В Ситу обнаружения бактерий внутри парафин тканей с использованием дигоксина меченных ДНК зонд таргетинга 16S рРНК

Резюме

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Аннотация

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Введение

Бактерии играют роль в этиологии различных заболеваний полости рта, такие как периодонтит, пульпит, перикоронит, целлюлит, и остеомиелита. Для того, чтобы понять роль бактерий в патогенезе заболевания и контролировать эффект лечения, локализации бактерий в ткани важно. Наличие бактерий в десневой ткани от пациентов с пародонтитом было показано, используя различные методы, в том числе электронной микроскопии ^1,2, иммуногистохимии и иммунофлуоресценции с использованием бактерий специфических антител ^3-7, и флуоресцентной гибридизации на месте (FISH) с использованием ⁸ флуоресцентные- помечены олигонуклеотидный зонд ориентации 16S рРНК. Тем не менее, эти методы не нашли широкого применения из-за технических ограничений или трудностей. По сравнению с антителами, зонды, нацеленные 16S рРНК легко производить и достижения видовой специфичности. РЫБЫ оказалась отличным инструментом для визуализации BactEria в своих природных условиях, таких как бляшки биопленки. Тем не менее, применение FISH образцы тканей ограничено из-за флуоресценции различных тканевых компонентов. Например, сильный флуоресценции красных кровяных клеток часто затрудняет применение флуоресцентной технологии в воспаленных тканях, когда они включают кровотечение ^9.

Для того, чтобы локализовать бактерии в воспаленных тканей десны, таким образом, на месте методом гибридизации с использованием дигоксигенина (DIG), меченным зондом ДНК была разработана и успешно применена ^10,11. Вот Подробный протокол для локализации бактерий в парафиновых срезах тканей с использованием P. gingivalis -специфические и универсальные эубактериальных зонды был описан. Это, в частности, направлены на стандартизацию метода, так что аналогичные результаты могут быть воспроизведены в других лабораториях. Этот протокол позволяет локализацию бактерий в их гистологического контексте и RESULTS высокой воспроизводимостью. Описанный протокол может быть использован для локализации бактерий либо в видоспецифических или универсальным образом в различных тканях. Универсальный датчик особенно полезен для обнаружения бактерий в Полимикробные заболеваний и изучить потенциальную роль бактерий при заболеваниях, где роль конкретных бактерий, не известно.

протокол

1. Зонд Подготовка

1. ПЦР-амплификация зонда
   1. Для P. gingivalis Определённые зонд, амплификации 343 п.н. фрагмента ДНК P. gingivalis 16S рРНК с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК из P. gingivalis и следующие праймеры: 5'ТГК AAC ТТГ ССТ TAC АГА GG-3 'и 5'ДЕЙСТВОВАТЬ ВКТ ВКТ УВД GCC ТАТ TC-3' ^10. Выполнение амплификации при следующих условиях цикла: 35 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 60 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 1 мин 20 сек с последующим расширением 5 мин при 72 ° C ^10,11.
   2. Усилить эубактериальный зонд с помощью 70-ВР (фрагмент ДНК, 5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') синтезировали, как олигонуклеотид, и следующих праймеров: 5'-CAG CTG ОТО СМТ GGY-3' и 5'-AGG GTT GTT GCG СТС-3 ^'11. Выполните уточнения при следующих условиях цикла: 40 цикловв 9 4 ° С в течение 30 сек, 60 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 1 мин 20 с последующим расширением 5 мин при 72 ° С ^11,12.
   3. Осадок ПЦР-продуктов (≥500 мкл) при добавлении 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 100% этанол (на 10: 1: 2 соотношение) и инкубировали при -20 ° С в течение 2 ч.
   4. Центрифуга смесь при 14000 х г в течение 15 мин, ресуспендируют осадок в 100 мкл ТЕ-буфера, и измеряют концентрацию ДНК по оптической плотности при 260 нм.
2. DIG-маркировки с помощью маркировки и обнаружения комплект DIG ДНК
   1. Смешайте 3 мкг зонда водой до конечного объема 15 мкл.
   2. Денатурации ДНК при 95 ° С в течение 10 мин и быстро охладить на льду.
   3. Добавьте 2 мкл 10х гексануклеотид смеси 2 мкл дНТФ-маркировки смеси и 1 мкл фермента Кленова до 15 мкл денатурированной ДНК.
   4. Смешайте и инкубируют при 37 ° С в течение 24 ч до 48 ч, а остановить реакцию при нагревании при 65 ° С.
3. Проверьте чувствительность DIG-меченного зонда, используя маркировки и обнаружения комплект DIG ДНК
   1. Ручная загрузка 1 мкл серийных разведений положительного зонда контроля, предусмотренных в комплекте и 1 нг DIG-меченым зондом на нейлоновую мембрану и сухой в течение 5 мин при комнатной температуре.
   2. Кратко пропитать мембрану в 2Х SSC-буфере (0,3 М NaCl, 30 мМ цитрат натрия, рН 7,0) и инкубируют мембрану при 80 ° С в течение 1 ч, чтобы иммобилизовать ДНК.
   3. Кратко пропитать мембрану в буфере малеиновой кислоты (MAB, 0,1 М малеиновой кислоты, 0,15 М NaCl, рН 7,5) и инкубируют с анти-DIG щелочной фосфатазы (AP) -conjugated антитела разводили (1: 5000) в 6 мл блокирующего раствора при условии в комплект при комнатной температуре в течение 30 мин.
   4. Промыть мембраны с MABT (МАВ, содержащего 1% Твин 20) и применить 40 мкл раствора NBT / BCIP смешивают с 2 мл буфера обнаружения (0,1 М Трис-HCl, 0,1 М NaCl, 0,05 М MgCl _2, рН 9,5) на Мембрана в течение 1 мин. Если чувствительность меченым зондом являетсяне удовлетворяет, повторите шаги с 1.1.3 до 1.3.4.
   5. Измерьте концентрацию ДНК меченого зонда (OD260) и регулировать концентрацию до 100 нг мкл ^-1.
4. Проверьте специфику DIG-меченным зондом
   1. Денатурации образцов геномной ДНК (25 нг 3 мкл ^-1 на каждый образец) из различных видов бактерий, в том числе бактерии мишенью конкретной зонда, при 95 ° С в течение 10 мин и быстро охладить на льду.
   2. Вручную загрузить денатурированной ДНК на нейлоновую мембрану и сушат в течение 20 мин при комнатной температуре.
   3. Кратко пропитать мембрану в 2Х SSC буфера и инкубируют мембрану при 80 ° С в течение 2 ч, чтобы иммобилизовать ДНК.
   4. Блок мембраны с блокирующим раствором при комнатной температуре в течение 1 часа.
   5. Развести зонд на 1 нг мкл ^-1 в гибридизации буфера, денатурации разводненной зондов, и применять на мембране.
   6. Инкубируйте мембраны при 45 ° С в течение 1 часа.
   7. Вымойте мембраны трираз с 2x SSC буфера.
   8. Кратко замочить мембраны в МАБ.
   9. Инкубируйте с анти-DIG AP-конъюгированного антитела, разбавленного (1: 2000) в 6 мл блокирующего раствора при комнатной температуре в течение 1 часа.
   10. Промыть мембраны с MABT и применить 40 мкл раствора NBT / BCIP смешивают с 2 мл буфера для обнаружения.
   11. Когда зонд не достичь ожидаемого специфичность, повысить температуру гибридизации, пока не наблюдается специфичность.

2. В гибридизация

Примечание: Чтобы избежать пересыхания образцов и реагентов, выполнять все инкубации в увлажненной камере выложены влажных бумажных полотенец.

