Окраска насекомых для поведенческих Анализы: Спаривание поведение анестезированной<em&gt; Drosophila</em

Резюме

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO₂ anaesthesia.

Аннотация

Спаривание эксперименты с использованием дрозофилы внесли большой вклад в понимание полового отбора и поведения. Эксперименты часто требуют простые, удобные и дешевые методы различие между лицами в суде. Стандартный метод это CO ₂ анестезия, а затем маркировки или крыло отсечения каждый муху. Тем не менее, это инвазивные и было показано, что влияет на поведение. Другие методы использовали окраску определить мух. Данная статья представляет собой простой и неинвазивный метод маркирования дрозофилы, что позволяет им быть индивидуально определены в экспериментах, используя пищевые красители. Этот метод используется в исследованиях, где двое мужчин соревнуются спариваться с самкой. Крашение возможность быстрой и простой идентификации. Был, однако, некоторое различие в прочности окраски всех трех тестируемых видов. Данные, показывающие, краситель имеет меньшее влияние на поведение спаривания, чем CO ₂ в Drosophila меланоGaster. Влияние CO ₂ анестезии показано зависит от вида дрозофилы, с D. pseudoobscura и D. subobscura не показывая никакого влияния, в то время как D. MELANOGASTER мужчины сократили спаривания успех. Способ краситель представлены применим к широкому кругу опытных образцов.

Введение

За последние несколько десятилетий растет интерес в том, как половой отбор и конкуренция между самцами воздействия на эволюцию ^1,2. Эксперименты по брачного поведения сыграли важную роль в разработке и тестировании теории полового отбора ^3,4. В частности, исследования с использованием видов рода Drosophila, в значительной степени способствовало пониманию полового отбора и поведения. Тем не менее, важно, чтобы исследовать ли, обычно используемые методы могут искусственно исказить результаты стандартных экспериментов сопрягаемых ^5,6.

Обезболивание часто используется для обработки и идентификации в экспериментах ^7. Например, мухи обычно собирают до спаривания, или сортируются в генотипов или экспериментальных процедур с использованием диоксида углерода (CO ₂₎ анестетик. В экспериментах, где два или более лиц следует отличать, это обычная практика обезболить ФЗх годов и клип часть крыла выключения для идентификации каждого индивидуального или группе лечения ^5,8. Очень важно, однако, чтобы понять, как CO ₂ это лечение повлияет на поведение. Эффект CO ₂ наркозом был рассмотрен в дрозофилы, в котором мужчины подвержены CO ₂ значительно дольше, чтобы спариваться и в целом имели более низкий успех спаривания, чем не-наркоз мужчин и мужчин анестезии с помощью воздействия холода ^5. Этот эффект наблюдался как при анестезии был применен в день эксперимента, и, когда мухи были даны один день для восстановления. Тем не менее, это исследование было ограничено лишь изучающих РКИ, Мужчина один был представлен каждой самки ^5. Более реалистичный сценарий для женщины сталкиваются с несколько самцов ^9,10, что позволяет конкуренцию между мужчинами, которые могли бы позволить обнаружение более тонких потерь мужского фитнеса из-за анестезии. Использование CO ₂ анестезии такжеEN приводит к снижению плодовитости и продолжительности жизни взрослого D. MELANOGASTER, когда они подвергаются вскоре после вылупления, как это часто бывает при сборе девственницей летит ^11.

Альтернативой CO ₂ анестезии, чтобы отметить мух, подавая им еду, окрашенную краской ^{4,6,10,12,13.} Этот краситель проникает в кишечник лету и виден через брюшную полость, позволяя цветные мухи следует отличать от бесцветных мух, или от мух, меченных другого цвета. Методы отличаются тем, как это может быть применено: добавляется непосредственно в пищу ^12, с помощью окрашенных дополнительного дрожжей пасты ⁶ или с помощью воздействия к новому окрашенные пищевой подложки ^13. Эти маркировки методов, кажется, не оказывают никакого влияния на производительность спаривания ^4,6. Тем не менее, документ непосредственно для изучения влияния одного и того же пищевого красителя на взрослых D. MELANOGASTER нашли сильное снижение средней продолжительности жизни ^14. Предыдущая работа также была сосредоточена ALMOST полностью на D. MELANOGASTER, как с точки зрения воздействия СО ₂ анестезии ^5,11 и пищевой краситель ¹⁴ методов. В настоящее время существует очень мало информации о том, как CO ₂ анестезия или использование кишечной окраски влияет на брачное поведение другого дрозофилы.

Следующее исследование оценивает эффект CO ₂ анестезией на брачное поведение трех видов дрозофил (дрозофилы, Д. pseudoobscura и D. subobscura). Эффект сбора мух на CO ₂ был рассмотрен в одно- и двух мужчин испытаний спаривания. Эффект CO ₂ Также было обнаружено, варьировать в D. MELANOGASTER ⁵ и так разные периоды времени ожидания между воздействием CO ₂ и спаривания были протестированы. Альтернативный способ анестезии и крыла отсечения маркировка: использование пищевых красителей для окрашивания мух также оценивается.

протокол

1. Подготовка Fly продовольствия с пищевой краситель

1. Возьмем стандартный Drosophila флакон с примерно 20 мл пищи в нижней (рис 1). Используйте следующий рецепт для пищевой смеси с использованием 1 л кипящей воды 10 г агара, 85 г декстрозы, 60 г кукурузной муки, 40 г дрожжей, и перемешивают в течение 5 мин кипящей. Добавить 25 мл 10% nipagen Как только смесь охлаждают до 75 ° С.
2. После еды остывает и затвердевает добавить две капли (около 0,5 - 1 мл) голубого пищевого красителя к вершине пищевой и распространяются по всей поверхности флакона (Рисунок 1). Используйте другой краситель, если предпочтительнее.
3. Оставьте пищу в течение двух дней в холодильнике, так что краситель поглощается в верхнем слое пищи; это позволяет избежать излишней влаги повреждения мух в период созревания. Добавить кусочек папиросной бумаги, если избыточная влага еще проблема, чтобы уничтожить лишние влагу и впоследствииудалить его.
4. Передача летит на пищу либо индивидуально, либо в группах.
   Примечание: Мухи получите окрашивание кишечной течение 1 дня размещения на продукты питания. Кроме того, полностью зрелые мух на окрашенных продуктов питания до эксперимента (увеличение смертности в период созревания не наблюдалось от воздействия пищевого красителя).
5. Убедитесь, что окрашенных мухи могут быть легко отличить от не-окрашенных мух. Если они не могут быть отделены, повторите шаги 1,1 - 1,4 с использованием либо более высокую концентрацию красителя или другой краситель.

2. Два мужчины Спаривание испытаний с использованием пищевой краситель

1. Для получения потомства, настроить несколько флаконов, содержащих пары женских и мужских мух (для небольших групп самцов и самок также подходят, хотя заботиться, чтобы избежать давки личинок). Разрешить самки откладывают яйца и перейти мух новых флаконах каждые 5 - 7 дней. Хранить флаконов при подходящей температуре для вида интереса (22 ° C Fили D. pseudoobscura и D. subobscura и 25 ° C для D. MELANOGASTER).
2. Перед сбором экспериментальных мухи удалить все мухи от сбора флаконов в установленное время, прежде чем собирать мужчин и женщин, чтобы гарантировать, что они будут девственниц (дрозофилы - 6 ч при 25 ° С, D. pseudoobscura - 18 ч при 22 ° С, и D. subobscura - 24 ч при 22 ° С).
   Примечание: Если мухи не девственница эта воля смещения их поведение в брачных испытаний ^15.
   1. Магазин и зрелый мужчина индивидуально в стандартных 75 х 20 мм пластиковые пробирки (содержащие ~ 20 мл пищи). Это позволяет избежать негативного воздействия на мужской брачного поведения и пригодности видел у некоторых видов, когда мужчины находятся в группах ^16.
   2. Защиту половина самцов до требуемого лечения (СО ₂ анестезии в данном случае). Используйте коврик CO ₂ или нажмите, чтобы выставить мух в течение необходимого времени. Магазин половина МалES в каждом лечения на цветном пищевых продуктов, пока происходит спаривание. Это сделает их визуально различимы во время брачного испытаний.
   3. Для передачи мухи использовать аспиратор ^17. На каждом флаконе для идентификации как лечение и состояние цвет самца. Здесь используют четыре процедуры (анестезия, неокрашенные = G-NC, анестезия, цветные = GC, без анестезии, без цвета, NG-NC, и без анестезии, цветные, NG-C).
3. Трансфер вновь появились женщины в свежие пробирки пищевых созреть как группы 10.
4. Разрешить мух, чтобы созреть для спаривания возраста (дрозофилы - 3 дней, Д. pseudoobscura - 5 дней, Д. subobscura - 7 дней ¹⁸ магазин летит при подходящей температуре для вида изучаются (например, 22 ° C для D. . pseudoobscura и D. subobscura и 25 ° С в течение дрозофилы).
5. Перемещение самок в отдельные флаконы (продолжениеAining ~ 20 мл пищи) 1 день до суда спаривания для адаптации к ответной флаконе. Этикетка эти флаконы так, чтобы пузырьки могут быть дифференцированы. Будьте осторожны, чтобы ослепить эксперимент с использованием нейтрального маркировки (например, 1 - 150), так что не возможно угадать личность мух в любом флаконе.
   Примечание: человек, который ставит мух в каждом флаконе должен знать личность мух помещают в каждую пробирку, как они будут, обратите внимание, какое лечение окрашивали. Тем не менее, наблюдатель, который следит за спаривание не должен знать свою идентичность. Чтобы сделать это, по крайней мере два экспериментаторы будут необходимы, одно для настройки и одну наблюдать.
6. Начните брачные испытания между 10 - 12 утра, или в то время, которое совпадает с свет, идущий на в цикле свет / темнота мухи подвергаются ("Рассвет" для мух). Добавьте две мужские мух для каждого спаривания флакона (содержащего одной женщины лету) с помощью аспиратора. Убедитесь, что два мужчины из разных методов лечения (анестезия или), и что надо кишечника окрашивание, чтобы сделать возможным дифференцировать их друг от друга, и записку, в которой мужчина окрашивается.
7. Если совокупление происходит, отражающий состояние мужчины, который соединяется (либо цветные или не - цветной). Если испытания длятся 2 часа, предположим, женщина не будет спариваться.
   Примечание: 2 ч подходит для этих видов, но и другие Drosophila может потребоваться больше или меньше времени.

3. Мужчина один Спаривание испытания

1. Для одиноких мужчин испытаний, повторите протокол 2 с двумя изменениями:
   1. На этапе 2.3 не держать мужчин на окрашенной пищей.
   2. На этапе 2.7, добавить только один мужчина в каждый флакон.
2. На этапе 2.8, записывать время муха добавить во флакон с, время должно быть записано начинается спаривание и время спаривания завершена. Из этих значений, рассчитать спаривания успеха, задержки и длительности.

Анализ 4. Данные

1. Используйте подходящий пакет статистики для анализис. Если данные являются нормальными и только две процедуры, используйте т-тесты или эквивалентные обобщенной линейной модели (GLM). Для двух мужчин экспериментов, использовать биномиальных испытаний или биномиальное GLM, которые доступны в любой базовый пакет статистики.
   Примечание: На примере данных, все анализы были проведены в R версии 3.0.3 ^19.
2. Проверьте данные задержки спаривания и продолжительность спаривания нормальности, путем построения частотных гистограмм задержки и длительности для каждой обработки ^20, и с помощью теста на нормальность таких, как Шапиро-Wilk. Если это не нормально, превратить его, или использовать непараметрические эквивалентные статистики ^20.
   Примечание: Для войти примерные данные из одного самца экспериментах по трансформации отвечает требованиям нормальности и одинаковыми дисперсиями.
3. Если данные могут быть нормализованы, использование Т-тесты для выявления различий между задержкой спаривания и продолжительность в отдельных мужских испытаний спаривания при использовании двух методов лечения ^21. Если несколько лечения используются,попробуйте дисперсионного анализа (ANOVA) ^20. Если данные не могут быть нормализованы, попробуйте эквивалентные непараметрических критериев ^21.
4. Используйте биномиальных испытаний для проверки эффекта либо пищевого красителя или СО ₂ анестезии на брачный успеха конкурирующих самцов ^20. Если несколько лечения используются, как и в случае с данными например, использовать GLM со структурой биномиальное ошибки ^21.
5. Для двух мужчин испытаний в примере данных, использовать GL-модели биномиального структур ошибок. Один GLM рассмотрены цвет в качестве переменной отклика (цветной = 0 и неокрашенных = 1) с видами, статус газа и очистки газа, установленного в качестве объясняющих variables.One GLM рассматриваемой CO ₂ в качестве переменной отклика (загазованности = 0 и не-загазованности = 1) с видами, статус цвет, а очистки газа, установленных. В каждом случае получения максимальной модель, и модель выполняет упрощение на основе АПК ^20.

Результаты

Два мужчины спаривания испытания - эффект CO ₂ анестезией брачного поведения

Лучшая модель установлено, объяснить изменение в действии CO ₂ наркозом, содержащиеся видов как фактор (с Д. pseudoobscura и Д. subobscura плавленого так как они не показали никаких различий между друг другом). У D. pseudoobscura и D. subobscura не было никакого существенного влияния CO ₂ анестезией спаривания успеха в двух мужских исследований (Z ₁₅₈₉ = 0,087, P = 0,931). Для D. MELANOGASTER, мужчины подвергаются CO ₂ анестезии была значительно ниже, успех спаривания (Z1,589 = 2,467, P = 0,014). Был также значимое взаимодействие между видами и лечения (χ ² ₁₅₈₉ = 6,83, P = 0,009) с большим эффектом рассматривается, когда D. MELANOGASTER подвергались газа на коллекции или за 1 день до испытаний (таблица 1). Howevэ-э, D. MELANOGASTER мужчины подвержены CO ₂ за два дня до эксперимента суда не показывают эффект CO _2.

Два мужчины спаривания испытания - эффект кишечной окраски на брачное поведение

Модель упрощение показали никакого существенного влияния пищевых красителей не были найдены ни для одного из трех видов (P> 0,1). При лечении или состояния газа были включены в анализ это были также не имеет существенного значения (Р> 0,1). Пропорции успешных скрещиваний для цветных мух через обработок показаны в таблице 2. Различие в окраске между мух продолжали цветные и бесцветные пищи можно видеть на фиг.1. Интенсивность окраски пищи кишечника была выше у D. pseudoobscura и D. subobscura чем в D. MELANOGASTER.

Холост спаривания испытания - эффект от использования СО ₂ анестезии на мповедение Отопительный

Там не было никакой разницы в латентности спаривания для любого из этих трех видов, когда CO ₂ анестезия используется для сбора недавно появились взрослые. Эффект был обнаружен продолжительности спаривания в D. subobscura, когда он был выставлен CO ₂ за два дня до спаривания испытаний (рис 2 и 3, таблица 2).

Рисунок 1. Фотография показывает флаконов из цветного и ненасилия Цветной Fly продовольствия (А) и Сила кишечника окраску в мужском D. Subobscura (В).

Рисунок 2. Среднее и 95% доверительные интервалы для совокупления задержки для трех видов исследованных в одного мужчины испытаний, когда самцы были Анестезироватьd (свет баров) или нет анестезированной (темные полосы), когда собранных в качестве девственниц до половой зрелости.

Рисунок 3. Среднее и 95% доверительные интервалы для совокупления продолжительность трех исследованных видов в одного мужчины испытаний, когда самцы были под наркозом (свет баров) или не под наркозом (темные полосы), когда собранных в качестве девственниц до половой зрелости.

Лечение	Вид	No. испытания	No. мухи цвета, что в паре	р-значение	No. мухи газом, что в паре	р-значение
Коллекция по СО 2	D. Мел	73	36	1	27	0,0344
	D. PSE	79	41	0,8221	44	0,3682
	D. югу	71	40	0,3425	33	0,6353
Открытые СО 2 18 часов до	D. Мел	57	28	1	19	0,0163
	D. PSE	65	32	1	31	0,8043
	D. югу	68	38	0,3961	35	0,9036
Открытые СО 2 2days.	D. Мел	56	19	0,0222	32	0,3497
	D. PSE	70	32	0,5504	33	0,7202
	D. югу	56	29	0,8939	26	0,6889

Таблица 1. Результаты двух мужчин экспериментов выбор по всем видам и лечения изучены.

Вид	Черта	DF	T-значение	р-значение
Дрозофилы	Латентность	58	1,379	0,174
	Продолжительность	58	1,243	0,221
D. pseudoobscura	Латентность	109	0.419	0,676
	Продолжительность	109	0.436	0.664
D. subobscura	Латентность	83	0.098	0,922
	Продолжительность	83	1,767	0,081

Таблица 2. Результаты от отдельных стыковочных экспериментах по исследованию эффекта сбора на CO ₂ анестезии на соединительной Latency и продолжительности. Испытания проводились на трех видах Drosophila (дрозофилы, Д. pseudoobscura и D. subobscura).

Обсуждение

Эти данные показывают, что воздействие CO ₂ анестезии, не совместимых между видами, с двумя из трех видов, показывающих небольшое влияние. Наши результаты показывают, маркировка с пищевым красителем, имели более низкий влияние на мужскую успеха спаривания, чем CO ₂ анестезия для D. MELANOGASTER. Эти эксперименты показывают, что пищевые красители могут быть легко и дешево использовать для мух этикеток для вязки анализах с участием нескольких мужчин.

Из трех модельных видов дрозофилы исследованы, только D. MELANOGASTER показали эффект CO ₂ анестезией на производительность спаривания в конкурентной ситуации. В отличие от этого, ни один из видов не показали эффект набора на газ в одиночных испытаний спаривания с точки зрения задержки спаривания, в отличие от предыдущих результатов для D. MELANOGASTER ^5. Эффект конкуренции может поэтому быть выделив более тонкие фитнес эффекты CO ₂ наркозом, которые можно обнаружить толькопод ситуациях, когда существует между мужчинами конкуренции. Воздействие на ранней коллекции и один день до судебного разбирательства оказать негативное влияние на способность самцов D. MELANOGASTER, чтобы получить спаривания. Окна выходят на два дня до судебного разбирательства, однако, не показывают никакого эффекта. Оба D. pseudoobscura и D. subobscura не показывают никакого эффекта воздействия на газ в одном из испытаний. Одно из объяснений является то, что Д. MELANOGASTER был уязвим для раннего воздействия СО _2, потому что это должны быть собраны в более раннем возрасте (0 - 6 ч старого) по сравнению с другими видами для обеспечения самцы девственница. Поэтому мужчина D. MELANOGASTER этого возраста могут быть более чувствительны, как кутикула лету еще закалки, по сравнению с другими видами, которые имели больше времени для их кутикулы, чтобы укрепиться. В общем, это поддерживает идею, что эффекты CO ₂ анестезии на конкретные виды и следователи должны надлежащим образом проверить влияние в своих целевых видов. Currentlу, большая часть работы по влиянию CO ₂ наркозом была проведена на дрозофилы ^5,11,22 и, следовательно, не может быть целесообразно применять на других родственных видов.

Альтернативой неинвазивный метод, представленный дифференцировать мух пищевой краситель. Результаты предполагают, что это лечение не имело никакого эффекта в во всех изученных видов. Тем не менее, в то время как его использование было успешным в обеспечении недорогой и легко видимый маркер для различения лиц следует отметить, что краситель было легче различать в D. pseudoobscura и D. subobscura чем в D. MELANOGASTER. Предыдущая авторы использовали несколько цветов (красный, зеленый и синий) ^4,6. Мы нашли синее окрашивание быть простой, чтобы отличить у всех видов, особенно D. pseudoobscura и D. subobscura. Использование нескольких цветов потенциально позволяют более сложных экспериментов со многими индивидуальную маркировку flieс. Тем не менее, предварительные испытания различных красителей существенным, так как некоторые пищевые красители не окрашивают мух, возможно переваривается, когда потребляется. Другие красители могут оказывать токсическое действие и уменьшить выживание мух, и его следует избегать ^14). Альтернативные методы пищевые красители, использующие более дорогие пятна были также использованы для исследования кишечника целостности для D. MELANOGASTER ^23. Они могут предоставить альтернативу, хотя и более дорогим, метод крашения ^23.

Метод краситель так быстро, как CO ₂ крыла отсечения, как мухи могут быть сохранены на окрашенных продуктов из коллекции. Поглощение пищи было быстрым (~ 3 ч), так что хранение O / N на цветной пищи также будет достаточно, чтобы отметить мух, как он использован в других исследованиях ^6. Тем не менее, продолжительность окрашивания является относительно коротким (~ 4 - 5 ч) по сравнению с крылом отсечения (постоянное) или флуоресцентным пыли маркировки (10 - 12 дней) ^24. Как Drosophila видовразличаются по внешнему виду, различные красители будет более или менее эффективным для разных видов, а также некоторых штаммов (например, нокаут-мутанты) может быть чувствительными к изменениям в диете, любое использование красителей требуется предварительное испытание его эффективности в особенности, если больше Срок экспозиции на красители могут быть токсичными ^14. В отличие от исследования Kalaw и др. ^14, мы не нашли никакого существенного смертности после хранения в течение нескольких дней на цветных продуктов для D. MELANOGASTER (3 дня), Д. pseudoobscura (5 дней), или D. subobscura (7 дней), вероятно, из-за разницы в красителя используется.

Важным шагом для успешного использования метода красителя шаг 1,5, проверки того, что выбран краситель хорошо работает с виды и штамм используется. Альтернативный метод включает применение цветной пыли на внешней стороне лету перед использованием в полевых экспериментов ^24. Этот метод был использован для отслеживания лиц в данной области, вследствие тO продолжительность маркировки и легкость массы маркировки летит ^24. Хотя мы явно не тестировал этот метод в брачных испытаниях, было бы важно изучить любые последствия, что пыль может оказать на смыслах важных в спаривании, в частности, у дрозофилы ^{25, 26.} У видов, однако, где кишечная крашение невозможно, Эти методы могут быть пригодны.

В заключение мы обнаружили, что в двух из трех испытанных видов (D. pseudoobscura и D. subobscura) не было никакого эффекта обнаружено либо из CO ₂ анестезией или пищевого красителя на брачный способности мужчин. Для D. MELANOGASTER негативное влияние CO ₂ анестезией была обнаружена, но пищевой краситель не влияет спаривания успех у этого вида. В целом, способ краситель обеспечивает простой и дешевый неинвазивный способ идентификации индивидуального Drosophila, что эквивалентно или лучше, чем методы, которые требуют CO ₂ анестезии. Это, скорее всего, этот метод будет работать в целом ряде видов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic tubing	Fisher Scientific	TWT-200-061G	Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.
Fine mesh	Any haberdashery	-	Fine curtain mesh is suitable
1 ml pipette tips	VWR	83007-376	Various brands of pipette tips would be suitable
Plastic Vials	Sarstedt	58.49	Larger vials or bottles could also be used.
Cotton Balls	Lewis Medical Solutions	28170	The size of cotton will vary depending on the size of vials used
Blue Food colouring	Thesugarcraftcompany	-	Other dye colours and brands can have variable results.
CO2 Tank	BOC	BOC 40VK
Sharpie Markers	Steadtler	Lumocolor 313 S	Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness
Stopwatch	Salter	SL3920	Any stopwatch with a good digital display would be fine