Модифицированный Совет Hole - Измерение поведения, познания и социального взаимодействия у мышей и крыс

Резюме

This protocol describes the modified hole board, which is a behavioral test set-up that comprises the characteristics of an open field and a traditional hole board. This set-up enables the differential analysis of unconditioned behavior of small laboratory mammals as well as the analysis of cognitive abilities.

Аннотация

Этот протокол описывает измененный отверстие доска (МНВ), которая сочетает в себе черты от традиционных борту отверстия и в открытом грунте, и предназначена для измерения нескольких размеров безусловного поведения в мелких лабораторных млекопитающих (например, мышей, крыс, тупайи и малых приматов). Эта парадигма является ценной альтернативой для использования поведенческого испытуемой батареи, так как широкий спектр поведенческих поведенческой профиль животного могут быть исследованы в одном испытании.

Аппарат состоит из коробки, представляющий «защищенных» участок, отделенный от группы отсека. Доска, на которой небольшие цилиндры расположены в шахматном порядке в три ряда, находится в центре рамки, представляющий «незащищенный» площадь установки. Когнитивные способности животных может быть измерена травли несколько цилиндров на доске и измерения памятью, работающей и ссылки. Другое безусловное поведение, такое как Activitу-со связанными, тревожно-со связанными и социальное поведение, можно наблюдать с помощью этой парадигмы. Поведенческие гибкость и способность приучить к новому среды может быть дополнительно наблюдали, подвергая животных на несколько испытаний в МНВ, открывая представление адаптационных возможностей животных.

Из-за тестирования эффектов порядка в поведенческой тест батареи, наивные животные должны быть использованы для каждого отдельного эксперимента. Путем испытывать различные поведенческие размеры в одном парадигмы и, таким образом обходя эту проблему, число подопытных животных, используемых уменьшается. Кроме того, избегая социальной изоляции во время испытаний и без необходимости на питание животных лишают, МНВ представляет собой поведенческий тест-системы, вызывая если таковая имеется, очень низкое количество стресса.

Введение

Модифицированный отверстие доска (МНВ) используется для оценки многих аспектов безусловного поведения, в основном у мышей и крыс ^1. Количество широко используемых тестов измерения одного поведенческого параметр, который не полностью покрывают весь фенотип поведенческого измерения. МНВ была разработана на основе концепции, что грызуны могут показать свой ​​богатый поведения репертуар только в богатой среде тестирования ² и, таким образом, позволяет для сложных этологии наблюдений.

Настройка включает в себя характеристики традиционной борту отверстия и тесте открытого поля, в результате чего в едином комплексе парадигмы, которая преодолевает недостатки тестовой батареи (то есть, в сокращении числа животных, используемых ^1,3,4, в обход Возможные последствия испытаний порядка ^5, и сократить сроки эффект и затраты ^6). В отличие от большинства поведенческих тестов (например, Hånell и Marklund, 2014) ^{7 <}/ SUP>, преимуществом является то, что МНВ животные не должны быть лишены пищи, чтобы увеличить мотивацию для решения этой задачи. Кроме того, социальная изоляция может быть обойдена в процессе тестирования путем размещения группу товарищей экспериментального животного в (группового) отсек отделен от тестового купе прозрачной перфорированной перегородкой, что позволяет для визуального, слухового и обонятельного контакта ^8,9.

МНВ была (фармакологически) утверждены для мышей и крыс ^1,6. Широкий ассортимент поведения может быть измерена, например, избегающего поведения, оценки риска, возбуждение, разведки, двигательной активности, привыкания, социальной близости и познания ^2,8-10. Кроме того, МНВ могут быть объединены с испытанием на ингибирование приема пищи, а также теста распознавания объекта новым ^10,11. Наконец, МНВ также может быть использован для проведения экспериментов социального стресса, проверяя социально побежденных животных при размещении доминирующая особь вГруппа отсек ^12,13. Этот протокол для мышей и крыс даст обзор нескольких применений МНВ.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: эксперименты были одобрены экспериментах на животных комитета University Medical Center Утрехта и Утрехтского университета, Нидерланды мимо. Кроме того, эксперименты на животных следует принципам ухода за лабораторными животных и обратитесь к Руководству по уходу и использованию млекопитающих в неврологии и поведенческих исследований. ²⁵

1. Экспериментальная установка

Примечание: стандартное устройство МНВ состоит из серого ПВХ экспериментальной коробке (100 х 50 х 50 см), отделенной от дополнительного отсека (50 х 50 х 50 см), в котором можно разместить групповые помощники экспериментального животного в течение периода испытаний прозрачной перфорированной перегородкой ^1. Если присутствие товарищей по группе является нежелательным или, если по отдельности размещены животные испытывают заменить прозрачной перегородкой перегородкой из ПВХ серого (рис 1; см. Также Ohl и др (2001) ^1). МНВ (Wiй различные измерения), используемые для тестирования когнитивных описано в разделе 5 протокола.

1. Поместите доску (60 х 20 х 0,5 см; из серого ПВХ) в середине коробки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плата может содержать 20 цилиндров (ᴓ 1,5 см) ¹⁴ шахматном порядке в два ряда или 23 цилиндров (ᴓ 3 см) ⁸ в шахматном порядке в три ряда.
2. Разделить зоны вокруг борту, черными линиями на 10 прямоугольников (20 х 15 см) и 2 квадратов (20 х 20 см).
3. Установите сценический свет над доской, чтобы создать больший контраст интенсивности света между платой (представляющий незащищенную область, сравнимую с центром открытом поле или светлую камеру тест свет-темнота с переходной экономикой) и коробку (охраняемых территорий) В целях повышения отвращение характер платы ^4,8.
4. Дом животные под 12 ч вспять дня и ночи (например, погаснет в 7:00 утра и включение света в 7:00 вечера).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тем не менее, МНВ также можетеиспользовать при обычной графику света (см обсуждения потенциальных недостатков) ^1,6.
5. Выполните тестирования поведения в наиболее активной фазы животных (например, между 10:00 утра и 2:00 вечера) ^4,15.
6. Поддержание периода привыкания 2 недели после прибытия животных на объектах. В течение этого периода имеют тот же человек выполняет поведенческая эксперимент обрабатывать животным четыре раза в неделю и включают в себя все процедуры обработки должны быть выполнены во время фактического тестирования. Обращайтесь животных исключительно во время дня, когда животные будут подвергаться тестированию позже.
7. Запишите эксперименты для хранения данных на видео и в целях оптимизации результатов и снижения изменчивости среди наблюдателей, практика поведения забил с помощью видеозаписи предыдущих экспериментах ^2. Убедитесь в том, чтобы стандартизировать все действия и процедуры, выполняемые наблюдателя.

2. Бехаvioral Тестирование - без присутствия одногруппники

1. Выполните тестирования поведения в зале животные регулярно размещались в (во избежание возможных последствий транспортировки в место тестирования) и установить все оборудование для тестирования до прибытия животных на объектах (приучить животных к наличию оборудования).
2. Подобрать животное со стороны основания хвоста от его собственную клетку и непосредственно поместить его в МНВ.
3. Поместите каждое животное в аппарате в том же углу, лицом к стене (как показано на рисунке 1).
4. Позволить животному свободно исследовать МНВ в течение времени (часто 5 мин ^1,6,16-18).
5. Есть опытный наблюдатель on-line поведенческие параметры, используя поведенческие программное обеспечение забил. Используйте параметры, приведенные в таблице 1.
   Примечание: Некоторые поведенческие параметры (например, мотор-и исследовательское поведение) может быть засчитан автоматически, например, как, Обсуждаться Генри и др (2010) ^19. После необходимой корректировки в МНВ.
6. Для очистки устройства водопроводной водой и бумажным полотенцем после каждого испытания для того, чтобы избежать смещения на основе обонятельных сигналов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Возможные последствия тестирования порядка при проверке социально размещены животные должны иметь в виду, ^17,20.

3. Поведенческий тест - в присутствии товарищей по группе

1. В случае группового содержания, измерить взаимодействие с экспериментального животного и его клетки товарищей во время тестирования.
   1. Поместите группу товарищей в группе отсеке перед тестированием подопытного животного, чтобы обеспечить привыкания (в основном 10-30 мин ^1,12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование в условиях социального стресса можно путем размещения доминирующее клетки-партнера в группе отсека при тестировании социально победил индивидуальный ^13.
   2. Поместите экспериментального животного в испытательной отсека и позволяет ему свободноLY исследовать МНВ, как описано в разделе 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможные последствия тестирования порядка при проверке социально размещены животные должны иметь в виду, ^17,20.
   3. Есть опытный наблюдатель on-line поведенческие параметры, используя поведенческие программное обеспечение забил. Используйте параметры, приведенные в таблице 1.
   4. Для очистки устройства водопроводной водой и бумажным полотенцем после каждого испытания для того, чтобы избежать смещения на основе обонятельных сигналов.

4. Роман распознавания объектов и приема пищи Ингибирование

1. Ознакомьтесь животных с объектом (например в кости или шарик пищи) в их доме клетку 2 дня до эксперимента.
2. Поместите ознакомился объект в аппарате 2 см от нового объекта (например, болт или незнакомы пищи) в углу через дорогу от начальной точки.
3. Измерить время животное принимает подойти роман и знакомый объект / еду. Используйте параметры в Таблица 1.
4. Для очистки устройства водопроводной водой и бумажным полотенцем после каждого испытания для того, чтобы избежать смещения на основе обонятельных сигналов.

5. Когнитивная тестирование

1. Поместите меньший доска (35 х 22 х 1 см) с 10 цилиндров в середине коробки (Рисунок 1) для тестирования крыс ^3,22. Уменьшите окно в размере до 50 х 50 см для тестирования мышей ^21, вставив раздел из серого ПВХ.
2. Аромат все цилиндры с ароматом животные привлекают (например, ванили) и приманки все с наградой (например, кусок миндаля, очень вкусной наградой для мышей и крыс) под сеткой, так что животные не могут удалить его.
3. Цилиндры Cue (часто три) с цветным кольцом (контрастирует с ПВХ серого) и приманки их съемном награды (например, 0,05 г цельного миндаля).
4. Ознакомьтесь животных с наградой в день в 2 дней до эксперимента вих дом клетка, предлагая его с помощью пинцета и убедившись, что животные едят его.
5. Есть опытный наблюдатель on-line поведенческие параметры, используя поведенческие программное обеспечение забил. Измерьте параметры, приведенные в таблице 2, в дополнение к поведенческим параметрам, указанным в разделе 2 (таблица 1), за исключением параметров, относящихся к объекту ингибирование признание или приема пищи.
6. Стадия 1: С каждого животного, не выполнить четыре испытания в день с постоянной между пробной интервала (например, 30-60 мин) до тех пор, постоянной времени, чтобы закончить судебное разбирательство будет достигнуто (то есть, когда все три миндаль штук были собраны).
7. Этап 2: Cue и приманки три различных цилиндров и поместите животных в настройках четыре испытания, чтобы проверить способность к обучению разворота.
8. Для очистки устройства водопроводной водой и бумажным полотенцем после каждого испытания для того, чтобы избежать смещения на основе обонятельных сигналов.

Результаты

Большое количество параметров, которые могут быть измерены в МНВ чтобы эта установка особенно подходит для измерения многочисленные поведенческие аспекты. Одним из примеров является определение поведенческой адаптации к новой среде в результате многократного воздействия на тест. . Саломонс и др (2010) изучали привыкание двух инбредных линий мышей (BALB / CJ и 129P3 / J) к МНВ при двух различных условиях освещенности (красный свет: контраст между коробкой и питание: 45 люкс против белого света: контраст между коробкой и питание: 115 лк (см также раздел протокола 1.3)) ^4. Мышей BALC / CJ показать снижается (приучая) задержки до первого въезда платы (таблица 1) в условиях красного света, как показано на рисунке 2А. Контрастно, 129P3 / J мышей не проявляют никаких признаков привыкания на судебных процессах. 2В показывает эксперимент в условиях белого света. Мышей BALB / CJ раз показывают уменьшения задержек в первой записи доску испытаний хотя, что аnimals показать медленнее шаблон привыкания сравнению с красным условий освещения. 129P3 / J мышей не только показывать снова ухудшается привыкание, но и тенденция к сенсибилизации под белым условий освещения. Кроме того, в исследовании Salomons (2012) 129P2 / OlaHsd мышах показали нарушенную поведения гибкость в ответ на новизну по сравнению с BALB / cOlaHsd мышей ^23. Разница в привыкания способности, таким образом, становится очевидным, между двух инбредных линий мышей при испытании в МНВ ^4.

Когнитивная версия МНВ может использоваться, например, для измерения когнитивных нарушений у мышей. Ван дер Kooij и др. (2010) использовали эту настройку для измерения когнитивных функций на C57BL / 6J с мягким гипоксии головного мозга-ишемии (45 мин гипоксии; HI-45), тяжелая HI (75 мин гипоксии; HI-75) и sham- контрольные мыши ^9. Возможность завершения испытания (т.е., найти наживкой отверстия в течение 5 мин) показана на рис 3А. количество краткосрочных ошибок памяти (пересмотрит в наживкой отверстия), долгосрочные ошибки памяти (визиты к не-наживкой отверстие) и ошибки упущение (Ни один визит в наживкой отверстие), показаны на рис 3B-D соответственно.

Для того, чтобы подтвердить, что HI-45 группа не имела никакого познавательного ухудшения, эта группа была протестирована против ложной управления в задаче обращения. Три наживкой отверстия были назначены три различных цилиндров и животные были протестированы на 4 испытаний. Эффект разворота становится очевидным при сравнении последнее испытание первого этапа с первого судебного процесса на стадии обращения. Продолжительность чтобы заполнить четыре испытания разворота дает указание на общую производительность. Рисунок 4 показывает задержку, чтобы завершить испытание для обеих групп и ясно общий эффект лечения очевидна. Это означает, что в задаче обращения существует на самом деле от обесценения в когнитивной гибкости (RE-обучения) в HI-45 группы, которая бы пришел обнаружить с помощью МНВ ^9.

Рисунок 1. Схема обзор модифицированной отверстия платы. () Установка состоит из тестового купе (коробка) с в середине (незащищенный) Комиссия указала, с зигзагообразными линиями и группы отсека. = Роман объект, = Знакомы объект, = Начальной точке. (В) Схематический обзор когнитивной версии модифицированного отверстие платы для мышей. (C) Вид сбоку цилиндра, используемый в когнитивной версии модифицированного отверстие борту. Часть миндаля помещается под решетку всех цилиндров.TARGET = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2. Красный свет или условия белого света. () Задержка до первого въезда платы (в среднем + SEM) из BALB / CJ и 123P3 / J мышей, измеренные в условиях красного света (окно 0-5 люкс и питание 45 люкс). А повторные измерения ANOVA с регулировкой Huyn-Фельдта показал напряжение (P = 0,025), суда (P <0,001) и пробный взаимодействие х деформации (Р <0,001) эффект ретроспективный анализ:. Между штаммами: * = P <0,0026 между два последовательных испытаний: $ = P <0,0026 (BALB / CJ) (B) задержка первого входа платы (в среднем + SEM) в условиях белого света (окно 0-5 люкс и питание 120 люкс).. А повторные измерения ANOVA с регулировкой Huyn-Фельдта показал напряжение (P = 0,031), суда (P <0,001) и пробный взаимодействие х деформации (Р <0,001) EFFE. КТ ретроспективный анализ: между штаммами: * = P <0,0026, между двумя последовательными испытаний: $ = P <0,0026 (BALB / CJ) и T = P <0,0026 (123P3 / J). Эта цифра была изменена с Саломонс и др. 2010 ^4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3. Когнитивная тестирование в МНВ (этап 1). Все данные показывают среднее + SEM. (А) задержки, чтобы завершить испытание (сек) из ложной контрольных мышей, HI-45 и HI-75. (В) Количество ошибок бездействия (C) Non-наживкой посещения отверстий и (D) пересмотрит для наживкой отверстий. * = P <0,05, ** = P <0,01, *** = P <0,001 обман против HI-75, # = P <0,05, ## = P <0,01, ### = P <0,001HI-45 против HI-75. Эта цифра была изменена с Ван дер Kooij и др. 2010 ^9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4. Восстановление учебной задачи (этап 2). Задержка, чтобы закончить судебное разбирательство (сек) в повороте учебной задачи (среднее + SEM). Пробные эффекты: # = P <0,05, ## = P <0,01 (первая пробная разворот задача по сравнению с предыдущим судебное разбирательство). Эффект лечения: * = P <0,05, ** = P <0,01 (HI-45 против обман). Эта цифра была изменена с Ван дер Kooij и др. 2010 ^9.

Система	Деятельность	Измеряемый параметр
Авоя танцую	Вход Совет	Частота, задержка (с), длительность (%) и средней продолжительности (ы) на плате
Оценка риска	Натяжные Attends	Частота и задержки (ы) с растяжением позы (в том числе задних конечностей)
Пробуждение	Уход	Частота, задержка (с), длительность (%) и средней продолжительности (ы) с собственной уход
	Дефекация	Частота и задержка (ы) пилюль производится
	Мочеиспускание	Частота и задержка (ы) мочеиспусканий
Режиссер исследование	Посещения Hole	Частота и задержка (ы) визитов цилиндров
	Разведка Роман объект	Частота, задержка (с), длительность (%) и средней продолжительности (ы) изучает новый объект
Ненаправленной исследование	Выращивание окно	Частота и задержка (ы) rearings в коробке (передние лапы не касаясь стены)
	Разведение доска	Частота и задержка (ы) rearings на борту
	Поисковой скважины	Частота и задержка (ы) цилиндров исследований
Память	Разведка Знакомый объект	Частота, задержка (с), длительность (%) и средней продолжительности (ы) изучения знакомый объект
Социальная близость	Взаимодействие Группа	Частота, задержка (с), длительность (%) и средней продолжительности (ы), взаимодействующих с группой отсеке
Двигательная активность	Линия пересечения	Частота и задержка (ы) переходов линий

Таблица 1: Список поведенческих параметров

Системная память	Параметр	Описание
Долговременная память	Неправильный выбор	Посещение без наживкой цилиндра; нос ниже края
Пропуск ошибок	Пропуск в наживкой цилиндра	Нет посещение затаив цилиндра
Кратковременная память	Повторный выбор	Пересмотреть чтобы затаив цилиндра; нос ниже края
Общая производительность	Общее время судебного разбирательства	Время, пока все наживкой цилиндры были посещены

Таблица 2: Список когнитивных параметров

Обсуждение

МНВ парадигма может быть использован для измерения нескольких размеров безусловного поведения. Протокол может быть слегка изменено в зависимости от целей эксперимента. В этом протоколе мы обсудим параметры, время и измерения, как правило, используется в нашей лаборатории. Тем не менее, небольшие отклонения в измерениях устройства были использованы в прошлом, а также количество цилиндров на борту может варьироваться ^3. Часто исследования используют время тестирования 5 мин на испытании, но другие тестирование раз и может быть целесообразно, то есть, завершения теста, как только познавательной испытание успешно или в расширении время тестирования завершена, если животные имеют очень озабочены или физическими недостатками. Время суток испытаний был выбран под красным условий освещения, так как грызуны ночные животные и являются наиболее активными в начале темной фазы. Roedel и др. (2006) показано влияние света или стадии тестирования темно-поведенческих и когнитивных функцийв DBA мышей в MHB ^16. Другие исследования проводили эксперименты МНВ в условиях белого света ^1,6, однако, следует отметить, что в условиях тестирования белого света может вызвать поведенческие ингибирование и когнитивные нарушения (как показано на DBA мышей) ^16.

В таблицах 1 и 2 содержат большое количество поведенческих параметров, которые будут измерены. При анализе данных, это может привести к некоторым параметрам, указывающие на значительное увеличение например "задержки на первой плате ввода", но не в других параметров того же мотивационной системы (в данном случае "избегания"). В некоторых случаях это может привести к неубедительные результаты. Guilloux и др. (2011) внедренных поведения Z-баллы, чтобы поведенческой фенотипирования у мышей ^24. При использовании интегрированных поведенческих Z-баллы многочисленные параметры могут быть объединены в одну Z-балла описания конкретного motivatioнал система. Последующие Z-баллы могут, в свою очередь, быть более легко по сравнению по поведенческих испытаний и экспериментов.

Помимо описанных особенностей этой парадигмы, более глубокое использование стало очевидным в исследовании Саломонс и др. (2012). Привыкание к новизне двух линий мышей (BALC / CJ и 129P3 / J) в MHB сравнивали, демонстрируя разницу в поведенческой гибкости с указанием неадаптивного поведения профиль 129P3 / J мышей ^4, зеркальное нарушение адаптационных возможностей и, вероятно, даже патологической тревожности.

В заключение МНВ позволяет измерять несколько поведенческих аспектов в одном эксперименте. Комбинируя элементы из традиционной борту отверстия и испытания открытое поле, безусловного поведения, социального взаимодействия, познания и адаптационных возможностей, т.е. благосостояния могут быть исследованы. Этот тест может быть использован, например, чтобы оценить поведенческие изменения, связанные с pharmacological- и / илигенетические манипуляции, селекция и адаптационные возможности. По сравнению с классическими испытаний батарей, количество животных, необходимых заметно снижается, и стресс, испытываемый животным во время тестирования является крайне низким.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cognitive mHB apparatus			The box for cognitive testing is 50x50 cm by inserting a partition made of grey PVC in the standard mHB. A smaller board (35x22x1 cm) with 10 cylinders is placed in the middle of the box. All cylinders are scented with a flavor animals are attracted to (e.g. vanilla) and all are baited with a reward (e.g. a piece of almond) beneath a grid so the animals cannot remove it. Cylinders (often three) are cued with a colored ring (contrasting with the grey PVC) and are baited with a removable reward (e.g. 0.05 g piece of almond).
Vanilla flavor			Vanilla flavor dissolved in water (0.02%)
Camera			Camera that generates sufficient quality output to rescore the behavior from video.
Stage light			A theather light that allows to adjust the light intensity and the dimensions of the surface that is lit.
Behavioral scoring software			Behavioral scoring software.