Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Резюме

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Аннотация

И транскрипции и пост-регуляция транскрипции имеют огромное влияние на экспрессию генов. Тем не менее, общепринятые на основе клеток методы скрининга сосредоточиться на регуляции транскрипции, являясь, по сути, направленные на выявление промотора таргетирования молекул. В результате, после транскрипции механизмы в основном раскрыты в экспрессии генов развития целевых лекарств. Здесь мы опишем клеточном анализе, направленную на изучение роли нетранслируемой области (3 '3 УТР) в модуляции судьбе своего мРНК, и в идентификации соединений, способных изменить его. Анализ основан на использовании люциферазы репортерного конструкта, содержащего 3 'UTR из интересующего гена стабильно интегрирован в болезнь релевантных клеточной линии. Протокол разделен на две части, с особым акцентом на первичном скрининге, направленной на идентификацию молекул, влияющих на активность люциферазы после 24 ч обработки. Вторая часть протоколаописывает против скрининга необходимо разделить соединения, модулирующие активность люциферазы в частности, путем УТР в 3 '. В дополнение к подробным протокола и репрезентативные результаты, мы обеспечиваем важных соображений о развитии анализа и проверки на попадание (ов) на эндогенной мишени. Описано на основе клеток репортер ген анализ позволит ученым идентифицировать молекулы, модулирующие уровни белка с помощью пост-транскрипционных механизмов, зависящих от 3 'UTR.

Введение

В течение длительного периода транскрипции регуляции экспрессии генов считалось, играть существенным, если не исключительную роль в области контроля над производством белка. Накопленные данные, однако, показывает, что после транскрипции регулирование способствует столько же, если не более, регуляции транскрипции, чтобы определить клеточный белок обилие ^1,2. Посттранскрипционных контроль экспрессии генов является гораздо более сложным и сложным, чем это было на первый взгляд. В самом деле, все различные этапы пост-контроля транскрипции появились, чтобы быть регламентированы, в том числе процессинга мРНК, локализации, оборота, перевод ^3, а также недавно описанных обратимой РНК метилирования ^4. Из числа посттранскрипционных регуляции процессов могут быть затронуты, анализа, описанного ниже фокусируется на тех, которые связаны 'нетранслируемой области (3' мРНК 3 UTR). 3 'UTR широко влияет мРНК судьбу в основном через специфического взаимодействия РНК-связывающего прoteins и некодирующие РНК к ее регуляторных последовательностей и / или вторичных структур ^5. Таким образом, малые молекулы, которые изменяют эти взаимодействия или вмешиваться в верховьях передачи сигнала сместится баланс, который регулирует белковый изобилие. Этот терапевтический подход имеет особое значение для человека патологий, для которых существуют доказательства того, показывающие, что болезнь-актуальных гены подвергаются пост-транскрипционной регуляции, которая, таким образом, представляет собой потенциальную мишень для фармакологического вмешательства. Таким образом, системы, позволяющие для скрининга модуляторов уровни мРНК "путем вмешательства с посттранскрипционных механизмов управления в формате высокой пропускной могут стать ценным инструментом в идентификации возможных методов лечения романа.

Описанный на основе клеток ген-репортер анализ позволяет для идентификации соединений, способных модулировать мРНК судьбу с помощью механизмов, зависящих от ее 3'-UTR. Он состоит из нескольких главная Сomponents (рисунок 1) и требует несколько предварительных шагов для проверки возможности анализа. Прежде всего, репортер конструкция предназначена для включения UTR 3'от интересующего гена. 3 'UTR слит с конца гена-репортера, например, люциферазы светлячка (фиг.1). Любые изменения в пост-транскрипционных механизмов контроля, осуществляемого с помощью вставленной 3 'UTR изменит стабильность и / или эффективность трансляции этого химерного транскрипта, что приводит к различным уровням люциферазы. Таким образом, изменения в активности люциферазы служить косвенной мерой пораженной после регуляции транскрипции интересующего гена. Второй компонент системы является контроль репортерной конструкцией, идентичной плазмида экспрессии, который выражает тот же ген-репортер, но не содержит каких-либо 3 'UTR. Два репортер плазмиды могут быть разработаны в лаборатории с использованием обычных протоколов молекулярной биологии и приобрести у коммерческих источников.

Выбор соответствующей клеточной линии является критическим для строительства анализа. Какие клеточная линия оптимальная модель зависит от многих факторов, начиная от клинических потребностей, таких как максимальное сходство с патологией просто практических вопросов, таких как характеристики доступности, transfectability и роста. Важно отметить, что до продолжения необходимо убедиться, что слияние 3 'UTR, чтобы гена-репортера имеет ожидаемый эффект на уровне химерного транскрипта. Отсутствие существенных различий в люциферазы сигнал от 3 'UTR-подшипника и управления репортера конструкций временно трансфицировали в выбранных клетках будет означать, что 3' UTR не работает в этой клеточной модели, запроса на поиск альтернативных единиц. Для формата высокой пропускной, 3'-UTR-подшипников и контроль конструкции репортера люциферазы должно быть стабильно интегрирована в выбранной клеточной линии. Использование стабильно интегрировать по трансфицированыклеточная линия, предпочтительно по нескольким причинам. Это позволит расширить выбор сотовой модели, включая труднодоступных трансфекции клеточных линий, уменьшить изменчивость в данных, возникающих в результате колебаний эффективности трансфекции, стихают затраты. Кроме того, при временной трансфекции клеток очень часто перегружена плазмиды ДНК, ведущем к насыщению системы. В этих условиях дальнейшее увеличение экспрессии репортера может быть сложным, что приводит к снижению чувствительности к потенциальным соединений повышающей регуляции.

Наконец, когда все компоненты пробы, установлены, очень важно, прежде чем перейти к формату высокой пропускной определить целесообразность анализа, то есть, если активность люциферазы может быть действительно вверх и вниз регулируется частности, с помощью вставляется 3 ' УТР. Лучшие контроль будет малые молекулы, представленные модулировать стабильность или возможности перевода мРНК с помощью UTR 3'интерес. Если наличие нихневозможно, суррогатные управления, имитирующие желаемого эффекта не принимаются. Это могут быть микроРНК или РНК-связывающие белки, известные проявляют свое действие посредством связывания с 3 'UTR интереса. Оценка таких элементов управления, прежде чем первичный скрининг показывает не только функциональные возможности разработанного теста, а также позволяет для оценки его динамический диапазон, чувствительность и производительность в формате высокой пропускной способности.

Использование описанного протокола мы провели скрининг в 2000-библиотеки соединений ^6. Нейробластома, наиболее распространенным экстракраниальных твердое опухоль младенчестве, был использован в качестве биологической модели и 3 'UTR онкогена MYCN, чьи амплификации сильно предсказывает неблагоприятный исход из нейробластомы, как гена-мишени ^7. Рисунок 2 описывает экспериментальную схему. Скрининг был разделен на три трассы с размером партии 27 пластин, обследованных на один проход. Партия 27 пластин включены библиотеки набора спектраПлиты n.1-n.8 + n.25 (первый запуск), N.9-n.16 + n.25 (второй заход) и n.16-n.24 + n.25 (третий ход), каждый плита показан в трех экземплярах. Таким образом, одна библиотека пластина (n.25) анализировали во всех трех прогонов делает возможным сравнение между перспективе. Протокол ниже описывает один проход 9 библиотеки пластин, испытанных в трех экземплярах.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: пропускная способность таких систем анализа зависит от доступного HTS лабораторного оборудования. Этот протокол облегчается EVO 200 робота Tecan Freedom, который выполняет наливных в формате 96-луночного. Миниатюризация в формат 384-а также возможно. Роботизированная система обработки жидкости расположен под колпаком с ламинарным потоком с целью поддержания асептических условий во всех экспериментальных этапов. Если нет жидкого обработки автоматизации не доступен, протокол может быть легко адаптирована к форме низкой пропускной способности.

Первичного скрининга

1. День 1: Подготовка и клеток семян

Примечание: семенной клетки с получением 80% слияния в момент тестировани активности люциферазы, т.е. 48 ч после посева.

1. Ресуспендируют трипсином CHP134-mycn3UTR клеток нейробластомы до концентрации 2 × 10 ⁵ клеток / мл в среде RPMI, содержащей 10% FBS и 1% L-глутамина. Для 27 пластин подготовки по крайней мере, 250 мл клеточной суспензии с учетом обработки жидкой, корыта мертвые объемы и повторяющихся операций пипетки. Вылейте клеточной суспензии в стерильной водохранилище и поместить его на робота столом.
2. Поместите 9 штрих-кодом белые плоским дном 96-луночных и коробку 200 мкл стерильной советы пипетки на роботе столом. Смешайте клеточной суспензии с помощью пипетки перед каждым шагом устроения, чтобы избежать клеток урегулирования под действием силы тяжести. Разлить 75 мкл клеток в каждую лунку пластины 9, чтобы получить конечную плотность 1,5 × 10 ⁴ клеток на лунку.
3. Покрытие пластин с крышками и оставить их за пределами инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить клеткам оседать на дно скважины. Это будет минимизировать краевые эффекты.
4. Повторите шаги 1,2 и 1,3 раза для того, чтобы подготовить общее количество 27 пластин.
5. Место пластин при 37 ° С и 5% СО ₂ и инкубируют в течение 24 ч.

2. День 2: Лечение клеток с помощью библиотечных соединений

ntent "> Примечание: Библиотека малая молекула Коллекция спектр состоит из 2000 соединений, расположенных в 8 строк и 10 столбцов в 25 96-луночные планшеты при концентрации 10 мМ в ДМСО Лунки на первых и последних столбцах пусты для контроля. . Соединение скрининговых исследований обычно проводится при 1-10 мкМ концентрации соединения ^8. Протокол скрининга, описанный здесь фиксирует 2 мкм, как в рабочей концентрации и 24 ч в качестве конечной анализ точки.

1. Оттепель 9 библиотеки соединений пластин при комнатной температуре.
2. Приготовьте два корыта стерильной PBS и PBS-0,5% ДМСО решений и разместить их на робота столом. Для каждой библиотеки пластины, подготовить и соответствующей метки один разбавления пластины - полипропилен U-дно 96-луночного планшета с рабочим объемом не менее 400 мл. Заполните каждую лунку колонок 2 до 11 разбавления пластин с 398 мкл стерильной PBS с использованием фиксированных советы жидкости проводника. Заполните столбцы 1 и 12 с 50 мкл стерильной PBSс 0,5% ДМСО, чтобы воспроизвести концентрацию транспортного средства в контрольных лунках (0,02%).
3. Поместите два библиотеки пластин, соответственно, помеченные разведения пластин, две коробки 50 мкл советы стерильной пипеткой и шесть ячеек пластин на робота столом. Раскройте клетки пластины.
4. Пипеткой 2 мкл 10 мМ маточного раствора из одной из двух пластин библиотеки в соответствующей разбавления пластины и хорошо перемешать. Это приведет к промежуточной концентрации соединений 50 мкМ. Используя тот же самый набор наконечников, обойтись 3 мкл разведении 50 мкМ в течение 3 со штрих белых 96-луночных планшетах с клетками. Это разбавление схема приводит к 2 мкМ, работающих концентрацию каждого тестируемого соединения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать ненужных манипуляций с подсказками, использовать полный набор 96 советов с самого начала, хотя библиотека пластины содержат только 80 соединений. Это возможно, поскольку первые и последние столбцы библиотеки пластин пусты.
5. Замените советы пипетки и повторите StEP 2,4 для второго библиотеки пластины.
6. Обложка клетки пластины и вернуть их в инкубатор на 24 ч.
7. Повторите шаги 2,3-2,6 еще два раза для остальных библиотеки пластин.

3. День 3: Выполните люциферазы

Примечание: Перед выполнением анализа люциферазы, можно мультиплексировать его с жизнеспособности клеток анализа, основанного на сокращение резазурин, чтобы получить индекс клеточной жизнеспособности из каждой лунки ^9. Мультиплексирование люциферазы и жизнеспособность анализа Анализы приводит к уменьшению сигнала люциферазы, что, однако, может быть проигнорирован, если эти клетки обеспечивают достаточно высокий уровень активности люциферазы. Активность люциферазы могут быть обнаружены с помощью различных коммерческих и домашние ^10,11 люциферазы реагентов со стабильным сигналом люминесцентного.

1. Равновесие водостойких реагент люциферазы выбора до комнатной температуры. Убедитесь, что объема достаточно для всех анализируемых пластин. Для 27 пластинынеобходимо будет с 170 мл реагент люциферазы с учетом обработки жидкой, корыта мертвый объем и повторяющихся операций пипетки. Вылейте люциферазы реагента в пласт и поместите его на робота столом.
2. Удалить 9 пластин с ячейками, из инкубатора, разместить их на робота стол, раскрыть и подождать, пока не доведены до комнатной температуры. Добавить 50 мкл реагента люциферазы в луночный планшет с пластиной. Между пластинами, ввести задержку, равную времени люминесценции считывания одной пластины. Это будет гарантировать, что все планшеты измеряли в течение временного интервала, равной от реагента того.
3. После 30-минутной инкубации, поместите первую пластину в фотометр и измерения люминесценции после краткого встряхивании шагу. Повторите эти действия для всех плит. Запись штрих-код каждой пластины и связать его с соответствующим файлом данных, чтобы избежать ошибок, связанных с большим количеством обрабатываемых пластин.
4. Повторите шаги 3.2-3.3 раза для остальных 18 пластин с ячейками.
5. Собирают оставшиеся реагент люциферазы и хранить его при температуре -20 ° С.

4. День 4: Анализ данных

1. Процесс экспериментальные данные с помощью нормализации всех образцов в среднем на-пластины управления обработанных носителем. Для каждой библиотеки соединения, вычислить среднее значение х и SD над трижды.
2. Выберите до регулирования и вниз для регулирования хиты, установив порог X ± к х SD, где средняя значение х и SD вычисляются по всем анализа обрабатываются ценностей, а К определяется константой.
3. Выберите произвольный пороговые <20% обработанных носителем управления, когда снижение люциферазы сигнала, скорее всего, связанных с соединением токсичности. Отбросив ниже этого порога хиты значительно снизить количество ложноположительных попаданий в борьбе с экранирования.
   Примечание: Вместо управления на основе нормализации, экспериментальные данные могут быть обработаны применения Z счет или его надежной аналоговый B Sсердцевина ^12. Кроме того, альтернативные статистические подходы для выбора хит доступны ^12.

5. Counter-скрининг

ПРИМЕЧАНИЕ: Соединения, указанные в основного экрана (с маркировкой «хиты») подтверждены и оценены специфики встречной проверки.

1. Cherry выбрать отдельные хиты из аликвоты, хранящихся в отдельных 2D со штрих труб и создавать новые "ударил пластины", сохраняя соответствующий макет. Не забудьте оставить свободные позиции для контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии эффективной системы снятия сливок, можно проверить и контроль и 3 'UTR-клеток, несущих параллельно при первичном скрининге. В этом случае, выбор конкретных соединений, оказывающих воздействие зависит только от вводимого 3 'UTR можно будет после того, как в первичном скрининге, устраняя необходимость в борьбе с экранирования. Тем не менее, параллельно скрининга в двух клеточных линий удвоит анализарасходы.
2. После протокола для первичного скрининга (раздел «День 1: Подготовка и клеток семян"), для каждого "ударил пластины" подготовить три 96-луночных каждого CHP134-mycn3UTR и CHP134-Ctrl стабильных клеток.
3. После протокола для первичного скрининга (раздел «День 2: Лечение клеток с библиотекой соединений"), используйте каждый удар пластину для лечения три CHP134-mycn3UTR и три CHP134-Ctrl пластин при 2 мкМ рабочей концентрации.
   Примечание: В то время как счетчик экраном описано здесь, выполняется в трех повторах в разовой дозе 2 мкМ, это может быть полезным, чтобы заменить стандартные повторов и протестировать попаданий в три концентрации в 10-кратных разведений в пределах от 2 мкМ до 20 нМ. Применяя этот подход позволит не только подтвердить данные основного экрана, но и получить предварительные данные доза-реакция на первичные хитов, сводя к минимуму ложных срабатываний. В этом случае, другой трубопровод Анализ должен быть Appliред обработки экспериментальных данных и убедитесь, хиты.
4. После протокола для первичного скрининга (раздел «День 3: Выполнить люциферазы"), измерить активность люциферазы во всех CHP134-mycn3UTR и CHP134-Ctrl пластин.
5. После протокола для первичного скрининга (раздел «День 4: Анализ данных"), нормализовать экспериментальные данные обработанных скважин в среднем на-пластины управления обработанных носителем и рассчитать среднее и SD над повторов. Для каждого тестируемого соединения, вычислить раз изменение активности люциферазы в CHP134-mycn3UTR против CHP134-Ctrl клеток. Выберите произвольного изменения раза CUT-офф> 1,5 и значение р-значения <0,01.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В описанных настроек анализа параметров, определяющим для попадания специфичности существенное изменение складка активности люциферазы в CHP134-mycn3UTR против CHP134-Ctrl клеток. При необходимости, можно также оценить соединения токсичность, выполняя одновременно в жизнеспособности клеток в сыворотке крови на себебранной соединения. Это может быть особенно полезно, если первичные хиты счетчик отобранных при анализе дозы. Для разовой дозы, наш опыт показывает сильную корреляцию с уменьшенной активности люциферазы с пониженной жизнеспособности клеток ^6. Поэтому, снижение активности люциферазы в клетках-мишенях, а также контрольные клетки можно рассматривать как индикатор соединения на токсичность испытанной концентрации.

Результаты

Использование описанного подхода мы провели скрининг с 2000-библиотеки соединений для потенциальных модуляторов посттранскрипционных контрольных механизмов, оказываемое через 3 'UTR гена MYCN. Рисунок 3 иллюстрирует результаты первичного скрининга на примере одной библио...

Обсуждение

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.

The identification of primary hits is based ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plate 96-well White	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)	PerkinElmer	6008190
100 ml disposable trough for reagents	Tecan	10 613 048
300 ml disposable robotic reservoir	VWR	PB12001301
Robot tips DITI 50 μl Sterile	Tecan	30038607
Robot tips DITI 200 μl Sterile	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum collection (compound library)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 robot	Tecan	N/A
Tecan F200 multiplate reader	Tecan	N/A