Мозаика данио рерио Трансгенез для функционального геномного анализа потенциальных совместных генов в опухолевых патогенеза

Резюме

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Аннотация

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Введение

Раки прогрессирующих заболеваний отмечены накоплением патологических мутаций, делеций и прибыли хромосом с течением времени. Эти генетические аномалии могут влиять несколько клеточные процессы, начиная от клеточного цикла, клеточной гибели, энергетический метаболизм и сборки цитоскелета, чтобы подчеркнуть реакции, такие как гипоксии. Таким образом, канцерогенез отражает коллективные действия нескольких генетических аберраций по всему спектру биологических процессов. Последние интегративные геномные научно-исследовательские работы, в том числе весь секвенирование генома, ExoME последовательности, направленной последовательности, глубокой последовательности и генома исследования ассоциации, определили рост числа новых генетических изменений во всех существу типов опухолей ^1-4. Во многих случаях, генетические повреждения происходят вместе в неслучайной образом ^5-8, что свидетельствует об их сотрудничество в патогенезе заболевания. Пройдя онкогенных роли большого массива аберрантно экспрессируются гены в результате Fрум эти геномные повреждения необходимо разработать новые терапевтические стратегии и понять ответов опухолевых клеток к этим агентам, но это оказалось сложной задачей, требующей очень надежные модели животных систем для проведения высокой пропускной функциональной геномного анализа в VIVO.

Хотя млекопитающие, особенно грызуны, являются предпочтительными модели в биологии рака, данио начал привлекать большое внимание. Костистых данио (Dario rerio) был использован в качестве модельного организма для изучения развития с 1960 года и впервые был применен к изучению патогенеза опухолей в 1982 году ^9-11. Простота обслуживания, малого размера тела и высокой плодовитостью сделать данио надежную модель для крупномасштабных вперед генетических экранов для выявления мутаций, которые придают аномальные и патологические фенотипы ^10. Оптической прозрачности данио эмбрионов Еще одной ключевой особенностью поддержку более широкого использования этой модели рака, аэто позволяет в естественных изображений, которые будут проводиться, чтобы найти развитие опухоли в режиме реального времени ^9, приложение, которое довольно сложно грызунов ^12. Недавний анализ сравнительной геномике данио референсный геном (Zv9) показал, 26206 белок-кодирующих генов, с 71% из них человека ортологи, из которых 82% соотнесены с генами, ассоциированных с заболеваниями в онлайн Законы Менделя в Man (OMIM) базы данных ^{13, 14.} Следовательно, данио был использован для моделирования различных типов рака человека, в том числе ⁸ нейробластомы, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (Т-ОЛЛ) ^{15,16, 17,18} меланомы, саркомы Юинга ^19, рабдомиосаркома ^20,21, карциномы поджелудочной железы ^22, гепатоцеллюлярной карциномы ²³ и миелоидный злокачественных опухолей ^24,25, и была выбрана в качестве модели рака для ксенотрансплантации изучает ^11,26.

Стабильный трансгенныхподход у рыбок данио часто используется для изучения влияния амплитудно-оф-функции генов в нормальном развитии или патогенеза заболевания ^27,28. Для разработки такой модели (фиг.1А), один вводит конструкцию ДНК, содержащую ген интерес обусловлен тканеспецифического промотора в эмбрионы дикого типа один-клеток. Три-четыре месяца после инъекции, когда введенный эмбрионы достигают половой зрелости, они ауткроссной дикого типа рыбы для выявления тех, показывающих интеграции ДНК-конструкции в их зародышевой линии, которые лицензируются их как основателя рыбы. Многие факторы, такие как число копий и интеграции сайта трансгена, влияет на экспрессию трансгена в стабильных трансгенных линий. Таким образом, разработка трансгенного модели опухоли, несколько стабильных трансгенных линий экспрессирующих онкоген единого должны быть сгенерированы первым и подвергают скринингу на линии, экспрессирующих трансген на уровне, что может привести к индукции опухолей. Однако, если избыточная экспрессия кандидата Oncogene является токсичным для половых клеток, трудно генерировать стабильный трансгенной линии непосредственно с гиперэкспрессией трансген ^29. Таким образом, этот подход может быть трудоемким, с высоким риском неудачи создать подходящую модель рака.

Здесь мы покажем альтернативную стратегию, основанную на мозаика переходный трансгенеза (рис 1б), что обеспечивает уникальные преимущества по сравнению с традиционными стабильной трансгенеза для функционального геномного исследования в естественных условиях. При таком подходе один или более трансгенные конструкты вводятся в стадии один-клеток трансгенных или дикого типа эмбрионов. Инъецированные конструкции ДНК, содержащие трансгены, то мозаично и случайным образом объединены в первичном впрыскиваемого рыбы, в результате чего смешанных генотипов в пределах нескольких клеточных популяций в отдельных рыб ^30. Кроме того, совместной инъекции многократного ДНК-конструкций в эмбрионах один-клеток приводит к интеграции совместно в одной и той же клетке в случайных местах, позволяя один, чтобы TRAсе клетки с экспрессией трансгенов и исследовать взаимодействия различных генов во время патогенеза заболевания в мозаичных животных ^31. В качестве доказательства принципе, мы временно сверхэкспрессируется мутационно активированный алк (F1174L) с гена-репортера mCherry в периферической симпатической нервной системы (PSNS) под контролем допамина бета-гидроксилазы (d βh), промотор дикого типа рыбы и трансгенных рыб с гиперэкспрессией MYCN. ALK, который кодирует рецептор тирозинкиназы, является наиболее часто мутированным геном в нейробластомы высокого риска ^5-7,32,33. алк (F1174L), в качестве одного из наиболее частых и сильных соматических мутаций активации, является чрезмерно представлены в MYCN- усиливается пациентов нейробластомы высокого риска, а синергетический эффект с MYCN гиперэкспрессией ускорить нейробластомы туморогенез в обоих стабильных трансгенных мышей и трансгенных данио моделей ^8,34,35. По мозаикипереходный сверхэкспрессия алк (F1174L) с mCherry в MYCN трансгенной рыбы, мы воспроизводятся ускорение начала опухоли наблюдалось в стабильной гиперэкспрессией трансгенных рыб как алк (F1174L) и MYCN, предполагая, что мозаики стратегия трансгенез могут быть использованы, чтобы быстро и эффективно оценить относительный вклад нескольких онкогенов в инициации опухоли в естественных условиях.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все данио исследования и содержанием животных были проведены в соответствии с Mayo Clinic Институт IACUC утвержденных протокол № A41213.

1. ДНК-конструкции для Трансгенез

1. Амплификации 5,2 т.п.н. допамина бета-гидроксилазы (d βh) промоторной области ⁸ с помощью клона CH211-270H11 ВАС (от BacPac ресурсов центра (BPRC)) в качестве матричной ДНК. Используйте соответствующей системы ПЦР для длительного и точного ПЦР-амплификации длинных ДНК-матриц и следующие программы цикла для ПЦР: 94 ° С в течение 2 мин, 10 циклов (94 ° С, 15 сек, 50 ° С, 30 сек, 68 ° С, 8 мин), а затем 30 циклов (94 ° С, 15 сек, 53 ° С, 30 сек, 68 ° C, 8 мин), 68 ° С, 4 мин (прямой праймер 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' и обратный праймер 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
2. Создайте D βh -pDONRP4-P1R входа CLONE ⁸ с использованием коммерческого рекомбинантного клонирование системы, такие как многосайтовой шлюз. Смешайте 1 мкл очищенного dβh продукта ПЦР (172 нг / мкл), 1 мкл (150 нг / мкл) pDONRP4-P1R доноров вектора (вместе с другими векторы шлюз щедрые подарки от доктора Чи-Бин Chien, Univ. Юта) , 4 мкл ТЕ-буфера (рН 8,0) с 2 мкл ВР Clonase ферментной смеси, инкубирование в течение 1 ч при 25 ° С, а затем преобразовать в один выстрел TOP10 компетентный E. палочка в соответствии с протоколом производителя.
3. Создание d βh: EGFP-MYCN трансгенных построить ⁸ с использованием рекомбинантного клонирование системы, упомянутые в шаге 1.2. Смешайте 1 мкл каждого входа клона (150 нг / мкл), включая 5,2-кб dβh промотора (dβh -pDONR P4-P1R конструкта), EGFP хватает стоп-кодон (PME-EGFP постройки), и человек MYCN кДНК (щедрый подарок от доктора Hogarty в детской больнице Пенсильвании, MYCN-pDONRP2R-P3 конструкция), 1 мкл (150 нг / мкл) модифицированного вектора назначения, содержащего сайты узнавания I-SCEI (щедрый подарок от д-ра К. Grabher, Технологического института Карлсруэ, Карлсруэ, Германия), 4 мкл ТЕ-буфера ( рН 8,0) с 2 мкл LR Clonase ферментной смеси, инкубирование в течение 1 ч при 25 ° С, а затем преобразовать к химически компетентную E. палочка, таких как Один выстрел топ-10 и следовал протоколу производителя.
4. Сделать MITF: MITF трансгенных построить ⁸ расщеплением PNP-MITF вектор с NotI и SalI рестриктаз в течение 2 ч при комнатной температуре, и субклонированием выпущен 2,65 Кб (щедрый подарок от доктора Д. Raible, Univ Вашингтона). ДНК-фрагмент, содержащий промотор MITF и кодирующую последовательность гена данио Mitf в NotI и MluI участков модифицированной pBluescript вектора, содержащей фланкирующие сайты узнавания I-SCEI (щедрым подарком от д-ра Hui Feнг, Бостонский университет), используя ДНК-лигазы Т4 в соответствии с протоколом производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности генерации стабильных MYCN экспрессирующие линии, d βh: EGFP-MYCN и MITF:. MITF конструкции ДНК coinjected в эмбрионы этап перламутра одноклеточных Перламутр обозначает тип мутантного рыбы, лишенные нервного гребня полученных меланофоров в процессе развития ^36. Таким образом, появление пигментных клеток в инъецированных эмбрионов предполагает включение MITF: MITF конструкции ДНК в геном. Было показано, что две или три coinjected конструкции ДНК могут быть коинтегрированы в геноме рыбы ^31. Таким образом, пигментация, вызванные MITF выражения может служить маркером для интеграции dβh: EGFP-MYCN трансгена и для облегчения идентификации MYCN стабильной трансгенной линии.
5. Смешайте D βh: EGFP-MYCN и MITF: MITF ДНКконструкции в соотношении 3: 1 в общем объеме реакции 15 мкл с 1 мкл I-SCEI фермента и 0,75 мкл буфера. Убедитесь, что общая сумма ДНК в реакции не превышает 750 нг.
6. Провести пищеварение I-SCEI при комнатной температуре 4 ч или O / N. На второй день, Я-SceI- расщепляли ДНК готовы к микроинъекции или можно хранить при -20 ° С для инъекций в будущем. Хранить фермент I-SCEI при -80 ° С в небольших аликвот, чтобы сохранить свою эффективность фермента.
7. Субклона человека ALKF1174L и ген ALK дикого типа из вектора pCDNA3 (щедрый подарок от доктора Георгия в Дана-Фарбер институт рака) ⁷ в EcoRI и NotI сайтов вектора pENTRY1A (щедрый подарок от д-ра К. Grabher, Технологический институт Карлсруэ, Карлсруэ, Германия) с использованием ДНК-лигазы Т4 в соответствии с протоколом производителя.
8. Создайте D βh: ALKF1174L </ EM> или dβh: ALKWT трансгенные конструкции с использованием рекомбинантной системы, как указано в Протоколе 1.2. Короче говоря, объединить три клонов входа, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (или ALKWT -pENTRY1A) и P3E-поли, в модифицированный вектор адресат, содержащий сайты узнавания I-SCEI (щедрый подарок от д-ра К. Grabher, Карлсруэ Технологический институт Карлсруэ, Германия), с использованием LR Clonase смеси ферментов, в соответствии с протоколом производителя.
9. Смешайте d βh: ALKF1174L (или dβh: ALKWT) и dβh: mCherry ДНК-конструкции в соотношении 3: 1 и линеаризации их с I-SCEI фермента, как описано в протоколе 1,5-1,6.

2. Микроинъекция

1. Используйте стеклянные микропипетки с диаметром 1,0 мм для всех инъекций ^37. Оторвать наконечник из стекла микропипеток с лезвием бритвы перед инъекцией. Калибровка объем впрыска нагнетающимчисле H ₂ O в каплю минерального масла. Измерьте диаметр полученных капель и регулировать давление microinjector (или длительность импульса давления), чтобы гарантировать, что объем впрыска составляет менее 10% от общего объема клеток из одной клетки стадии эмбрионов.
2. Добавить еще 0,5 мкл свежей I-SCEI фермента (5 ед / мкл) в 5 мкл инъекционного раствора, содержащего ДНК-конструкций непосредственно перед впрыском повысить эффективность трансгенеза ^38. Вводят 50-80 мкг линеаризованных конструкций ДНК в цитоплазму эмбрионов один-клеток стадии. Чтобы обеспечить успех инъекции, смешать образец с 0,25% фенола красного для визуализации. Если клетки становятся красными после инъекции, это означает, микроинъекции успешно. Для обеспечения высокой скорости успеха для создания трансгенных рыб, мы, как правило, вводят так много как 500 эмбрионов.
3. Для создания трансгенных рыб, стабильно экспрессирующих MYCN, coinject линеаризованной D βh: EGFP-MycN и MITF: MITF конструкции ДНК (в соотношении 3: 1) в эмбрионы пигментации мутанта перламутра рыбок данио на стадии одной клетки. Выражение MITF служит в качестве репортера для интеграции трансгенных конструкций в рыбной генома.
4. Для мозаики гиперэкспрессией ALK в дикого типа или MYCN трансгенных эмбрионов, совместно вводить линеаризованную D βh: ALK F1174L (или dβh: ALKWT) с dβh: mCherry ДНК-конструкции (в соотношении 3: 1) в одной ячейке эмбрионы в результате разведение F1 гетерозиготной TG (dβh: EGFP-MYCN) трансгенных рыб дикого типа AB рыбы. Таким образом, половина потомства являются трансгенными для MCYN и половина дикого типа.

3. Экран для стабильных или Мозаика трансгенных рыб

1. Для повышения эффективности идентификации устойчивых MYCN экспрессирующие линий, обезболить, прежде всего, инъекционные эмбрионов перламутра с Tricaine (0,02%) вт дней 3-5 после оплодотворения и экрана для пигментации. Трансфер эмбрионов с пигментацией на новую чашку Петри со свежей яичной воды и поднять их до половой зрелости, для дальнейшего скрининга основателя рыбы, которые несут D βh: EGFP-MYCN трансген в зародышевых клетках.
2. Чтобы определить его учредителями с передачи зародышевой линии EGFP-MYCN, скрещивания пигментированной F0 взрослых рыб дикого типа AB рыбы и экран для EGFP-положительных эмбрионов на 1-2 дней после оплодотворения для дальнейшего генотипирования. Поместите одну EGFP-положительных F1 эмбриона в ПЦР-пробирку и удалить всю жидкость. Добавить 50 мкл GDNA буфера для экстракции, который содержит 12,5 мкл 4х буфера для лизиса, 35 мкл H ₂ O и 2,5 мкл протеиназы К (10 мг / мл), одного эмбриона. Инкубируют реакционную смесь в течение 2-3 ч при 55 ° С, а затем 10 мин инкубации при 98ºC для инактивации протеиназы К. Для 50 мл буфера для лизиса 4x, добавить 500 мкл 1 М Трис (рН 8,4), 2,5 мл 1М KCl тО 47 мл H ₂ O. ПРИМЕЧАНИЕ: После F0 MYCN стабильной трансгенных рыб разводят дикого типа AB рыбы, все потомство пигментированные. Таким образом, пигментация не может служить маркером для идентификации MYCN- положительного рыбы. В то время как в трансгенных рыб MYCN, EGFP-MYCN слитый белок экспрессируется в сети PSN, в том числе симпатических нейронов в верхних шейных ганглиев и последовательного сегментной ганглии симпатической цепочки и не-PSNS дофаминергических нейронов, таких как продолговатого мозга и черепной ганглии ^8. Таким образом, выражение EGFP может служить маркером для идентификации MYCN стабильных трансгенных эмбрионов.
3. Используйте 2 мкл гДНК, извлеченные из окрашенного эмбриона F1 в качестве матрицы, праймеры MYCN -test F1: 5'-CTG СТТ GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT ВКТ ТТГ AGG УВД AG-3 ', и следующая программа остроумиеч ГХ-RICH PCR System: 1 цикл 95 ° С в течение 3 мин, 25 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 58 ° C в течение 30 сек и 72 ° С в течение 3 мин. Как правило, мы генотипу 14-16 пигментные эмбрионов из одной спаривания, чтобы подтвердить наличие интегрированного MYCN трансгена в пигментных эмбрионов, более чем на 6 основатель рыба с гиперэкспрессией MITF и MYCN были определены с помощью этого метода.
4. Поднимите оставшуюся часть эмбрионов F1 EGFP-положительные. Ребро ролик и генотип их на 2-3-месячного возраста с использованием вышеуказанного протокола для дальнейшего подтверждения интеграции трансгена в MYCN рыбы. Порода F1 MYCN стабильной трансгенных рыб дикого типа AB рыбы. Co-инъекции линеаризованному D βh: ALK F1174L (или dβh: ALKWT) с dβh: mCherry ДНК-конструкции в одноклеточных зародышей, как описано в протоколе 2.4.
5. Сортировать MYCN экспрессирующие эмбрионов в эксперименте, описанном в протоколе 2,4 с помощью стереоскопического Fluorфлуоресценцию микроскоп, откроется окно, прежде всего, инъекционные эмбрионов в дни 1-3 после оплодотворения для выражения EGFP-MYCN в сети PSN. Затем, в течение дней 2-5 после оплодотворения, анестезию эмбрионов с Tricaine (0,02%) и сортировать эти MYCN- положительные или отрицательные эмбрионы раз на основе экспрессии mCherry в PSNS с использованием флуоресцентного микроскопа стереоскопического. Выражение mCherry служит в качестве маркера для коэкспрессии ALK в тканях мозаика первичной инъекции животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ~ 600 потомство в результате селекции MYCN стабильной трансгенных рыб дикого типа рыбы вводили в группе из линеаризованных конструкций ДНК, в том числе г βh: ALK F1174L и dβh: mCherry, dβh: ALKWT и dβh: mCherry или dβh : mCherry один, соответственно. Мозаика выражение mCherry можно наблюдать в 70-90% от введенного в первую очередь рыбы. Половина до однойтретий введенного рыбы выжили через стадии личинки на опухоли часов.
6. Поднимите все mCherry + MYCN + и mCherry + MYCN - эмбрионы в соответствии со стандартными протоколами от рыбок данио книги ³⁹ и следить за опухоли начало, начиная с 5 недель после оплодотворения.

4. Опухоль Часы в мозаичных трансгенных рыб

1. Монитор mCherry- положительный первую очередь вводят рыбу раз в 2 недели, начиная с 5 недель после оплодотворения доказательств опухоли начала.
2. Обезболить рыбу с Tricaine (0,02%) и на экране на наличие mCherry - и EGFP экспрессирующие опухоли в сети PSN под Nikon СМЗ-1500 стереоскопическое флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровым взгляд DS-U1 камеры.
3. Чтобы подтвердить, что опухоли выражают ли ALK трансген, изолировать mCherry- и EGFP-положительных масс для ALK генотипирования ПЦР.
4. Использование ПЦР, усиливают геномной ДНКэкстрагируют из развитых опухолей со следующими праймерами: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT CGG GTC ААТ ГХ-3 'и ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT ГХ-3' и реакционную следующие ПЦР: 1 цикл 94 ° С в течение 5 мин, 30 циклов (94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 72 ° С в течение 60 сек). Затем, последовательность ПЦР-продукт с ALK P7 грунтовки для дальнейшего подтверждения существования мутанта или дикого типа ALK в mCherry-позитивных опухолей.

Результаты

Для исследования ли избыточная экспрессия мутационно активированного ALK F1174L или дикого типа ALK могли бы сотрудничать с MYCN индукции нейробластомы, мы сверхэкспрессируется либо активированного человеческого ALK или дикого типа человека ALK под контролем d βh п?...

Обсуждение

В этом представительном исследовании мы использовали переходный соинжекцию и экспрессии, активированного ALK с геном-репортером mCherry в MYCN экспрессирующие трансгенных рыб, чтобы показать, что эти гены сотрудничать заметно ускорить начало нейробластомы, в соответствии с н...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY