Генерация лимфобластный микрочастиц и выявление их проапоптозный Влияние на эпителиальными клетками дыхательных путей

Резюме

Микрочастицы клеточной мембране-пролил (MPS) являются активными биологические везикулы, которые могут быть выделены и их патофизиологические эффекты исследованы в различных моделях. Здесь мы описываем способ генерации MPs, полученные из Т-лимфоцитов (LMPs) и демонстрации их влияния на проапоптотический эпителиальных клеток дыхательных путей.

Аннотация

Интерес к биологической роли клеточной мембраны, полученных пузырьков в межклеточной коммуникации возросло в последние годы. Микрочастицы (MPS) являются одним из таких типов везикул, в диапазоне диаметра от 0,1 мкм до 1 мкм, и, как правило, пролил из плазматической мембраны эукариотических клеток, находящихся активации или апоптоз. Здесь мы описываем образование микрочастиц Т-лимфоцитов, полученных (LMPs) от апоптоза Т-клеток СЕМ, стимулированных актиномицин D. LMPs изолированы с помощью многостадийного процесса дифференциальным центрифугированием и охарактеризованы с помощью проточной цитометрии. Этот протокол также предоставляет на месте метод обнаружения гибели клеток для демонстрации проапоптотический эффект LMPs на бронхиального эпителия клеток, полученных из мышиных первичных дыхательных эксплантов бронхиальной ткани. Способы, описанные здесь, обеспечивают воспроизводимую процедуру выделения обильные количества LMPs от апоптоза лимфоцитов в пробирке. LMPs полученытаким образом, может быть использован для оценки характеристик различных моделей заболеваний, а также для фармакологии и токсикологии испытаний. Учитывая, что эпителий дыхательных путей предлагает защитный физической и функциональной барьер между внешней средой и подстилающей ткани, использование бронхиальной эксплантатов ткани, а не иммортализованных эпителиальных клеточных линий обеспечивает эффективную модель для исследований, требующих путей дыхательных путей ткани.

Введение

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.¹ MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.^2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.^4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.⁶

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.⁷ We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,⁸ which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Мужской мышей C57BL / 6 (5-7 недель) взяты из Charles River Laboratories International, Inc. (Санкт-Констант, Квебек, Канада.) И манипулировать в соответствии с процедурами, утвержденными Сент-Жюстин комитета Чу Уход за животными мимо. Мыши бронхиальные ткани эксплантатов обеспечивают хороший источник первичных бронхиальных эпителиальных клеток для исследования влияния проапоптозных LMPs на эпителиальных клетках. Этот протокол описывает генерацию ин витро LMPs, а также способ обнаружения апоптоза эпителиальных клеток на LMPs обработанных эксплантатов бронхиальной ткани. Этот протокол состоит из 3 разделов.

1. LMPs производства и характеристика

ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения загрязнения, убедитесь, что все материалы, используемые в этом эксперименте являются стерильными или в автоклаве. Выполнить все шаги при комнатной температуре в бокс биологической безопасности при стерильных условиях, если не указано иное.

1.1) Стимулирование и Коллекция депутатов⁹

1. Оттепель аликвоту 10000000 CEM Т-клеток в C на водяной бане 37 °. Развести в 10 мл подогретого бессывороточной средой гемопоэтических такие как X-VIVO, в 15 мл стерильную пробирку и центрифуги в 200 GX 5 мин. Аспирата супернатант и ресуспендируют клеток в 5 мл предварительно нагретой среды.
2. Передача клеток в культуральной колбе Т75 ткани (для суспензии клеток) с 15 мл предварительно нагретой гемопоэтических среде, такой как X-VIVO и инкубировать в течение 4 дней в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO _2.
3. После 4 дней, передать всю культуральную среду и клетки в культуральной колбе T175 ткани, содержащей 100 мл свежей среды. Продолжить инкубации клеток в течение примерно 72 ч в тех же условиях, пока они не выращивали до плотности 2000000 клеток / мл.
4. Поровну между четырьмя клетками T175 колб каждый из которых содержит 150 мл свежей среды, и культуры клеток продолжают до тех пор, пока клетки выросли (примерно 48 ч инкубации) с плотностью 2000000 / мл.
5. Сбор клеток из каждой колбы центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин и ресуспендируют 300 × 10 ⁶ клеток в новую T175 колбу, содержащую 150 мл свежей среды, чтобы сохранить / мл плотность клеток 2000000.
6. Добавить актиномицина D (растворенного в ДМСО в концентрации 2 мг / мл) в среде при конечной концентрации 0,5 мкг / мл и инкубируют в течение 24 ч.
7. Перенесите все культуральной среды в 50 мл конические пробирки и спином вниз клетки при 750 мкг в течение 5 мин. Передача супернатант в 50 мл конические пробирки и центрифуги в 1500 мкг в течение 15 мин для удаления крупных фрагментов клеток.
8. Передача супернатант в бутылку 250 мл и ультрацентрифуге при 12000 х г в течение 50 мин. Удалите супернатант и собрать шарики.
9. Промыть LMPs обогащенного гранул с 40 мл стерильной PBS в 50 мл пробирку центрифугированием при 12000 х г в течение 50 мин. Повторите этот шаг дважды.
10. Соберите последней промывки надосадочной жидкости; он будет использоваться в качестве контроля транспортного средства. Приостановить гранул LMPs в 1мл PBS и передачи в 1,5 мл стерильной микропробирку. Кратные и хранить изолированно LMPs при -80 ° С (чтобы избежать многочисленных циклов свободного оттаивания).

1.2) Характеристика депутатов с помощью анализа FACS ⁴

1. Подготовка 2 образцы аннексином буфера, 1 с и другой без CaCl _2: Hepes 10 мМ, NaCl 140 мМ, плюс или минус 5 мМ CaCl _2.
2. Фильтр буфер аннексина и FACS потока текучей среды оболочки с использованием 0,22 мкм фильтр для удаления частиц.
3. Развести 1 мкл LMPs в 44 мкл аннексина буфера с 5 мМ CaCl ₂ в FACS трубы. Подготовьте другую трубу с 1 мкл LMPs в 44 мкл аннексина буфере без CaCl ₂ (отрицательный контроль).
4. Добавить 5 мкл annexinV-Cy5 в каждой пробирке и хорошо перемешать. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Остановка реакции разбавлением смеси с 400 мкл FACS потока оболочки жидкости в каждой пробирке.
5. Добавить 10 мкл (200000 бусы и бисер) подсчета BEA 7 мкмDS суспензию в качестве внутреннего стандарта в каждую пробирку, чтобы получить абсолютный подсчет.
6. Создание ворота относительного размера (FSC-H, PMT E00, войдите шкала) и относительной зернистости (SSC-H, PMT 325, войти шкала) точка участка, на цитометра с использованием размера калибровку флуоресцентные шарики из 1 мкм (ворота 1) и считая шарики ворота на 7 мкм (ворота 2).
7. Проанализируйте пробу LMPs на FSC-H / SSC-H печати с использованием установленных ворот и FL-4 канал для аннексин (ФЭУ 765, логарифмическая шкала) точка участок, путем приобретения сигнала до 20000 подсчета бусы не будут достигнуты в ворота 2.
8. Определите положительные annexinV события LMPs в аннексином буфере, содержащем CaCl _2, а затем вычесть события LMPs в аннексином буфера без CaCl ₂ (отрицательный контроль).
9. Рассчитать абсолютное число MPs на основе следующего уравнения:
   

1.3) Определение MP Protein Концентрация (Bradford анализ)

1. Подготовка 5 серийных разведений стандартного белка от 1,25 до 20 мкг / мл. Внесите 800 мкл каждого стандартного и анализируемого раствора в чистую пробирку в двух экземплярах. Добавить 200 мкл реагента красителя Брэдфорда в каждую пробирку. Все хорошо перемешать, затем инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
2. Измерьте оптическую плотность при 595 нм. Определить концентрацию белка LMPs помощью линейной регрессии стандартной кривой.

2. Бронхиальная тканей эксплантов и LMPs Лечение

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите особое внимание на стерильной рабочей среды, и в асептических условиях приготовления растворов и среда, используемая в следующих экспериментах. Для подготовки полного заживления Medium, добавить 1 мл ткани Исцеление среднего добавки с сывороткой (оттаивали на льду) до 100 мл тканей исцеления средней и хорошо перемешать.

2.1) Подготовка бронхиальной тканей эксплантов

1. Перед культивирования поцарапать 6 областей 1 см ²друг на краю поверхности каждой 100 мм блюдо культуры ткани с скальпелем. Шерсть друг поцарапан 100 мм культуре ткани блюдо с 2 мл раствора для нанесения покрытия культуральную чашку и инкубировать блюдо в увлажненной CO ₂ инкубаторе O / N при 37 ° С. Вакуумная аспирация излишки раствора и заполнить блюдо с 15 мл ткани среды для промывки.
2. Эвтаназии C57BL / 6 мышей (от 5 до 7 недель) СО ₂ ингаляции в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетом по этике по уходу за животными.
3. Соблюдая правила асептики, анализировать легочной ткани скальпелем, Дюмон супер тонкой пинцет и хирургические ножницы. Осторожно снимите паренхимы и сосудов. Поместите ткань легкого в ледяную тканей среды для промывки для транспортировки в лабораторию, если это применимо.
4. Кроме того рассекают бронхов погруженной в ткани и среды для промывки отделить бронхов с диаметром от 1 до 2,5 мм из периферических тканей легких. Нарежьте бронхиальной ткани в ~ 5 мм толщиной бронхов колец с помощью скальпеля.
5. Используйте движение черпая со стерильным изогнутых microdissecting щипцов, чтобы забрать бронхов фрагменты и поместить их на поцарапанных областей блюд.
6. Снимите ткань промывочной среды, и инкубировать фрагменты при комнатной температуре в течение ~ 5 мин, чтобы позволить им придерживаться блюд.
7. Добавить 10 мл полного заживления среднего в каждую чашку и поместите их в контролируемой атмосфере инкубатором камеры. Промойте камеру с высоким O ₂ газовой смеси (70% O _2, 25% N ₂ и 5% СО _2,). Поместите камеру в настольном орбитальном инкубаторе и встряхивают при 37 ° С. Встряхнуть камеру на 24 часа при 10 циклов в минуту, чтобы среда течь с перерывами в течение фрагментов.
8. После 24 ч инкубации соблюдать ткани эксплантов под фазового контраста перевернутой оптического микроскопа. Выберите бронхов эксплантов полной, точной движения волос и живой бронхиального эпителия для последующей обработки LMPs.

2.2) LMPs Лечение

1. Подготовить всю среду для роста следующим образом: рост оттепель среднего добавки с сыворотки и фибробластов ингибитора на льду. Добавить 1 мл среды роста добавки с сывороткой и 200 мкл фибробластов ингибитора в 100 мл ростовой среды; тщательно перемешать. Теплый полную среду для роста при 37 ° С в течение 10 мин перед использованием.
2. Развести изолированных LMPs в новом стерильной пробирке Эппендорфа с PBS подготовить запас LMPs в концентрации 800 мкг / мл.
3. Добавить 0,5 мл полной среды роста в каждую лунку планшета для культуры ткани 12-а.
4. Передача выбранных бронхов эксплантов с изогнутыми microdissecting щипцов из предыдущего протокола (раздел 2.1) в каждую лунку планшета для культуры ткани.
5. Этикетка культуры пластину надлежащим образом определить LMPs лечения скважин и контроля скважин. Добавить 25 мкл LMPs запас в каждой обработки LMPs также (при конечной концентрации 40 мкг / мл) и 25 мкл управления транспортного средства (см LMP с производство) в контрольных лунках.
6. Продолжить инкубации в контролируемой атмосфере инкубатора модульной камеры при 37 ° C при осторожном встряхивании.
7. После 24 часов, помыть ЭКСПЛАНТОВ 3 раза PBS и перейти к следующему шагу (4% параформальдегид [PFA] фиксации).

3. Гистопатологическая Экспертиза

3.1) подготовить следующие решения, прежде чем приступить к выполнению следующих шагов

1. Приготовьте 1х буфер PBS путем смешивания 137 мм NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na ₂ HPO _4, 1,76 мМ KH ₂ PO _4, рН 7,4.
2. Для приготовления 4% PFA, растворяют 20 г PFA в 400 мл воды, нагревают при 60 ° С при перемешивании; добавить несколько капель 10 М NaOH, чтобы очистить решение. Затем добавьте 1x буфер PBS и отрегулируйте громкость до 500 мл и рН до 7,4. Фильтр и аликвоту; хранить при -20 ° С.
3. Подготовьте следующие обезвоживания или регидратации реагентов; 100%, 90%, 70%, 50% этанола и ксилола.

e_step "> 3,2) эксплантата Фиксация и тканей Раздел Депарафинирование

1. Место каждого эксплантов в меченого микроцентрифужных трубки с 1,5 мл 4% PFA и инкубировать O / N при 4 ° С. Промыть эксплантов дважды 1x PBS.
2. Дегидрировать эксплантов через серии алкоголя (70% этанола: 3 раз 30 минут каждый; 90% этанола: 2 раз 30 мин каждый; 100% этанола: 3 раз 30 мин каждый; затем ксилол: 3 раз 20 мин каждый). Выполните все шаги при комнатной температуре в вытяжном шкафу.
3. Вложим ткани эксплантов в парафин на 58 ° С в печи. Подготовка 5 мкм Срезы толщиной ткани с использованием роторного микротома.
4. Поплавок разделы в C на водяной бане 56 °, а затем смонтировать разделы на меченых гистологических препаратов. Поместите слайды в ручном окрашивания стоек и высушивают при 65 ° С в течение 1 ч. Разрешить слайды остыть при комнатной температуре.
5. Опустите стойки в 4 последовательных блюд пятен, содержащих ксилол в течение 10 минут каждый, чтобы удалить парафин. Опустите стойки в серии этанола, чтобы удалить ксилол: 100%, то 95%, йEN 80%, то 70%, то 50% этанола (5 мин для каждого шага). Промыть стойки с водопроводной водой в течение 5 мин, чтобы удалить этанол.

3,3) гематоксилином и эозином (Н & Е) Окрашивание

1. Продолжить работу с разделами основной ткани; разместить стойку в окрашивания тарелки, наполненной гематоксилином Майера в течение 15 мин. Промойте стойку с водопроводной водой, чтобы удалить гематоксилином в течение 20 мин.
2. Место в дистиллированной воде в течение 30 sec.Place в 95% этаноле в течение 30 сек. Место в Eosin Y красящим раствором блюдо в течение 1 мин. Высушить с помощью 2 изменений 95% этанола, 100% -ного этанола и ксилола в течение 2 мин каждый.
3. Выполните быструю проверку под микроскопом, чтобы убедиться, что избыток эозином удаляется. Поместите 2 до 3 капель гистологическая среда (Fisher SP15-100) на каждого слайда, затем накрыть покровным стеклом.

3.4) В Ситу Cell обнаружения смерти: TUNEL Анализ

1. Перед началом, подготовить протеиназы К рабочий раствор: 20 мкг / мл в10 мМ Трис / HCl, рН 7,4.
2. Повторите шаги с 1 по 5 раздела 3.2 (эксплантата фиксации и тканей разделе депарафинизации). Промыть слайды с деионизированной H ₂ O.
3. Погрузите слайды с 1x PBS в течение 10 мин. Слейте лишнюю PBS. Инкубируйте срезов ткани в течение 30 мин при комнатной температуре с протеиназой К рабочего раствора. Промыть слайды дважды 1x PBS.
4. Выполните анализ TUNEL, как описано в руководстве по эксплуатации комплекта обнаружения гибели клеток. Установите с помощью монтажной среды и покровное вручную покровные стекла.
5. Анализ образцов под световым микроскопом. Используйте Image Pro 4.5 для анализа апоптоза клеток в коричневый цвет.

Результаты

LMPs характеризовались аннексин V окрашивания ¹⁰ по флуоресценции активирован сортировки клеток анализ (FACS) и закрытый с помощью 1 мкм шарики, в которых 97% депутатов (≤1 мкм) аннексин-V-Cy5 положительный (1А и 1В). Как правило, около 2,5 мг LMPs были получены после этого протокола. Бро?...

Обсуждение

Депутаты являются активными посредниками межклеточного перекрестных помех и их изучение обещает во многих областях науки. ¹¹ Это исследование представило подробный протокол для крупномасштабного производства в пробирке LMPs, полученных от апоптоза клеток линии T. Эти депута?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 medium	Cambrex, Walkersville	04-744Q
Flask T75	Sarstedt	83.1813.502
Flask T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomycin D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 µm filter	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen	559933
FACS flow solution	BD Bio-sciences	342003
Fluorescent microbeads (1 µm)	Molecular Probes	T8880
Polysterene counting beads (7 µm)	Bangs laboratories	PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes	Falcon	352058
1 ml pipet	Fisher	13-678-11B
5 ml pipet	Falcon	357543
25 ml pipet	Ultident	DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube	Sarstedt	72.690
15 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.554.205
50 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube	Nalgene	3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle	Beckman	356011
Protein assay (Bradford assay)	Bio-Rad Laboratories	500-0006
Protein assay standard II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
Test tube 16 x 100	VWR	47729-576
Test tube 12 x 75	Ultident	170-14100005B
Cell incubator	Mandel	Heracell 150
Low speed centrifuge	IEC	Centra8R
High speed centrifuge	Beckman	Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle	Beckman	JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube	Beckman	JA30.50
Fow cytometry	BD Bio-sciences	FACS Calibur
Spectrophotometer	Beckman	Series 600
Bronchial tissue explants and sections
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)	Charles River Laboratories, Inc.
Mouse Airway PrimaCell™ System:	CHI Scientific, Inc.	2-82001
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
Scalpel Handle	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
phase-contrast inverted microscope	Olympus Optical CO., LTD.	CK2
high O2 gas mixture	VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker	Barnstead Lab-Line,	SHKA4000-7
12-well tissue culture plate	Becton Dickinson and Company	353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm)	Sarstedt, Inc.	83.1802
Surgical scissors	Fine Science Tools Inc.	14060-09	Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps	Fine Science Tools Inc.	11052-10
humidified CO2 incubator	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
Histopathological examination
formalin formaldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
paraffin	Fisher scientific  International, Inc.	T555
ethyl alcohol	Merck KGaA, Darmstadt	EX0278-1
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
Cacodylate	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
microscope slides	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
Xylene	Fisher scientific  International, Inc.	X5-4
Mayer's hematoxylin	Sigma-Aldrich, Inc.	MHS16	Funnel with filter paper
HCl	Fisher scientific  International, Inc.	A144s-500
eosin	Sigma-Aldrich, Inc.	HT110116	Funnel with filter paper
Permount™ Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
glass coverslip	surgipath medical industries, Inc.	84503	24×24 #1
TUNEL detection kit	In Situ Cell Death Detection, POD	11 684 817 910
oven	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
rotary Microtome	Leica Microsystems Inc.	RM2145
filter paper	Whatman International Ltd.	1003150	#3
Microscope	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
staining dish complete	Wheaton Industries, Inc.	900200	including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath	ExpotechUSA	ORS200
phosphate buffered saline	GIBCO	14190-144
fume hood	Nicram RD Service	3707E