JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол детализирует метод, чтобы изолировать внеклеточные пузырьки (EVS), небольшие мембранные частиц, выпущенных из клеток, от всего лишь 10 мкл образцов сыворотки. Такой подход позволяет обойти необходимость ультрацентрифугированием, требуется только несколько минут времени для анализа и делает возможным выделение электромобилей из образцов ограниченных объемах.

Аннотация

Внеклеточные пузырьки (EVS), мембранные частиц, выпущенных из различных типов клеток, провести большой потенциал для клинического применения. Они содержат кислоты и белка груз нуклеиновой и получают все большее признание в качестве средства межклеточной коммуникации, используемой как эукариот и прокариот клеток. Тем не менее, из-за их малого размера, текущие протоколы для выделения электромобилей часто занимает много времени, громоздка и требует больших объемов образцов и дорогое оборудование, например, ультрацентрифуге. Для устранения этих недостатков мы разработали на основе бумаги иммуноафинную платформу для разделения подгруппы электромобилей, который легко, эффективно, и требует выборки объемов столь же низко как 10 мкл. Биологические образцы могут быть пипеткой непосредственно на индикаторной бумаги зон, которые были химически модифицированы с молекулами захвата, которые имеют высокое сродство к определенным Е. поверхностных маркеров. Мы проверки анализа с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), на бумажной основе фермента-сшитый immunosorbenт анализы (P-ELISA), анализ транскриптом. Эти бумажные устройства позволит изучение электромобилей в клинике и условий исследования, чтобы помочь продвинуть наше понимание EV функций в норме и патологии.

Введение

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membranous particles that range in size from 40 nm to 5,000 nm and are released actively by many cell types via different biogenesis routes1-9. They contain unique and selected subsets of DNA, RNA, proteins, and surface markers from parental cells. Their involvement in a variety of cellular processes, such as intercellular communication10, immunity modulation11, angiogenesis12, metastasis12, chemoresistance13, and the development of eye diseases9, is increasingly recognized and has spurred a great interest in their utility in diagnostic, prognostic, therapeutic, and basic biology applications.

EVs can be classically categorized as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, oncosomes, ectosomes, microparticles, telerosomes, prostatosomes, cardiosomes, and vexosomes, etc., based on their biogenesis or cellular origin. For example, exosomes are formed in multivesicular bodies, whereas microvesicles are generated by budding directly from plasma membrane and apoptotic vesicles are from apoptotic or necrotic cells. However, the nomenclature is still under refined, partly due to a lack of thorough understanding and characterization of EVs. Several methods have been developed to purify EVs, including ultracentrifugation14, ultrafiltration15, magnetic beads16, polymeric precipitation17-19, and microfluidic techniques20-22. The most common procedure to purify EVs involves a series of centrifugations and/or filtration to remove large debris and other cellular contaminants, followed by a final high-speed ultracentrifugation, a process that is expensive, tedious, and nonspecific14,23,24. Unfortunately, technological need for rapid and reliable isolation of EVs with satisfactory purity and efficiency is not yet met.

We have developed a paper-based immunoaffinity device that provides a simple, time- and cost-saving, yet efficient way to isolate and characterize subgroups of EVs22. Cellulose paper cut into a defined shape can be arranged and laminated using two plastic sheets with registered through-holes. In contrast to the general strategy to define the fluid boundary in paper-based devices by printing hydrophobic wax or polymers25-27, these laminated paper patterns are resistant to many organic liquids, including ethanol. Paper test zones are chemically modified to provide stable and dense coverage of capture molecules (e.g., target-specific antibodies) that have high affinity to specific surface markers on EV subgroups. Biological samples can be pipetted directly onto the paper test zones, and purified EVs are retained after rinse steps. Characterization of isolated EVs can be performed by SEM, ELISA, and transcriptomic analysis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Общая схема процедуры работы приводится на рис 1. Использование этических норм, мы собрали образцы крови у здоровых субъектов, и полученный водный образцы юмора у пациентов через ветеранов больницы Тайчжун (TCVGH), Тайчжун, Тайвань под IRB утвержденным протоколов ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Изготовление бумаги устройств

  1. Вырезать хроматографии бумагу в кругах 5 мм в диаметре, чтобы обеспечить тот же макет, как микротитрационном 96-луночного планшета. Бутерброд эти кусочки бумаги с двумя Листы из полистирола с зарегистрированным сквозных отверстий и ламината.
  2. Изменить бумаги устройств, использующих метод химического сопряжения, описанную в следующих шагов 28.
    1. Лечить бумаги устройства с кислородной плазмы (100 мВт, 1% кислорода, 30 сек) в плазменной камере.
      ВНИМАНИЕ: Особая осторожность следует проявлять при работе с 3-меркаптопропилтриметоксисилана и N -γ-maleimidobutyryloxy сукцинимидаэфир (GMBS), так как они оба чувствительных к влаге и токсичными. Носите защитные перчатки и избегать вдыхания или контакта с кожей и глазами. Держите на фондовом бутылку, плотно закрытыми и позволить ему уравновесить до комнатной температуры перед открытием, чтобы избежать конденсации влаги. Кроме того, открыть фондовый бутылки внутрь заполненную азотом перчаточном боксе или коробку. Алиготе в небольших пробирках, чтобы избежать частого открытия фондовой бутылки.
    2. Сразу инкубировать обработанной бумаги устройств в 4% (объем / объем) раствора 3-меркаптопропилтриметоксисилана в этаноле (200 доказательства) в течение 30 мин.
    3. Промыть бумаги устройства с этанолом и инкубировать их с 0,01 мкмоль / мл GMBS в этаноле в течение 15 мин.
    4. Промывают этанолом (200 доказательства) и инкубируют бумаги устройств с 10 мкг / мл раствора авидин в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 1 ч при 4 ° С. Хранить при 4 ° С, если это необходимо, и использовать в течение 4 недель.
  3. Влажный каждого теста бумагу зоны с 10 мкл PBS, содержащим 1% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА) В течение 3 × 10 мин до пятнистость 10 мкл биотинилированных молекул захвата для 3 × 10 мин. Использование анти-CD63 антитела (20 мкг / мл в PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА и 0,09% (вес / объем) азида натрия) или аннексина V (1:20, объем / объем в аннексина V буфера для связывания), как молекулы захвата.
  4. Смыв несвязанных анти-CD63 антитела или молекулы аннексина V с использованием 10 мкл соответствующего PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА или аннексина V связывания буферные растворы в течение 3 × 1 мин, соответственно.

2. Сыворотка и водных Юмор Отбор проб и обработка

  1. Сыворотка коллекция.
    1. Соберите 10 мл периферической крови из вены в пробирки разделения сыворотки и аккуратно переверните трубку пять раз. Установка трубки в вертикальном положении и ждать в течение 30 мин.
    2. Центрифуга при 1200 х г в течение 15 мин. Передача сыворотку из верхнего слоя в чистую пробирку и центрифугируют снова в 3000 х г в течение 30 мин.
    3. Пропустите супернатант через FIL 0,8 мкмтер. Хранить образца при -80 ° С до использования.
  2. Водные юмора сбора: Сбор водных образцов юмор от пациентов, диагностированных у офтальмолога непосредственно с помощью инвазивных процедур и хранить образцы при -80 ° С до использования.

3. Выделение внеклеточной пузырьков

  1. Точечные пробы на каждого испытуемого зоне бумаги в размере 5 мкл / мин.
  2. Смыв несвязанных электромобилей с 10 мкл соответствующих PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА или аннексина V связывания буферные растворы для 3 × 1 мин для бумажных устройств, функционализированных молекул анти-CD63 антитела или аннексина V, соответственно. Выполните следующие ниже по течению анализов.

4. Downstream Анализ Пример 1: Сканирование Electromicrographs

  1. Fix электромобилей, снятые на функционализованного индикаторная бумага зону с помощью 10 мкл 0,5 × фиксатор Карновскому в течение 10 мин.
  2. Промыть образцов с достаточно PBS для 2 × 5 мин.
  3. ДегидрироватьОбразцы с последующим 35% -ным этанолом в течение 10 мин, 50% этанола в течение 2 × 10 мин, 70% этанола в течение 2 × 10 мин, 95% этанола в течение 2 × 10 мин, и 100% -ного этанола в течение 4 × 10 мин.
  4. Критический сухой и распыляют пальто образцов с палладий / золото, и изучить с помощью сканирующего электронного микроскопа, работающего при низком напряжении ускорения электронов (~ 5 кВ).

5. Переработка Пример анализа 2: Бумага на основе ELISA

  1. Добавить 5 мкл раствора, содержащего анти-CD9 первичного антитела 1: 1000 разбавление в PBS в каждую тестовую зону, содержащую отснятые электромобилей. Подождите 1 мин.
  2. Промыть образцов с 30 мл PBS, встряхивали при 100 оборотах в минуту в течение 30 сек.
  3. Добавить 5 мкл раствора, содержащего пероксидазу хрена (HRP) -связанной вторичного антитела в 1: 1000 разбавления в ФБР и подождите 1 мин.
  4. Промыть образцов с 30 мл PBS, встряхивали при 100 оборотах в минуту в течение 30 сек.
  5. Добавить 5 мкл колориметрический субстрат, содержащий 1: 1 объемное соотношение перекиси водорода ANd 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (TMB) и сканировать с помощью настольного сканера.

6. На выходе Анализ Пример 3: Выделение РНК

  1. Погрузите образцы в 35 мкл поливинилпирролидон на основе помощи выделения РНК и 265 мкл лизис / буфера для связывания лизировать электромобилей в плен. Vortex энергично.
  2. Добавить 30 мкл гомогената, представленную в изоляции комплекта к лизата. Вихревой энергично и помещали на лед в течение 10 мин.
  3. Извлечение РНК с использованием кислоты разделение фенола-хлороформа, описанной в следующих шагов.
    1. Взять 330 мкл фенол-хлороформом в нижнем слое бутылки и добавить в гомогенате / лизата. Vortex энергично.
    2. Центрифуга при 10000 х г в течение 5 мин. Передача водный (верхний) фазы в чистую пробирку и отмечают объем удален.
  4. Осадок тотальную РНК с 100% -ным этанолом в объеме, который 1,25-кратный объем водной фазы удалена на предыдущей стадии, и соllect РНК в элюции раствора, предварительно нагретую до 95 ° C.
  5. Концентрат и дальнейшей очистки РНК с использованием набора для РНК очистки в соответствии с протоколом изготовления.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Способность устройства бумаги, чтобы изолировать подгруппы электромобилей эффективно зависит от его высокой чувствительностью и специфичностью распознавания EV поверхностных маркеров. Стабильный модификация бумажных волокон с молекулами захвата достигается с помощью авидин-биоти?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Наиболее важные шаги для успешного выделения подгрупп внеклеточных пузырьков являются: 1) хороший выбор бумаги; 2) стабильное и высокий уровень охвата молекул захвата на поверхности бумаги волокон; 3) правильное обращение с образцами; и 4) общая лаборатория гигиены практика.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Тайваньского Национального научного совета grants- НСК 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) и НСК 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) и Генерального ветеранов Больницы и системы высшего образования Тайваня совместной программы исследований (CC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
EthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibodySystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent setBD Biosciences555214The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolation kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aidLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kitQiagen Inc.74004MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamberMarch InstrumentsPX-250
Scanning electron microscopeHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record systemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

Ссылки

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9(2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86(2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

98ELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены