JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Аннотация

Воспаления печени в ответ на повреждение является весьма динамический процесс с участием проникновение различных подтипов лейкоцитов, включая моноциты, нейтрофилы, Т-клеток подмножеств, В-клетки, природные клетки-киллеры (NK) и NKT-клеток. Прижизненные микроскопия печени для контроля миграции иммунных клеток является очень сложным из-за высоких требований в отношении подготовки образцов и фиксацию, оптическое разрешение и долгосрочное выживание животных. Тем не менее, динамика воспалительных процессов, а также исследований клеточных взаимодействий может обеспечить критическую информацию, чтобы лучше понять инициации, прогрессирования и регресс воспалительного заболевания печени. Таким образом, весьма чувствительны и надежный метод был создан для изучения миграции и клетка-клетка-взаимодействия различных иммунных клеток в печени мышей в течение длительных периодов времени (около 6 ч) по прижизненной двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM) в сочетании с интенсивной терапии мониторинг. ЛОР "> метод, предусмотренный включает в себя тщательная подготовка и стабильную фиксацию печени с минимальной возмущения органа; долгосрочный прижизненный визуализации с использованием многоцветной многофотонную микроскопии практически без фотовыцветания или фототоксических эффектов в течение периода времени до 6 часов, что позволяет отслеживать конкретных лейкоцитов подмножеств и стабильных условий формирования из-за обширных мониторинга мыши жизненно важных параметров и стабилизации кровообращения, температуры и газообмена.

Для исследования лимфоцитов миграцию от воспаления печени CXCR6.gfp нокаут у мышей подвергали прижизненной визуализации печени под исходных условий и после острого и хронического повреждения печени, вызванного внутрибрюшинной инъекции (ов) четыреххлористого углерода (CCl 4).

CXCR6 является рецептор хемокинов экспрессируется на лимфоцитах, в основном на природные клетки-киллеры T (НКТ) -, естественных киллеров (NK) - и подмножеств Т-лимфоцитов, таких как CD4 Т-клеток, но также слизистой оболочки associально инвариантным (MAIT) Т-клетки 1. После миграционную картину и позиционирование CXCR6.gfp + иммунных клеток позволила детально заглянуть в их измененном поведении после повреждения печени и, следовательно, их возможного участия в прогрессировании заболевания.

Введение

Визуализация клеток и клеточных функций в целых органов или даже целых организмов был большой интерес для более чем 50 лет, в том числе практически во всех частях тела 2. Таким образом, некоторые ранние исследования уже используются прижизненной визуализации печени 3,4. Тем не менее, существуют некоторые ограничения в курсе относительно долгосрочного стабильного изображений с высоким разрешением ткани печени.

Из-за анатомическом положении печени в тесном контакте с мембраной и желудочно-кишечного тракта 5, наиболее распространенной проблемой для микроскопического прижизненной визуализации это движение за счет дыхания и, в меньшей степени, перистальтические из желудочно-кишечного тракта 6. По сравнению с другими твердыми органов, хирургия печени является чрезвычайно сложным. Из-за плотной структуры микрососудов, хирургических манипуляций может привести к массовым поражением геморрагических, нарушение микроциркуляции 7, а также активацию резидента яmmune клетки, такие как клетки Купфера 8. Таким образом, механическая фиксация ткани, опубликованы в другом месте 6,9, скорее всего, вмешиваться в прижизненной визуализации микроскопии.

В здоровой печени, 10-15% от общего объема крови находится в пределах сосудистой печени, и орган получает около 25% от общего сердечного выброса 10, что делает орган очень чувствительны к изменениям в обращении (например, колебания артериального давления ). Таким образом, сбои в печеночного кровотока, обусловленная, например, напряжение сдвига, смещения, травмы чрезмерной обработки тканей или централизованного обращения приведет к искусственным изменениям в лейкоцитарной миграционного поведения, нарушение оксигенации печени и поэтому дальнейшего повреждения печени, поражающими печень иммунный ответ, а также как сохранение органов и общего времени жизни животного.

Ранние микроскопические исследования были основаны на прижизненных эпифлуоресцентной мимикроскопия, но некоторые технические ограничения, такие как фото отбеливания и низкой глубины проникновения ограничить использование этого метода для долгосрочного изображений печени 4,11,12. С развитием МФ микроскопии в 1990-х годах, ограничения фото отбеливания или глубины проникновения в основном решена, так как это новый метод был технически способна выполнять исследования изображений практически во всех органах в реальных жизненных ситуациях 13-15. Тем не менее, основные нерешенные проблемы в отношении визуализации печени были: движения дыхания, автофлуоресценции ткани печени, обеспечения неизменном кровоток в печени синусоид и особенно стабильное изображение в течение длительного периода нескольких часов 16.

Хотя некоторые исследования имя функции и миграцию различных лейкоцитов в печени 17, например, NKT-клетки 18-20, Т-клетки 21,22, макрофаги печени 23,24 или нейтрофилы 25, долгосрочные многофотонное мicroscopy изображений еще не было успешно установлено, задача еще более сложная у животных с острой или хронической болезни печени в связи с существующей повреждения и поэтому более высокая чувствительность к дальнейшему повреждению 26. Однако мониторинг миграционное поведение и функцию клеток лейкоцитов в печени в режиме реального времени позволяет новый взгляд в их конкретной роли в гомеостазе заболевания печени и 27.

CXCR6 хемокинов рецептор экспрессируется на несколько подмножеств лимфоцитов, в том числе естественных киллеров (NK) клеток, НКТ-клеток и некоторых популяций Т-клеток 18,28. Предыдущие исследования на мышах показали, что CXCR6 и его родственный лиганд CXCL16 может управлять патрулирование НКТ-клеток на синусоиды печени во время гомеостаза. Следовательно, использование мышей CXCR6.gfp (несущий детонации-ин зеленого флуоресцентного белка [GFP] в локусе CXCR6) был описан исследовать миграцию лимфоцитов в различных органах, таких как мозг 29а также печень 18,20, показав увеличилось проникновение CXCR6.gfp клеток на воспаление.

С помощью способа, представленной в данном исследовании можно было выполнить следующие процессы в течение длительного периода времени при стабилизированных условиях. Прижизненный процедура, основанная многофотонное разрешается изображений, который был хорошо воспроизводимым с минимальным возмущением животного и органа; оптимизирована для долгосрочного выживания животного расширенного мониторинга с последующим тщательным контролем дыхания и кровообращения; и очень гибкий и легко принять и для других паренхиматозных органах, таких как почки или селезенки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: эксперименты были проведены в соответствии с немецким законодательством, регулирующим исследования на животных Вслед за «Руководство по уходу и использованию лабораторных животных" (NIH публикации, 8-е издание, 2011) и Директива 2010/63 / ЕС по защите животных используется для научных целей (Официальный журнал Европейского Союза, 2010). Официальное разрешение было предоставлено из государственного ухода за животными и офисного использования (LANUV Северный Рейн-Вестфалия, Гельзенкирхен, Германия).

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, которые могут быть исключены на короткий срок томографии (например, мгновенные снимки, 3-D стеки или также короткая продолжительность покадровой микроскопии), отмечены звездочкой (*), чтобы уменьшить время на подготовку и упростить хирургическое протокол. Изображений также может быть выполнена без существенного контроля и управления циркуляции при необходимости, однако, продолжительность жизни будет значительно снижена.

1. Микроскоп Настройка и перед операцией Подготовка (5-10 мильп)

  1. Переключить система на (микроскоп, мощность лаборатории, лазерной, грелку, климатической камере, веб-камеры, устройства шприц насоса, респиратор).
  2. Подключите O 2 питания к изофлурановой пара и установить изофлурановой уровень в 1,5% по объему (v / v), подключение к небольшой животных респиратор.
    1. За короткий срок визуализации, поддерживать анестезию с помощью изофлурана только после первоначального индукции IP анестезии (см шаг 2,2). Затем с помощью 2% по объему (V / V) изофлураном и сохранить время формирования изображения ниже 2 ч, чтобы гарантировать стабильную микроциркуляции печени.
  3. Набор дыхание до 120-140 дыхательных циклов / мин с объемом 150-200 мкл.
  4. Настройка этап мыши агарозы. Подготовьте 100 мл 3% (вес / объем) агарозы, заливки его в чашку (приблизительно 10 см х 15 см основание) под углом 40 °.
  5. Настройка хирургическое рабочее пространство сбора необходимых приборов. Для предотвращения микробной инфекции, дезинфекции инструментов, используя 1% -ный раствор Sekusept Forte S (9,9% вес / об), Глутарал 9,8% вес / об, Формальдегид в течение 5 мин до начала эксперимента (фиг.1А).
  6. Получить остальные компоненты: дезинфицирующее кожи (например, 10% -ный раствор повидона йода), печени (этап стеки и мост), раствора агарозы (3% (вес / объем) в PBS), шприцевой насос с 5% (вес / объем) раствора глюкозы (G-5), шприцевой насос с анестезирующего раствора I (кетамин 0,1 мг / мл, Ксилазин 0,5 мг / мл, фентанил 5 мкг / мл), ватные тампоны, н-бутил-2-Cyanoacrylat и 1x PBS. Положите в агарозном этап блюдо в инкубационной камере для нагрева.

2. трахеотомия (10-15 мин)

  1. Используйте C57BL / 6 мышей от в доме разведения весом 25-28 г. Дом мышей под конкретного патогена условиях в соответствии с руководящими принципами FELASA, в температуры и влажности окружающей среды под контролем с 12 ч света / 12 ч темноты. Разрешить животным свободный доступ к стандартной мыши диеты (Sniff стандартную диету грызунов) и воды вволю.
  2. Обезболить мыши, инициализацииционного внутрибрюшинно (IP) инъекции 250 мкл раствора анестетика II (кетамин 0,1 мг / мл, Ксилазин 1 мг / мл, бупренорфин 10 мкг / мл).
    1. * Для содержания в течение прижизненной визуализации, постоянно вводить обезболивающий раствор I путем непрерывной инъекции IP (кетамин 0,1 мг / мл, Ксилазин 0,5 мг / мл, фентанил 5 мкг / мл) с использованием устройства типа шприцевого насоса при скорости потока 0,2 мл / ч в Сочетание с ингаляционного изофлуран 0,5% по объему (об / об).
    2. Проверьте рефлексы после 5 мин (например, щепотка ног колодки щипцами), дезинфекции кожи для трахеотомии, начать подготовку, если мышь находится в хирургическом толерантного государства анестезии.
    3. Применить глаз защитный крем (например, Декспантенол 50 мг / г), чтобы предотвратить роговицы от высыхания (рис 1б).
  3. Зафиксируйте курсор по подготовке таблицы подвергая брюшной стороне с помощью клейкой ленты для конечностей; мягко затягивать шею, зафиксировать в этом положении., например, с помощью резиновой ленты подключили тО резцов.
    1. Лечить кожу и мех с использованием повидон раствор йода, путем применения дезинфицирующего средства с помощью ватного тампона.
  4. Выполните первоначальную разрез кожи (0,5-1 см длиной) прямо под подбородком (рис 1C)
    1. Осторожно рассекают соединительной ткани между слюнных желез (рис 1D).
    2. Осторожно разорвать открытую мышечную трубку, окружающую трахею (рис 1E, F).
  5. Поместите хирургическое нить под трахеи для последующего крепления вентиляционной трубки (рис 1G).
    1. Открыть трахеи с микро-ножницы между хрящевых колец, выполняющих Т-образный разрез (рис 1H)
  6. Поместите вентиляционную трубку в трахею через разрез (~ 0,5 см). Чтобы подтолкнуть трубку вперед, захватить хвостовой конец с небольшими анатомических щипцов и аккуратно продвигать трубку в трахею (рисунок 1I)
  7. Зафиксируйте трубу с хирургической нити (например, 5-0) с резьбой помещается в шаге 2,5 завязывая узел вокруг трубы внутри трахеи; выполняют вторую черепной фиксацию трубы на кожу, чтобы избежать случайного перебазирование (фиг 1J, К).
  8. Упрощенный уплотнение с клеем ткани (например, н-бутил-2-Cyanoacrylat) (рис 1 л).
  9. Зафиксируйте трубку в головку с помощью клейкой ленты.

3. Laparatomy (15-20 мин)

  1. Поместите курсор на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение. Бритье живот, осторожно удалите волосы с поверхности кожи. Лечить бритая кожа и мех с помощью решения повидон йода.
  2. Выполните мелкой шкуркой сократить ниже грудины, используя хирургические ножницы (рис 2а). Продлить разрез в поперечном направлении ниже ребер с обеих сторон, прижигание все видимые кровеносные сосуды, чтобы предотвратить кровотечение.
  3. Тщательно выполнить небольшой надрез на белой линии ниже грудины, открывая брюшины (рис 2б). Продлить разрез с обеих сторон, используя cauterizвания, чтобы предотвратить кровотечение (рис 2С, D).
  4. Поместите курсор в агарозном стадии блюдо (рис 2Е). Поместите штабеля соответствующей высоте на обеих сторонах мыши (обычно 12-14) покровные стекла (фиг 2f).
  5. Поместите дыхания триггерный датчик под ними верхней части спины, чтобы синхронизировать микроскоп с дыханием. Активируйте спусковой механизм (рис 2G).
  6. Поместите хирургической нити (5-0) через грудины, чтобы убрать ребра (рис 2i).
  7. Аккуратно вырежьте связки, соединяющей печени и диафрагмы (серповидной связки), а также печени и желудочно-кишечного тракта с помощью изогнутых хирургические ножницы. Отрежьте серповидные связки до аорты (рис 2J).

4. Пример установки (10-15 мин)

  1. Поместите курсор на правой стороне под углом 45 ° для легкого доступа к большим доли печени.
  2. Добавить постановка мост ниже ребер, охватывающих брюшной полостиполости. Производство мост с помощью стандартного покровного стекла с помощью клейкой ленты покрытия для покрытия острых кромок (рис 2K).
  3. Поместите большой доли печени на сцене. Тщательно скольжения двойной шаровой стилуса зонда или мягкий шпатель ниже печени и удерживайте верхнюю часть органа, используя влажную ватным тампоном или влажной ткани. Поднимите лепесток на слайд и нежный сопротивление. Лоб может быть согнуты или сложить. Обеспечить дополнительную заботу, чтобы только нежным манипуляции печени (рис 2L).
  4. Поместите боковая, поддерживающие ставки, например, сваи малого скользит крышку (20 мм х 20 мм), примерно такого же высоте доли печени рядом с ним, чтобы поддержать покровное.
  5. Поместите большой покровное (24 мм х 50 мм) на доли печени. Убедитесь, что крышка скольжения ориентирована максимально горизонтально (рис 2М).
    ПРИМЕЧАНИЕ: скольжения Крышка должна быть в контакте с тканью без сжимая его. Проверьте наличие видимых признаков нарушения кровотока (белый ткани). Если microcircавляет нарушается, добавить дальнейшей поддержки ставки.
  6. * Место два независимых интраперитональные катетеры (рис 2N) для долгосрочного анестезии и G-5 приложений. Установка катетера в поперечном направлении в нижней части живота рядом задних конечностей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: внутрибрюшинного катетеры могут быть самодельные путем подключения 27 G иглы с гибкой трубкой силикона (Рисунок 3).
  7. * Закрепиться иглы с петлей 5-0 хирургической нити на кожу, чтобы избежать случайного перемещения.
  8. * Прикрепить шприца с анестезией раствором я катетера 1, определите скорость потока до 0,2 мл / ч; приложить шприцевой насос с G-5 катетера 2, установите скорость потока до 0,1 мл / ч.

5. Контроль мыши

  1. * Место ЭКГ электродов в передние и задние конечности (рис 4А).
  2. * Прикрепите трубку истечения СО 2 датчика уровня.
  3. Добавить внешнего датчика температуры, подключенных к тепловым панели (рис 4C).

6. Вложение и тканей Фиксация (5-10 мин)

  1. Подготовьте 100 мл 3% (вес / объем) агарозы в 1X PBS. Код для вставки печень, когда температура в 41 ° С, используя шприц 5 мл и 18 G иглы (рис 5а).
  2. Налейте оставшееся агарозы на покровное и вокруг мыши (фиг.5В, С). Подождите, пока агарозном полностью клейстеризованный.
  3. Удалите излишки агарозы с использованием шпателя Heidemann, подготовка достаточно viewfield большой, чтобы сканировать подготовленный доли печени (рис 5D, E).

7. изображений

  1. Трансфер мышь в микроскоп климатической камере.
  2. Добавить 50-100 мл 1x PBS (предварительно нагретый на 37 ° С).
  3. Обложка образца блюдо, чтобы предотвратить испарение (рис 5F).
  4. * Уменьшение вдыхании изофлуран до 0,5% по объему (об / об).
  5. * Начать мониторинг программного обеспечения, запись ЭКГ, частоту сердечных сокращений и выдоха CO 2.
  6. Начните изображений: открыть лаSER жалюзи, определить вид областях, представляющих интерес, определить верхнюю и нижнюю границу для Z-стеки, и начните запись промежутка времени. Отрегулируйте Z-стеки, если необходимо скорректировать Z-дрейф (напр., В связи с изменениями артериального давления и колебания температуры, рис (5G).
    Примечание: после завершения периода формирования изображения, или если обращение или анестезии животных становится нестабильным, пожертвовать мышей путем смещени шейных позвонков (без пробуждения от анестезии).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для проверки нашего прижизненный подход TPLSM, мы подвергли GFP / + мышей CXCR6 для прижизненной визуализации TPLSM. Мышей либо лечить качестве исходных управления или подвергают одной внутрибрюшинной инъекции четыреххлористого углерода (CCl 4), чтобы вызвать повреждение печени остры...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Целью нашего исследования было разработать максимально стандартизированные, стабильные и воспроизводимые метод прижизненной TPLSM визуализации печени. Прижизненные изображения в целом дал ценные сведения сотовой поведения в реальных условиях жизни после наведения и взаимодействия р...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors disclose no conflict of interests.

Благодарности

The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetics
BuprenorphineEssex Pharma997.00.00Analgeticum, 0.1 mg/kg
FentanylRotex Medicacharge: 30819
Fluovac anesthesia systemHarvard Apparatus34-1030
Glucose 5%Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiserEickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
Isotonic (0.9%) NaCl solutionDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamin 10%cevaCharge: 36217/09
Xylazin 2%medistarCharge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml SyringeBD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flaskSchott Duran21 226 36
25 ml Beaker 2xSchott Duran50-1150
2 ml syringeBD Plastipak
4-0 Vicryl sutureEthiconV7980
Agarosecommercially available
Bepanthen Eye and Nose ointmentBayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery KitFine Science Tools Inc.18010-00
Cotton Gauze swabsFuhrmann GmbH32014
Cover Slip 24x50 mmROTH1871
Durapore silk tape3M1538-1
Feather disposable scalpelFeather02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm IDSmiths medical800/100/200
HistoacrylBraun10500525x 0.5 ml
LeukoplastBSN Medical Inc.
Microscope SlidesROTH1879
Poly-Alcohol Haut…farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
Sterican needle 18 G x 1B. Braun304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1B. Braun4657705
Tissue papercommercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PLGatz0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2Storz&KleinS-01134
Dumont No.7 forcepsFine Science Tools Inc.91197-00
Graefe forceps curved x1Fine Science Tools Inc.11151-10
Graefe forceps straight x2Fine Science Tools Inc.11050-10
Heidemann spatula HD2Stoma2030.00
Needle holder MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
ScissorFine Science Tools Inc.14074-11
Semken forcepsFine Science Tools Inc.11008-13
Small surgical scissors curvedFine Science Tools Inc.14029-10
Small surgical scissors straightFine Science Tools Inc.14028-10
Standard pattern forcepsFine Science Tools Inc.11000-12
Vannas spring scissorsFine Science Tools Inc.15000-08
Equipment
ECG Trigger UnitRapid Biomedical3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide AnalyzerAD Instruments
Minivent Typ 845Harvard Apparatus73-0043
Multiphoton microscope Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorderAD InstrumentsPL3508
Temperature controlled heating padSygonix26857617
Temperature sensorcomercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&BoxLife Imaging Services

Ссылки

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955(1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693(2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

97TPLSM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены