Электроретинограммы Анализ визуальной ответ в данио рерио Личинки

Резюме

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Аннотация

Электроретинограммы (ERG) является неинвазивного электрофизиологического метода определения функции сетчатки. Путем размещения электрода на поверхности роговицы, электрической активности генерируется в ответ на света может быть измерена и использована для оценки активности клеток сетчатки в естественных условиях. Эта рукопись описывает использование ЭРГ для измерения зрительную функцию у рыбок данио. Данио рерио уже давно используется в качестве модели для позвоночных развития из-за легкости подавления генов с помощью морфолино олигонуклеотидов и фармакологической манипуляции. У 5-10 DPF, только шишки функционал в личиночной сетчатки. Таким образом, данио, в отличие от других животных, является мощным модельной системой для изучения конуса зрительной функции в живом организме. Этот протокол использует стандартный анестезии, микроманипуляция и стереомикроскопия протоколы, которые являются общими в лаборатории, которые проводят данио исследования. Изложенные методы использовать стандартный электрофизиологии эквоборудования, а также малой освещенности для направления размещения записи микроэлектрода на личиночной роговицы. Наконец, показано, как коммерчески доступный ЭРГ стимулятор / записывающее устройство первоначально разработана для использования с мышами могут быть легко адаптированы для использования с данио. ERG личинок рыбок данио обеспечивает отличную метод опробования конуса зрительную функцию у животных, которые были изменены морфолиновой инъекции олигонуклеотидов, а также новые технические методы, генома, такие как цинковый палец нуклеаз (ZFNs), активатора транскрипции-Like Effector Нуклеазы (Таленс), и Кластерные Регулярно Interspaced Короткие палиндромную повторов (CRISPR) / Cas9, все из которых привели к значительному увеличению эффективности и действенности генного таргетинга у рыбок данио. Кроме того, мы воспользуемся возможностью фармакологических агентов проникнуть данио личинки оценить молекулярные компоненты, которые способствуют фотоотклике. Этот протокол описывает установку, которая может быть изменена и используется исследователямис различных экспериментальных целей.

Введение

Электроретинограммы (ERG) является неинвазивного электрофизиологического метода, который широко используется в клинике для определения функции сетчатки у людей. Электрической активности в ответ на световой раздражитель измеряется путем помещения записи электродов на внешней поверхности роговицы. Характеристики стимула парадигмы и сигнала отклика определить нейронов сетчатки, способствующих ответ. Этот метод был адаптирован для использования с рядом моделей животных, включая мышей и данио. Типичный позвоночных ответ ERG имеет четыре основных компонента: а-волна, которая роговица-отрицательный потенциал происходит от фоторецепторов активности клеток; б-волна, роговица-положительный потенциал происходит от биполярного клеток; D-Wave, роговица-положительный потенциал интерпретируется как деятельности ВЫКЛ биполярных клеток; и C-волна, которая наступает через несколько секунд после того, как б-волны и отражает деятельность в Müller глии и в отставкеИнал пигментный эпителий ^1-4. Дополнительные ссылки для понимания истории и принципы анализа ERG в организме человека и модельных животных онлайн учебник, WebVision из Университета штата Юта и текстов, таких как Принципы и практика клинического электрофизиологии Видение ^{4, 5.}

Danio rerio (данио) уже давно выступает в качестве модели для позвоночных развития, в связи с быстрым созреванием и прозрачность, что позволяет для неинвазивной морфологического анализа систем органов, поведенческих тестов и прямом и обратном генетических экранов (для обзора см Fadool и Даулинг ^6). Данио рерио личинки очень поддается генетической и фармакологической манипуляции, которые, в сочетании с их высокой плодовитостью, сделать их отличная модель животного для высокопроизводительного биологического анализа. Чем выше отношение конусам, чтобы стержней в личиночной данио - примерно 1: 1 по сравнению с мышами (~ 3% конусаS) - делают их особенно полезными при изучении функции конуса ^7-9.

В сетчатки позвоночных, конусы развивать до стержней ^10. Интересно, что данио конусы действуют уже в 4 денье, позволяя селективного электрофизиологического анализа конусов на этом этапе ^{6, 11,12.} В отличие от этого, ответы эрг стержней появляются между 11 и 21 DPF ^13. Таким образом, данио личинки 4-7 DPF служить функционально, как все-конуса сетчатки. Тем не менее, родной фотопического ERG ответ 4-7 DPF личинок преобладают б-волны. Применение фармакологических агентов, таких как L - (+) - 2-амино-4-фосфоно-масл ную кислоту (L-АР4), агонист для метаботропного глутамата (mGluR6) рецептора выражается ПО биполярных клеток, эффективно блокирует генерации В-волны и раскрывает изолированный рецепторный потенциал конус массу, ("волны") ^14-17.

Здесь мы опишем простой и reliablе метод анализа ERG с использованием коммерчески доступного ERG оборудование, предназначенное для использования с мышами, которые были адаптированы для использования с данио личинок. Эта система может быть использована на данио личинок различной генетический фон, а также у пациентов, получавших фармакологических агентов, чтобы помочь исследователей в определении путей, которые способствуют визуальной чувствительности и световой сигнализации ¹⁶ адаптации. Экспериментальные методики, изложенные в этом протоколе поможет следователям в использовании анализа ERG, чтобы ответить на различные биологические вопросов, относящихся к видению, а также продемонстрировать строительство гибкой настройки ERG.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Животное содержание и экспериментальные протоколы были одобрены уходу и использованию Институциональные комитеты животных университета Северной Каролины в Чапел-Хилл, и отвечают всем требованиям NIH Управления лабораторных животных благосостояния и ассоциации по оценке и аккредитации лаборатории по уходу за животными International.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения личинок для анализа ERG, опубликованные протоколы для стандартного данио хозяйства и обслуживания были заняты ^18. Личинки получают путем естественного размножения и размещены под 14 ч света / 10 ч темноты. Этот протокол был оптимизирован для личинок 5-7 дней после оплодотворения (DPF), но может быть идеально осуществляется на старшей рыбы с небольшими изменениями в процедуре. Здесь использование штамма TL дикого типа данио личинок 5 DPF.

1. Микропипетки Производство

1. Потяните несколько микропипетки с помощью 1,5 х 0,86 мм (наружный диаметр по внутреннему диаметру) огневой полировкой боросиликатного стекла капилляров снить (температура плавления 821 ° C) и P-97 Flaming / коричневый микропипетки Puller оснащены коробка тепла нити. Используйте программу для вылепляя микропипетки, описанные в таблице 1.
2. Проверьте каждый микропипетку под микроскопом с соответствующим координатной сетки правителя для того, чтобы советы 10-15 мкм в диаметре и имеет плавное открывание наконечник (то есть не зазубренными краями).
3. Тщательно храните микропипетки для предотвращения повреждений наконечника и воздействия пыли. Параметры хранения включают чашки Петри с лабораторного ленты, с подкладкой из пенопласта коробки, или коммерчески доступных контейнеров для хранения микропипетка.
   Примечание: Другие микропипетки съемники и стеклянные капилляры могут быть использованы до тех пор, как правильный диаметр микропипетки и наконечник высокого качества достигается.

Давление	Тепло	Тянуть	Скорость	Время
500	560	-	30	200
500	450	-	30	200
500	410	55	40	200

Таблица 1: Программа для производства микропипетки с использованием P-97 Пламенный / коричневый микропипетки съемник, снабженную окно тепловой нити Микропипетки изготовлены с использованием 1,5 х 1,0 мм ² (наружный диаметр по внутреннему диаметру) огневой полировкой боросиликатного стекла капилляров с нитью. (температура плавления, 821 ° С).

2. Подготовка буфера

1. Используйте фильтруют, буфер кислородом золотых рыбок Рингера ¹⁹ в микроэлектродов капилляра и насытить поливиниловый спирт (ПВС) губку, на которую помещены личинки для экспериментов. Кроме того, использование E3 эмбрион СМИ или сбалансированный солевой раствор Хенкса.
2. Получают раствор 10x золотых рыбок Рингера, как описано в таблице 2. доведения рН до 7,8, и стерилизуют с использованием фильтра 0,22 мкм и хранить 10x запас при 4 ° С.
3. Создание рабочего раствора в день эксперимента путем разбавления раствора с 10-кратным Рингера до 1 раза деионизированной, дистиллированной воды. Фильтр с использованием системы фильтр 0,22 мкм. Кислородсодержащих барботажем 95% O _2/5% CO ₂ газ в течение 10 минут. Крышка плотно после для того, чтобы решение остается кислородом.

NaCl	1,25 M
KCl	26 мм
CaCl 2	25 мм
MgCl 2	10 мм
глюкоза	100 мМ
HEPES	100 мМ

jove_content "> Таблица 2: Приготовление раствора 10x Золотая рыбка Рингера.

3. электроретинограммы Платформа

1. Выполнение ЭРГ эксперименты на столе амортизирующего внутри клетки Фарадея, чтобы улучшить отношение сигнал-шум. Прикрепите пользовательские стальная платформа с таблицей анти-вибрации с помощью гайки. Разместить подвижную платформу с пластиковой вязкоупругого уретана полимер амортизирующим нижней на столе под источником света.
2. Установите камеру с намагниченной стенде, направленных вниз, на подвижной пластиковой платформе. Установите микроманипулятор (который будет содержать записи микроэлектрода) со вторым намагниченной Встаньте справа подвижного пластиковой платформе. Убедитесь, что камера и микроманипулятор не будет беспокоить движения другого оборудования, и что они не блокируют освещение от источника света.
3. Подключите камеру к видео монитор и установите его для просмотра глазЛичинка для размещения электрода в правильном положении.
4. Убедитесь, что установка должным образом заземлен с медной проволокой. Чтобы проверить шум, поместите электрод сравнения и кончик записи микроэлектродом в 35 мм чашки Петри, заполненную раствором Рингера. Проверьте электрические уровень шума установки с помощью осциллографа или встроенную функцию аппарата ERG. Уровень шума должен быть не более ± 10 мкВ от базовой линии.

4. Губка Подготовка

1. Вырезать небольшой прямоугольник сухого ПВА губка, которая будет плотно прилегать в 35 мм чашки Петри. Толщина губки не должны быть больше, чем глубина чашки. Используйте нож с чистой бритвой для резки.
2. Сделать дополнительный разрез в губку, чтобы разместить электрод сравнения (либо мелкой разрезают вдоль по нижней части губки или бабочки сократить вертикально через одну из меньших сторон).
3. Используйте химически стойкого маркерчтобы отметить маленькую точку на губке (где будут размещены личинка), которые могут быть использованы для позиционирования камеры.
4. Замочите губку ПВА в растворе Рингера до насыщения. Снимите и быстро пятном на бумажное полотенце 2-3 раза. Поместите губку в чистой 35 мм чашки Петри.
5. Установите чашку Петри, содержащую губку на пластиковой платформе, такой, что знак могут быть визуализированы с помощью камеры.

5. Подготовка электрода

Примечание: данио установка состоит из электрода в контакте с раствором, насыщенным PVA губки Рингера и записи электрода в контакте с роговицей. Электрод состоит из гранул Ag / AgCl. Электрод записи вытащил стекло микропипетка заполнена раствором Рингера и провел держателем микроэлектродов, содержащего провод Ag.

1. Хлорида электроды путем замачивания их в 6-9 гипохлорита% натрия (отбеливатель) в течение 5 мин (запись mıcroelectrode проволоки) или 15 мин (электрод сравнения). Воздух сухой на Kimwipe в течение 5 мин.
   1. В зависимости от стиля надреза в шаге 4.2, установите Ag / AgCl осадок опорного электрода в (для вертикального разреза бабочки) или под (для мелкой разрезать вдоль на дне) губки. Прикрепите электродный провод к системе записи.
   2. С другой стороны, если установка ЭРГ имеет пространственных ограничений или есть особо прочные фотоэлектрические артефакты из электрода Ag / AgCl, соединить электрод на губку с помощью агаровой солевого мостика, чтобы переместить электрод из пути прохождения света.
2. Прикрепите ~ 40 см подходящего размера трубы до 5 мл, не Luer замок шприцев. Заполните шприц с раствором Рингера. Держатели Микроэлектродные, обладающие порты давления, как правило, поставляются с адаптерами для размещения трубопроводов с внутренними диаметрами 1/16 ", 3/32", 1/8 "или 5/32".
3. Заполните 1 мл нон-люэровского шприц сРаствор Рингера и, используя микро-фил, внимательно заполните держатель микроэлектродного. Не допускать образование пузырьков.
4. Прикрепите шприц 5 мл с портом давления держателя микроэлектродов с трубкой и использовать его, чтобы убедиться, что держатель микроэлектрод полна раствор Рингера. Использование Micro-фил и 1-мл шприц, наполненный раствором Рингера, заполнить микропипетки стекла от кончика и обеспечить, чтобы не было пузырей нет.
5. Прикрепите стекло микропипетки в держатель микроэлектродов, будьте осторожны, чтобы электродной проволоки прямой. После защиты использовать шприц 5 мл тщательно заставить раствор Рингера через микроэлектрода до небольшое количество раствора не видна на кончике. Иногда приложение давления к шприцу (если не применяется к роговице) предотвратит образование пузырьков воздуха, а также окклюзии из-за пыли или накопления соли, на кончике микропипетки.
   1. Если решение выходит в виде потока, заменить гдевушка микропипетка, как открытый, слишком большой или поврежден.
6. Осторожно положите микроэлектрод записи в микроманипулятором и прикрепите провод к системе записи.

6. Анализ электроретинограммы

ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с конусом доминирования личиночной сетчатки, высокое качество результатов ERG могут быть получены при подготовке к записи выполняются при низких уровнях косвенного белого света (<1 лк) или с короткими периодами (<1 мин) более высокой интенсивности ( ≤250 люкс) рабочее освещение. Короткий период адаптации к темноте по-прежнему требуется до записи (см шаг 6,7). Тем не менее, эксперименты могут быть выполнены при тусклом красном или инфракрасном свете с помощью инфракрасной чувствительная камера. Все эксперименты проводились в стерилизованным фильтрацией (0,22 мкм) системы воды из UNC данио рерио аквакультуры среды, но альтернативные носители эмбрион может быть использован.

1. Вырежьте квадраты бумажного полотенца размером примерно 1см ^2.
2. Если измерения изолированных рецепторного потенциала конуса массы, инкубировать 3-5 личинок в воде системы с 500 мкМ (±) -2-амино-4-phosphonobutyric кислоты (APB) в течение 5 мин.
   Примечание: В то время как АПБ представляет собой рацемическую смесь активного (L) и неактивные (R) формы AP4, это же эффективным, как L-AP4 и дешевле.
3. Обезболить 3-5 личинок в воде системы с 0,02% (вес / объем) до Tricaine отвечает, около 1-2 мин.
4. Используйте пипетку Пастера и пипетки насос тщательно передачи индивидуальный личинок на бумажные полотенца квадратов под рассекает стереоскоп, используя минимальное освещение (≤250 люкс для <1 мин). Проверьте положение каждого личинки и выбрать кандидата, который является спинной стороной вверх с unoccluded глаза.
   1. При длительном записи (> 30 мин), держать личинки влажной остеклением тело до, но не включая голову 3% метилцеллюлозы с помощью тонкой верблюжьей шерсти.
5. Использование щипцов, передача бумажных полотенец Squarе с личинки на влажной ПВА губки.
   1. Для расширенных записей (> 30 мин), применяются непрерывный поток воды, насыщенной 100% O ₂ газа над личинки барботированием газа через airstone в боковой рукоятки колбу, содержащую дистиллированную воду. Расположите трубку из колбы боковой рычаг, который передает увлажненного кислорода вблизи головы личинки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 6.4.1 и шаг 6.5.1 продлит жизнь рыбы ^16.
6. При минимальных освещения, используйте микроманипулятора и камеру для позиционирования зонда микроэлектродного в середине между носовой и хвостовой концы глаза и слегка нажмите на спинной границе роговицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: смещениям кончика электрода к далеко дистальных отделах роговицы может привести к ЭРГ сигналов обратной полярности.
7. Разрешить личинка до темно-адаптации в течение 5-10 мин.
8. Запись тест флэш ответы на свете, предоставленного из светодиодного источника света или оптического стимулятор, используя Avaíэтикетку стимулирование и записывающие устройства. Отрегулируйте параметры протоколов, такие как интенсивность вспышки, длиной вспышка, вспышка цвета, интенсивности фона и цвета и параметры фильтра, чтобы соответствовать эксперимент.
9. После завершения эксперимента, усыпить личинки в соответствии с директивами AVMA / IACUC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Как правило, эрг, записанные на рыбок данио личинок 5 DPF, так как ряд исследований опубликованы ЭРГ записи на данном этапе ^{9, 16,20.} Личиночные ответы были измерены в соответствии адаптируются к темноте условиях без фоновой подсветки с использованием 20 мс стимул белый светодиод. Мы ис?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе простая процедура ERG записи личинок рыбок данио подробно. Эта процедура позволяет быстро и всестороннего анализа визуального function.There несколько важных шагов в течение всей процедуры, которые должны храниться в памяти. Личинки данио должны быть здоровыми, прежде чем эк?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Faraday cage	80/20 Inc	custom	Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge	Amazon	B000ZOWG1C	Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems	Corning	431154	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2	Diagnosys, LLC	contact	Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome	Diagnosys, LLC	contact	Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator	Drummond	3-000-024-R	Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand	Drummond	3-000-025-MB	Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions	Grass Technologies	F-LX	Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor	Grass Technologies	DF-215/10	Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline	Lowes or Home Depot	various	For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters	Millipore	SCGP00525	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor	Monoprice	4127	Connecting camera to BNC cable
BNC cable	Monoprice	626	Connecting camera to video adaptor
Camera lens	Navitar	1582232	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler	Navitar	1501149	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter	Sewell	SW-29297-PRO	BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB	Sigma	A1910	mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass	Sutter	BF-150-86-10	Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)
P97 Flaming/Brown puller	Sutter	P97	For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet	Thorlabs	SB12A	Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard	Thorlabs	B2436F	Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts	Thorlabs	PWA074	Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh	TWP	022X022C0150W36T	To line Faraday Cage
Pipette pump	VWR	53502-233	Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes	VWR	14672-608	Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera	Watec	WAT-902B	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222)	Western Chemical	Tricaine-S	Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil	WPI	MF28G-5	Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder	WPI	MEH2SW15	Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode	WPI	DRIREF-5SH	Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative)	WPI	EP1	Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder	WPI	13620	Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard