Electrospun Nanofiber Строительные леса с градациями в волокне организации

Резюме

Здесь мы приводим протокол для изготовления electrospun нановолокна подмости с упорядоченных организации волокон и исследовать свои приложения в регулировании клеточной морфологии / ориентацию. Градиенты в отношении физических и химических свойств нановолокон каркасов предлагают широкий спектр применений в области биомедицины.

Аннотация

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Введение

Нановолокна популярная утилита для тканевой инженерии из-за их способности имитировать внеклеточный матрикс в своей структуре и относительный размер ^1. Тем не менее, некоторые нативной ткани интерфейсы, такие как вставки сайта сухожилия-к-кости, содержат коллагеновые волокна, которые обладают переменной организационную структуру, которая увеличивается в направлении выравнивания сухожилия и уменьшает на месте кости ^2-5. Таким образом, для эффективной регенерации ткани существует необходимость в изготовлении каркас, который может эффективно имитировать эту структурную градиент.

Ранее, было проведено исследование на постепенных изменений в составе волокна, в частности, содержание минеральных веществ ^6. Однако, воссоздавая структурный компонент соединительной ткани остается в значительной степени неизученными. В более раннем исследовании рассмотрены морфологические градиенты по изучению влияния поверхности кремнезема плотности частиц на пролиферацию крысы свода черепа остеобластов и нашел INVERSE отношения между плотностью частиц кремнезема и пролиферации клеток ^7. Но морфологические изменения, которые опосредованной пролиферации клеток в предыдущей работе в основном были связаны с шероховатостью поверхности не имея возможности в имитации волокон организационных изменений ^7,8. Одно недавнее исследование пытались изготовить каркас, который имитировал уникальные ориентации коллагеновых волокон при использовании нового коллектора для электропрядения ^9. Хотя это исследование удалось получить эшафот и выровненных и случайных волокон, она не смогла, чтобы имитировать постепенные изменения выставлены в родных тканей. Кроме того, в производстве отдельных компонентов, с немедленным переходом от выравнивается по случайной ориентацией, биомеханические свойства этого эшафота значительно снизилась. Ни одна из предыдущих работ не был в состоянии произвести соответствующие нановолокна подмости с непрерывными градации ориентацию волокон из выровнены и случайных. Наше недавнее исследование показало, успешное воссоздание нановолокон лесовс градациями в организации волокон, которые потенциально могут имитировать родную организацию коллагена при вставке ¹⁰ сухожилия к костям. Эта работа направлена ​​представить протоколы, используемые для производства нановолокон лесов со структурой, напоминающей, что организации волокон в родной интерфейс ткани сухожилия к костям.

Градиент нановолокон структуры потенциально могут иметь далеко идущие применений в различных областях. Мы сосредоточились на приложениях к тканевой инженерии для введения сайте сухожилие к костям, объединив наши строительные леса с жировой стволовых клеток (ADSCs), которые уже используются для регенерации тканей на различных подложках ^11-14. Кроме того, ADSCs очень похожи по своей природе стволовых клеток костного мозга в плане мультипотентность и их ресурс имеется в изобилии, которые могут быть собраны с помощью простой процедуры липосакции ^15,16. Сеялки эти клетки упорядоченных нановолокон лесов еще больше повышает их ТИСв суд инженерных приложений, позволяя для контролируемого распределения клеток, которые потенциально могут дифференцироваться в различные ткани. В дополнение к посева стволовых клеток, нановолокна могут быть инкапсулированы с сигнальными молекулами для регулирования клеточного ответа. Соединительная nanoencapsulation с организационной градиента этих лесов позволяет для изучения клеточного поведения или возможных имплантатов конструкций и покрытий. Инкапсуляция функциональных молекул, таких как костного морфогенетического белка 2 (Bmp2), который, как было показано, чтобы вызвать дифференцировки остеобластов ^15,16, может дополнительно усиливать тканевой инженерии этих каркасов ^10.

протокол

1. Приготовление раствора

1. Готовят раствор поли (ε-капролактона) (PCL) (М _ш = 80000 г / моль) при приблизительной концентрации 100 мг / мл. Растворить PCL в смеси дихлорметана (DCM) и N, N-dimethlyformamide (ДМФ) в соотношении 4: 1 (об / об) с концентрацией 10% (вес / объем).
2. Поместите раствор в стеклянную трубку 20 мл для смешивания. Поместите стеклянную трубку в ультразвуковой очиститель для 30 минут, или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

2. Устройство Подготовка

1. Добавьте приготовленный раствор PCL в 5 мл шприц с 21 калибра тупой иглой.
2. Поместите шприцевой насос в вертикальном положении электроформования, в соответствии с фиг.1.
3. Использование нержавеющей стали, зазор коллектор с открытым пространством 2 см х 5 см для выровненного волокно в качестве подложки. Поместите коллекционеру 12 см от кончика иглы.
4. Подключите постоянного тока (DC) высокого напряжения киглы и обосновать коллектор. Убедитесь, что коллектор по отдельности заземлены без контакта с другого лабораторного оборудования.

3. электропрядения

1. Набор шприцевой насос с 1,50 мл / ч, до капелек, образующих на кончике иглы сразу же заменить, когда удалены. Затем устанавливается скорость потока 0,50 мл / ч.
2. Поверните оператора напряжение до 12 кВ.
3. Electrospin пока одноосно выровненных волокон полностью не покрыть разрыв на коллекторе.
4. Наносить клей на краях небольшой стеклянной пластины и передачи волокон из щели коллектора к стеклянной пластины. Поместите стеклянную пластину на верхней части куска алюминиевой фольги, которая имеет тот же размер, стекла и заземлен.
5. Расположите второй шприц коллектор в соответствии с рисунком 3.
6. Прикрепите пластиковую маску на втором шприцевой насос, и расположить его на 2 мм выше коллектора.
7. Добавить кумарина 6 в 1% (вес / вес) в растворе, PCL, если NaNoencapsulation является desired- и перемешать до раствор не станет прозрачным.
8. Загрузите PCL или PCL / кумарин 6 решение в иглу 5 мл с тупым 21 иглы. Установка вертикальной насос 0,50 мл / ч, и по горизонтали, чтобы вытащить на 9 мл / ч или при приблизительной скорости 1 мм / мин.
9. Electrospin до маски переместился почти полностью от коллектора, но с краевой области все еще под маской.

4. Волоконно Характеристика

1. Образцы с двухсторонней проводящей ленты на металлической шпильке и пальто с платиной в течение 40 сек с помощью распылением для нанесения покрытий на 40 мА.
   1. Проверьте волокон через сканирующего электронного микроскопа (SEM) в соответствии с нашими предыдущими исследованиями ^17,18.
   2. Собирать изображения при ускоряющем напряжении 15 кВ.
2. Выполнение быстрого преобразования Фурье (FFT) анализ на отдельном образце волокна для измерения выравнивания волокна. Подробная информация о измерения выравнивания волокна посредством БПФ можете обратиться то предыдущих исследованиях ^19,20.

5. Посев стволовых клеток.

1. Стерилизация образцов волокна путем выдержки в 70% -ном растворе этанола в течение 2 часов. Затем промыть волокна с дистиллированной водой, чтобы удалить любые примеси.
2. Получение человека ADSCs и культуры клеток в 25 см ² колбе при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха / 5% CO _2. Изменение клеточную культуральную среду через день ^10.
3. Trypsinize клетки и подсчитать количество клеток. В частности, удалить все культуральную среду из культуры клеток колбы и промыть клетки с фосфатным буферным раствором (PBS) дважды. Затем добавить 1 м ^л 0,25% трипсина-ЭДТА (предварительно теплой в водяной бане до 37 ° C), чтобы покрыть клеточный монослой и инкубировать колбы в клеточной культуре инкубаторе в течение 2-3 минут. Добавить 4 мл культуральной среды и промыть все клетки с поверхности с помощью пипетки среды по всей поверхности. Центрифуга клеточной суспензии и повторно-дисперсных йОсадок клеток адрес в культуральной среде. Граф клеток через гемацитометре. Семя около 1 × 10 ⁴ клеток на нановолокна эшафот, помещенной в 35 мм -Культура блюдо и инкубировать в течение 3 и 7 дней.
4. Пятно клетки с помощью флуоресцеина диацетата (5 мг / мл в ацетоне) (FDA), затем изображение образцов с помощью флуоресцентного микроскопа. В частности, добавление 100 мкл раствора FDA в чашку с культурой и инкубируют в течение 30 мин. Вымойте клеток с PBS три раза, прежде чем флуоресцентных изображений. Анализ клеточной ориентации на индивидуальные программы мат-лаборатории на основе наших предыдущих исследований ^10.

Результаты

Используя этот протокол был сформирован волокнистый мат с организационной градиента. Рисунок 3 показывает изображения SEM, принятые в разных местах на нановолокна эшафот. Качественно, может быть определено, что существует последовательность из одноосно ориентированных волок?...

Обсуждение

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2