Контраст расширенного ультразвуковое исследование для оценки спинного мозга кровотока в экспериментальной повреждением спинного мозга

Резюме

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Аннотация

Снижение расхода спинного мозга крови (SCBF) (т.е. ишемии) играет ключевую роль в травматического повреждения спинного мозга (ТСМ) патофизиологии и, соответственно, важной целью для нейропротективных лечения. Хотя несколько методов были описаны для оценки SCBF, все они имеют существенные ограничения. Чтобы преодолеть тот, мы предлагаем использовать в режиме реального времени усиленного контрастом ультразвуковой томографии (CEU). Здесь мы опишем применение этого метода в крысиной модели ушиба ТСМ. Яремную катетер сначала имплантировали для повторного введения контрастного агента, раствора хлорида натрия элегазовых инкапсулированных микропузырьков. Позвоночник затем стабилизировался с заказ 3D-кадра и спинного мозга твердая мозговая оболочка подвергается по ламинэктомией в THIX-ThXII. Ультразвуковой зонд затем устанавливают на задней поверхности твердой мозговой оболочки (покрытого ультразвуковой гель). Для оценки базового SCBF, один внутривенную инъекцию (400 мкл) противопоказанийул агент наносят записать его прохождение через неповрежденную спинного мозга микрососудов. Вес падение устройство затем используется для генерации воспроизводимого экспериментальную модель ушиб SCI. Контрастное вещество повторно вводят через 15 мин после травмы, чтобы оценить после ТСМ SCBF изменения. КЕС позволяет в режиме реального времени и в естественных условиях оценки изменений SCBF следующей ТСМ. В неповрежденной животного, ультразвуковое обследование показало неравномерное кровотока по интактного спинного мозга. Кроме того, 15 мин после ТСМ, было критической ишемии на уровне эпицентре а SCBF сохранился в более отдаленных районах нетронутыми. В районах, прилегающих к эпицентру (как ростральной и хвостовой), SCBF была значительно снижена. Это соответствует ранее описанной "ишемической полутени" зоне. Этот инструмент представляет большой интерес для оценки влияния терапии, направленных на ограничение ишемии и некроза тканей в результате После ТСМ.

Введение

Травматический травмы спинного мозга (SCI) является разрушительным состояние приводит к значительному нарушению в моторных, сенсорных и автономных функций. На сегодняшний день, никакой терапии не продемонстрировала свою эффективность у пациентов. Для такого причине, важно, чтобы определить новые методы, которые позволят улучшить оценку возможных методов лечения и может в дальнейшем выяснения травмы pathiophysiology ^1.

ТСМ разделена на два последовательных этапа, называемого первичных и вторичных повреждений. Первичный травмы соответствует начальной механической инсульта. В то время как вторичное повреждение групп каскадных различных биологических событий (таких как воспаление, окислительный стресс и гипоксии), что дополнительно способствовать прогрессивному расширению первоначального поражения, повреждения тканей и, следовательно, неврологического дефицита ^2,3.

В острой фазе ТСМ, нейропротективные лечения направлены на уменьшение вторичной патологии травмы и шульд соответственно улучшить неврологические исходы. Среди многих вторичных событий травмы, ишемия играет решающую роль ^4,5. На уровне эпицентра SCI, поврежденные паренхимных микрососудов препятствовать эффективной кровотока спинного мозга (SCBF). Кроме того, SCBF также значительно снижается в области, окружающей эпицентр травмы, площадь специально известный как "ишемической полутени зоне". Если SCBF не может быть быстро восстановлена ​​в течение этих регионах, ишемия может привести к некрозу паренхимы и дополнительного дальнейшего повреждения нервной ткани. Поскольку даже малейшего сохранение ткань может иметь существенные последствия функции, она представляет большой интерес для разработки лекарств и методов лечения, которые могут уменьшить ишемию пост-SCI. Чтобы подчеркнуть это явление, предыдущая работа показала, что сохранение только 10% миелиновых аксонов было достаточно того, чтобы ходить в кошках после ТСМ ^6.

Хотя несколько методов были описаны для оценки SCBF, ву всех есть существенные ограничения. Например, использование радиоактивных микросфер ^7,8 и С14-iodopyrine авторадиографией ⁹ требуется последующее жертву животных и не могут быть повторены в более поздние моменты времени. Техника оформление водорода ¹⁰ зависит от введения интраспинальных электродов, которые могут дальнейшее повреждение спинного мозга. В то время как лазерный доплеровский изображений, фотоплетизмография ^14,15 и в естественных условиях световой микроскопии ¹⁶ имеют очень ограниченную глубину / область измерения ^11-13.

Наша команда ранее показали, что контраст усиливается ультразвуковое (КЕС) изображения может быть использован для оценки в режиме реального времени и в естественных условиях изменения SCBF в паренхиме спинного мозга крысы ^17. Важно отметить, что подобный метод был применен Хуанг и др. В модели свиньи ТСМ ^18. КЕС относится конкретный режим ультразвуковой визуализации, которая позволяет связать в оттенках серого морфологический чатвозрастов (полученные с помощью обычного B-режиме) с пространственным распределением кровотока ^19. SCBF изображений и количественное опирается на внутрисосудистого введения эхо-контрастных агентов. Контрастное вещество состоит из гексафторида серы микропузырьков (средний диаметр около 2,5 мкм и 90%, имеющие диаметр менее чем 6 мкм), стабилизированный фосфолипидов. Микропузырьки отражают ультразвуковой луч, испускаемый датчиком, таким образом, увеличивая эхогенность крови и увеличение контрастности тканей в соответствии с их кровотока. Таким образом, можно оценить кровоток в данной области, представляющей интерес в зависимости от интенсивности отраженного сигнала. Микропузырьки также безопасен, и они были клинически применены в организме человека. Гексафторид серы быстро очищается (имею в виду терминала полураспада 12 мин) и более 80% от введенной гексафторида серы восстанавливается в выдыхаемом воздухе в течение 2 мин после инъекции. Этот протокол обеспечивает простой способ использовать CEU чатстарения для оценки изменений в SCBF крысы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Методы, описанные в этой рукописи были одобрены комитетом по биоэтике в Lariboisière школы медицины, Париж, Франция (CEEALV / 2011-08-01).

1. Подготовка прибора

1. Подготовьте и очистите следующие инструменты для катетера Micro-щипцы, микро-ножницы, микро-сосудистый зажим, большие ножницы, хирургические нити (черный плетеный шелк 4-0) и 14 г катетер. Heparinize катетер с раствором гепарина (5000 ед / мл).
2. Подготовьте и очистите следующие инструменты для ламинэктомией: большие ножницы, скальпель и фрезы кости. Выполните ламинэктомию с заказ фрезы кости, направленных на снижение риска причинения вреда спинного мозга во время ламинэктомией (рис 1).
3. Настройка 3D-кадр, используемый для позиционирования и стабилизации животного. Заказ кадр построен с элементами внешней фиксации Хоффман 3 в ассоциации с пинцетом, whicч были изогнуты, чтобы соответствовать поясничного отдела позвоночника животного.
4. Подготовьте веса падение устройства (ударного), используемый для спинного мозга биомеханической травмы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: заказ устройство сдавление был разработан с 3D программного обеспечения и печати в формате 3D.
5. Включите ультразвуковой машины.
6. Подготовьте набор для восстановления контрастного вещества.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комплект включает в себя 1 флакон, содержащий 25 мг лиофилизированного порошка, 1 предварительно заполненный шприц, содержащий 5 мл хлорида натрия и одну систему передачи мини-шип (рис 2). Шаги для восстановления контрастного агента приведены ниже (в разделе 5).

2. Катетеризация яремной вены (рис 3)

1. Обезболить животное с 4% изофлуран. Поместите животное в положении лежа на спине. Подтвердите правильное обезболивания, гарантируя, что животное не реагирует, когда лапы зажаты с пинцетом. Применить ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость то время как ундэ анестезия.
2. Бритье шеи и очистить кожу. Сделайте надрез по средней линии шеи. Уберите sternocleidomastoidian мышцы для того, чтобы найти внутреннюю яремную вену. Затянуть лигатуры на ростральной части вены.
3. Нанесите капилляров зажим на вену, 1 см ниже лигатуры. Передайте еще нить вокруг вены, чуть ниже зажима с узла готовы быть затяните при зажим выпущен.
4. Откройте стену вен (венотомия) между зажимом и ростральной лигатуры. Ввести 14 г катетер в просвет вены и толкать его по направлению к сердцу.
5. Когда дело доходит до зажима против отпустить последнего и нажмите катетер дальше. Закрепите катетер в вену, крепко затянув узел на вене катетер с внутри.
6. Оценка проходимости катетера путем удаления небольшое количество венозной крови в катетере, а затем затем промывка его с гепаринизированной физиологического раствора. Это предотвращает закупорку Сatheter потенциальным сгустка крови.
7. Подключите гибкий шланг с катетером для дальнейшего введения контрастного агента микропузырьков (). Держите его закрытия (опломбированный) до готовности к использованию.

3. Доступ позвоночника, Ламинэктомия и Крыса позиционирования (в 3D-кадр)

1. Поместите животное в квартире, склонной горизонтальном положении. Бритье и очистить спину (грудной отдел) животного.
2. Определить последнее ребро (XIII-на крысах) при пальпации (рис 4). Это позволяет оценить местоположение грудного позвонка XIII-(ThXIII).
3. Сделайте 4 см разрез кожи по средней линии, с центром в ThXIII. Откройте разрез кожи, а также основной Бурса. Соблюдайте апоневроз мышцы спины, а также кончики позвонков позвоночника процессов.
4. Тщательно локализовать процесс позвоночника ThXIII пальпацией в XIII-ребра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: XIII-ребро соединяется с ThXIII и, следовательно, представляет собой легко Locaте анатомические вехой для идентификации ThXIII. Этот шаг позволяет локализация ThXII в THIX остистый отросток, а также L1 и L2 (первый и второй поясничные позвонки).
5. Вырезать мышечной апоневроз и отсоедините мышцы по обе стороны, чтобы разоблачить остистые отростки, в пластинки и суставы от THIX в L2. Expose боковые аспекты L1 и L2, отсоединив мышцы от поперечных отростков.
6. Крюк резцов животного на 3D-кадр, чтобы обеспечить положение (рисунок 5). Зажим позвонки L1 и L2 с измененными щипцами. Подключите измененные щипцы для 3D-кадр для того, чтобы стабилизировать животное.
7. Осторожно потяните каудально щипцы, удерживающие поясничного отдела позвоночника, чтобы затянуть весь позвоночник и поднять грудную клетку со скамейки.
   Примечание: С описанным устройством животное должно иметь возможность дышать. Кроме того, несмотря дыхательных движений грудной клетки, позвоночника и спинногошнур должен также остаются неподвижными.
8. Снимите остистый ПРОЦЕССОВ от THIX в ThXII. Аккуратно вставьте нижнюю лезвие резака кости под левой пластинки ThXII и закройте резак кости для того, чтобы сократить пластинку (Рисунок 6).
9. Повторите то же самое для маневра правой пластинки и последовательно удалить заднюю арку. Повторите предыдущие шаги для позвонков ThXI к THIX для достижения четыре уровня ламинэктомию. Снимите обе суставы для каждого позвонка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении процедуры, очистить операционное поле от местного кровотечения. Для этого используйте ватные тампоны и орошения прохладной физиологического раствора. Гемостаз систематически происходит в течение нескольких минут.

4. КЕС зонд позиционирования

1. Обложка твердую мозговую оболочку с ультразвуковым гелем. Это позволяет эффективную передачу ультразвуковых волн между зондом и спинного мозга (рис 7).
2. Стабилизировать УЗИ датчика остроумиега зажим, который может быть затем подключен к 3D-кадра с помощью шарнирного рычага. Вручную позиционировать зонд. Убедитесь, что зонд ориентирован на получение косой продольный срез сагиттальной. В правильном положении, спинной мозг строго горизонтально на изображении и центральный канал спинного мозга видна по всей сегмента спинного мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позиционирование должно руководствоваться в В-режиме реального времени изображения, отображаемого на экране ультразвукового аппарата. Фокусное расстояние от ультразвукового зонда должны быть согласованы с центральным каналом спинного мозга. В это время, задняя сторона спинного мозга доступна, которые в конечном счете позволяют позиционирования ударного.
3. При оптимальной, заблокировать шарнирное руку, чтобы стабилизировать положение.

5. Подготовка контрастного вещества - микропузырьков Восстановление

1. Используя содержимое коммерческого набора восстанавливающей и подключите стержень поршня от его крепления TIGhtly в шприц (по часовой стрелке). Откройте системный перевод пузырь и удалить шприц наконечник крышку. Откройте крышку системы передачи и подключить шприц к системе передачи (крепятся плотно).
2. Извлеките защитный диск из флакона. Слайд флакон в прозрачном рукаве
3. Система передачи и нажмите твердо, чтобы заблокировать флакон на месте.
4. Очистить содержимое шприца во флакон нажатием на штока плунжера. Встряхивать в течение 20 сек, чтобы смешать все содержимое в ампулу с получением белого молочного однородную жидкость.
5. Инверсия систему и тщательно снять контрастное вещество в шприц. Отвинтите шприц из системы передачи. После восстановления (по назначению), 1 мл полученной дисперсии содержит 8 мкл гексафторида серы в микропузырьков. Нарисуйте подвеска микропузырьков в 100 мл шприц. Вставьте 100 мл шприц в электронасоса. Закройте крышку.
6. Начните постоянное перемешивание Reсоставляли микропузырьки. Полученный постоянном перемешивании медленным вращением шприца, который поддерживает микропузырьков суспензии. Подключите насос к яремной катетер через гибкий шланг. Установите машину ультразвука, чтобы "Harmonic Mode".
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последнее соответствует в режим, в котором микропузырьки могут быть специально обнаруженного и визуализируется. Этот режим имеет низкую механическую индекс, который не нарушает микропузырьков в отличие от В-режиме.
7. Очистите катетер вливая первую дозу (400 мкл) контрастного агента. Во время этой первой инфузии, убедитесь, что микропузырьки появляются на экране ультразвука. Это подтверждает, что весь контур (из шприца в кровоток крысы) цела и открытым.
8. Установите машину ультразвука, чтобы «Б-режиме», чтобы визуализировать спинной паренхимы мозга и разрушение нескольких оставшихся микропузырьков в кровотоке. Высокая частота «В-режиме" TranСмитс высокой энергии микропузырьков, что позволяет им пробоя.
9. Пусть животное неподвижно лежал около 30 мин. Этот период позволяет стабилизации гемодинамических параметров.

6. Оценка SCBF в неповрежденном состоянии спинного мозга

1. Установите ультразвуковой аппарат к "Harmonic Mode". Начало одновременно (1) вливание контрастного вещества (400 мкл) и (2) хронометра.
   Примечание: Во время инфузии, концентрация микропузырьков в кровотоке следует увеличить, что позволяет контрастности представляя спинного мозга (рисунок 8). Так микропузырьки быстро разрушается, концентрация в крови начинает падать микропузырьков после того, как инъекции завершен, который генерирует к постепенному уменьшению контрастности визуализации спинного мозга.
2. После 1 мин, выберите (нажмите) кнопку "Клип-магазин" на ультразвуковой машины. Это позволит сохранить одну 1 мин гAW ультразвуковых данных и записи видеоизображения (который ранее был на экране ультразвукового).
3. Установите машину ультразвука, чтобы «Б-Mode". Это позволит устранить оставшиеся микропузырьков.

7. Экспериментальная ТСМ

1. Использование микроманипулятора, подключенный к 3D-кадра, расположить веса падение столкновение устройство так, чтобы кончик ударного вступает в контакт с твердой мозговой оболочки (на спинной средней линии мозга), на стыке между ThX и ThXI (фиг.9) ,
   Примечание: Этот уровень должен соответствовать середине сегмента спинного мозга наблюдается с ультразвуковым устройством. Нападающий и тело ударного 8 мм в диаметре. Кончик ударного, который будет генерировать травмы, 3 мм в диаметре.
2. Поместите нападающий в сдавление устройства на 10 см высокое положение. Вызвать экспериментальной ТСМ, выпустив нападающего в сдавление устройства. Нападающий падает и релизы йе ударный, ранив спинной мозг. Заказ столкновение доставляет влияние эквивалентно 10 г вес снизился с высоты 10 см.

8. Оценка SCBF 5 мин после SCI

1. Повторите действия, описанные в разделе 6 (оценка SCBF). Микропузырьки не сможет пройти через поврежденную микрососудов и травматизма эпицентре останется темным (Рисунок 10).

9. жертвоприношение животных

1. Эвтаназии животное с внутрибрюшинным смертельной инъекции пентобарбитала (100 мг).

10. Количественная SCBF по анализу форуме

1. Начните Ультра-Продлить программного обеспечения, используемого для количественного (на УЗИ аппарате). Выберите "Файл", а затем выберите ранее сохраненные сырые данные и открыть связанные с ними файлы. Активируйте "Режим количественного", нажав (выбор) Кнопка "Чи Вопрос". СелеКТ "Установить ROI" (кнопка) и выберите круглую форму.
2. Выберите "Draw ROI" (кнопка) и нарисовать семь прилегающих круговые области интереса (ROI) на спинной мозг (рисунок 11). Откройте меню "Место" и выберите "Curve" значение функции. Соблюдайте программное обеспечение, отображающее несколько кривых, каждая из которых соответствует изменениям концентрации микропузырьков внутри ROI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая кривая имеет "перфузии-deperfusion" профиль. Первый этап кривой плоская и соответствует периоду до прихода микропузырьков. На втором этапе, концентрация микропузырьков быстро увеличивается в результате инфузии. На третьем этапе, который начинается, когда вливание завершено, концентрация микропузырьков постепенно уменьшается, поскольку они disintegratse в кровотоке.
3. Поместите первую вертикальную линию в начале второго этапа CUrve и выберите "SET". Это сообщает программа, где, чтобы начать анализ.
4. Поместите вторую вертикальную линию в конец записи и снова выберите "SET". Это сообщает программа, где остановиться анализ.
5. Посмотрите на меню "CV" и записать значение "AUC", который соответствует "площадь под кривой" анализируемого. Это значение пропорционально SCBF внутри соответствующего ROI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

С описанным выше протокол, можно отобразить SCBF вдоль продольной спинного мозга сагиттальной сегмента.

В неповрежденной спинного мозга, как представляется, SCBF нарушения в паренхиме (рисунок 12). Это может быть связано с переменной распределения radiculo-медуллярной ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Хотя мы описали, как использовать CEU в крысиной модели SCI ушиб, этот протокол может быть изменен, чтобы соответствовать другим экспериментальных целей или моделей SCI. Мы выбрали для измерения SCBF только в двух временных точках (до того травм и 15 мин после SCI), однако количество временных то?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job