могут незначительно отличаться из-за различий в толщине прокладки Parafilm используется. Для microslide Ibidi, ширина 3,8 мм, а глубина 0,4 мм.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за разницы в размерах проточного канала и динамики захвата мы используем различные напряжения сдвига для модели microslide по сравнению с фильтром модели ^6.

   6. Настройка параллельных пластин проточной камеры, включающих фильтры

   1. Отрежьте кусок парафильмом (те же размеры, как покровного стекла), используя шаблон металла. Вырежьте 20 х 4 мм разъем в парафильмом (чтобы создать канал для потока), используя шаблон металла. Используйте прокладку, чтобы отметить канал потока на покровного стекла.
   2. Выровняйте края фильтра 6-а на покровного стекла. Убедитесь, что фильтр покрывает маркировки канала для потока. Аккуратно вырежьте из фильтр с помощью типа 10A скальпель.
   3. Тщательно покрыть фильтр с прокладкой Parafilm, гарантируя, что канал потокаГнездо в середине фильтра (фиг 1D). Используйте кусок чистой ткани и вытолкнуть пузырьков.
   4. Поместите покровное в выемке на нижней пластине проточную камеру Perspex. Наложите верхнюю плексигласовую пластину поверх прокладки и винт пластины вместе (рис 1D).
   5. Поверните 3-позиционный кран, чтобы дать моющего буфера (PBSA) течь через клапан. Подключение манометра трубку к впускному отверстию в верхней Persex пластины. Запуск PBSA через проточный канал, чтобы пузырьки, чтобы пройти.
   6. Подключение трубки манометра из шприца в выпускному отверстию Perspex пластины. Установите шприцевой насос, чтобы пополнить и тираж. Очистить любую PBSA который капает на верхней пластине камеры.
   7. Поместите камеру на сцене перевернутого фазово-контрастной микроскопии. Настройте фокус визуализировать выше фильтров ЕС (рисунок 1b).

   7. Установка Microslides для подачи

   1. Поместите microslide на сцену контрастного микроскопа инвертировать фазы. Подключите Г-образный разъем в порт канала. Запуск PBSA через проточный канал.
   2. Поместите Г-образный соединитель из шприца в выходной порт канала. Установите шприцевой насос, чтобы пополнить и тираж. Очистите PBSA что капала на microslide. Настройте фокус для визуализации монослоя ЕС.

   8. перфузии Лейкоциты За эндотелиальных клеток

   1. Поместите 2 мл очищенных нейтрофилов в резервуар образца и оставить нагреваться в течение 2 мин. Вымойте эндотелий с PBSA в течение 2 мин.
   2. Поверните клапан на заливать нейтрофилов более эндотелия. Доставка нейтрофилов болюс 4 мин. Поверните клапан OFF и заливать PBSA из промывных резервуара для остальной части эксперимента.
   3. Убедитесь, что воздушные пузырьки не проходят через канал потока в любой точке во время теста, так как это нарушит monolay ЕСэ и причиной отряд прикрепленных нейтрофилов.

   9. Запись нейтрофилов Capture и поведение

   1. Запись набора нейтрофилов либо во время нейтрофилов потока или после перфузии.
   2. Сделать все цифровые записи, по крайней мере 5 - 10 полей в центре канала потока. Определение центра канала, перемещая цели к краю канала на входной порт и идентификации середину порта.
      1. Для записи во время нейтрофилов потока, получать изображения в одном поле каждые 10 секунд в течение 1 мин. Двигайтесь вдоль канала и записать еще одно поле в течение 1 мин. Повторите эти действия для продолжительности болюса.
      2. Для записи пост-перфузии, чтобы 10 сек запись 5 - 10 полей по центру канала потока для оценки поведения лейкоцитов (обычно 2 мин после того, как в конце нейтрофилов болюса). Возьмите изображений каждую секунду в течение интервала 10 сек. Это позволяет достаточно времени для захвата с потока и поведения приверженцем НейтроPhils быть проанализированы.
      3. Запись одно поле, содержащее, по меньшей мере 10 Переселенные нейтрофилов в течение 5 мин, с изображений каждые 30 сек. Это может быть использовано, чтобы вычислить скорость мигрировавших клеток (либо выше или под эндотелием).
      4. Запишите еще одну серию 10 сек полей (обычно 9 мин после перфузии). Это позволяет нейтрофилы время мигрируют через монослой эндотелиальных.
      5. Остановите шприцевой насос и снимите трубку. Разберите проточную камеру и промойте резервуар образца и труб. Повторите эти действия для последующих фильтров / microslide каналов.

   10. Анализ лейкоцитов вербовки и поведения

   1. Подсчитайте количество нейтрофилов в каждой области в течение 10 сек записи в момент времени 2 мин. Все клетки должны присутствовать в первой второй области для того, чтобы рассчитывать. Клетки, которые частично в области от 2 сторон (например, верхняя / правая границы) поля зрения, включены вГрафы, до тех пор, пока они остаются в области в течение всего 10 секунд.
   2. Рассчитайте среднее число примыкающих нейтрофилов в поле зрения. Измерить длину и ширину записанной области. Вычислить площадь области. Подсчитайте, сколько полей есть в 1 мм ^2. Умножьте среднее количество нейтрофилов по количеству полей в 1 мм ^2.
   3. Рассчитать общее количество нейтрофилов перфузии путем умножения количества нейтрофилов перфузии (например, 2 × 10 ⁶ / мл * В [например, 0,0999 мл / мин для проточной камеры с параллельными пластинами]) по продолжительности болюса (например, 4 мин ).
   4. Разделить нейтрофилов / мм ^2, на общее число нейтрофилов перфузии, чтобы определить общее количество клеток, которые придерживались (адгезивных клеток / мм ^{2/10 6} перфузии).
   5. Оценка того, насколько прилипшие нейтрофилы прокат, твердо сторонником или переселены (Дополнительный Видео 1 и 2).
      1. прокатки нейтрофилов фазе яркий и будет медленно двигаться вдоль эндотелия монослоя (1 - 10 мкм / сек; Дополнительный видео 1).
      2. Плотно прилипшие клетки этап яркий и связанной с поверхностью ЕС, либо остается неподвижным (т.е., не двигаясь во время записи) или произошли серьезные изменения формы и миграции по поверхности EC (рис 1ei).
      3. Переселилась нейтрофилов фаза темно и ниже слоя EC (рис 1Eii).
   6. Рассчитать процент адгезивных клеток, которые катятся, стационарные и переселилась. Кроме того, нейтрофилов поведение может быть выражено как общего количества клеток, которые обладают в разных режимах с применением ту же формулу, используемую для расчета общего адгезии (как описано в шагах 10,6 - 10,7).
      1. Отметить передний край подвижного нейтрофилов. Отметьте передний край и той же клетке в конце последовательности 10 сек. Нарисуйте линию ставкуWEEN 2 очка и измерить расстояние, которое клеток пройденное.
      2. Разделить это значение длительности записи, в ​​котором клетка прокатки (т.е. 10 сек). Попробуйте и выберите нейтрофилы, которые находятся в области в течение всего интервала 10 сек.
   7. Для расчета скорости нейтрофилов, мигрирующих по поверхности (в форме измененная фаза ярко) или под эндотелия (фаза темноте) использовать 5 мин записи (дополнительные видео 2).
      1. Draw наброски мигрировавших клеток в начале последовательности, и отслеживать их перемещения по всей последовательности. Обратите внимание на Х и Y позиции центра тяжести в каждом интервале 1 мин для каждой ячейки. Вычтите значения X и Y позиции с первого изображения последовательности из значений во втором изображении. Это основано на теореме Пифагора.
      2. Вычтите значения из второго изображения с третьего изображения. Сделайте это для всех изображений в последовательности. Площадь тон X и Y. и добавить их вместе.
      3. Квадратный корень результирующее значение. Вычислить скорость для каждой ячейки путем усреднения скорости, рассчитанные на каждом минутном интервале. Track 10 мигрировали нейтрофилов и рассчитать среднюю скорость.

Результаты

Первоначально, мы проанализировали влияние стимулировать ЕС с TNF, о вербовке нейтрофилов из потока с использованием модели microslide Ibidi (раздел 7 - 9). При отсутствии ФНО, мало, если какие-либо нейтрофилы прикреплен к эндотелиальной монослоя (фиг.2А). Этого следовало ожидать,...

Обсуждение

Здесь мы опишем два в пробирке моделей "сосудистых" для изучения набора циркулирующих нейтрофилов воспаленной эндотелия. Основным преимуществом этих моделей является возможность анализировать каждый шаг в каскаде адгезии лейкоцитов в порядке, как имело бы место в естест?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
25 cc tissue culture flask	SLS	353109
75 cc tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
6-well, 0.4 µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
10 ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4 °C.
20 ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5 ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2 ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50 ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.