1. Де-paraffinization и регидратация срезов
   1. Подготовка разделов толстые ткани 4 мкм от парафин блоков. Формалин, параформальдегид, и на основе цинка фиксатор совместимы с этим протоколом.
   2. Подготовьте все реагенты, используя DEPC обработке воды.
   3. Тепловые скользит в сушильном шкафу при температуре 60 ° С в течение 30 мин и инкубировать слайды при КТ в течение 30 мин.
   4. Погрузитесь слайдов в 100% ксилола в течение 5 мин в три раза; использовать свежий ксилол каждый раз.
      Примечание: У этой процедуры де-воском в химической вытяжкой.
   5. Погружают слайдов в 100% этаноле в течение 5 мин в два раза, с использованием свежих этанола каждый раз, и увлажняет образцов в последовательный 90%, 80% и 70% этанола решения в течение 5 мин каждый.
   6. Погружают слайдов в DEPC-обработанной воде в течение 1 мин и мыть слайдов в DEPC-обработанной PBS (рН 7,4) в течение 6 мин.
2. Предварительной обработки срезов тканей
   1. Погружают слайды в 0,1 N соляной кислоты в течение 20 мин и мыть слайдов в DEPC-обработанной воды в течение 30 сек.
   2. Нарисуйте гидрофобный барьер, окружающий образцы, используя восковую ручку.
      Примечание: Размер гидрофобного барьера зависит от размера образца. Таким образом, объемы реагентов, используемых в следующих стадий варьируют в зависимости от размера образцов, но должны заполнить HYdrophobic барьер (50 мкл для малых образцов и 400 мкл для больших образцов).
   3. Treat образцов с 50 до 400 мкл протеиназы К (от 1 до 10 мкг мл ^-1 в DEPC-обработанной PBS) в сушильном шкафу при 37 ° С в течение 30 мин и мыть слайдов в DEPC-обработанной 1x PBS в течение 1 мин.
   4. Замочите слайды в 4% параформальдегида в DEPC обработанной PBS в течение 10 мин, затем промыть слайдов в DEPC обработанной PBS в течение 1 мин.
   5. Замачивание слайды в 0,1 М триэтаноламин-HCl (рН 8,0), содержащего уксусный ангидрид 0,5% в течение 20 мин и мыть слайдов в DEPC-обработанной воды в течение 30 сек.
3. Гибридизация с зондом и мойки
   1. Погружают слайды в буфере 2Х SSC в течение 20 мин.
   2. Развести зонд на 1 нг мкл ^-1 в буфере для гибридизации (4x SSC, 50% [объем / объем] формамид, раствор Денхардта 1x, 10% [вес / объем] сульфат декстрана, 0,1% [вес / объем] додецилсульфат натрия, 0,4 мг мл ^-1 ДНК спермы лосося). Для отрицательных контролей, смешать меченого зонда с10-кратное избыточное количество немеченого зонда.
   3. Денатурации разводненной зонды и применять 50 до 400 мкл на срезах тканей. Поместите покровное на слайде и печать с лаком для ногтей.
   4. Тепловые скользит в ПЦР машины при 90 ° С в течение 10 мин и инкубируют скользит во влажной камере O / N при 45 ° С или оптимальной температуры определяется на этапе 1.4.11.
   5. Охладите слайды при 4 ° С в течение 30 мин, снять крышку скользит, и погрузиться слайды в последовательном SSC буфере, следующие: 4x SSC в течение 10 мин, предварительно нагретой (45 ° C) 2x SSC в течение 20 мин, 2x SSC в течение 10 мин и 0,2 x SSC в течение 10 мин.
4. Обнаружение анти-DIG AP-конъюгированных антител
   1. Вымойте слайдов в MABT в течение 5 мин.
   2. Блок с 50 до 400 мкл блокирующего раствора с 1% Твин 20 в течение 20 мин.
   3. Добавить 50 до 400 мкл анти-DIG-AP антитело, разведенное в блокирующем растворе (1: 1,000) anld инкубировать при 37 ° С в течение 90 мин.
   4. Вымойте слайдов в MABT в течение 10 мин.
   5. погружают слайдов в буфер обнаружения, содержащего 1% Твин 20 в течение 5 мин.
   6. Treat с 50 до 400 μ 1 мМ левамизол (в буфере обнаружения, содержащего 1% Твин 20) в течение 5 мин для инактивации эндогенного щелочной фосфатазы.
   7. Распределить 50 до 400 мкл предварительно смешанного раствора NBT / BCIP (разведенного в буфере обнаружения в масштабе 1: 100) на каждого образца и не инкубировать слайды во влажной камере при комнатной температуре в течение 2 до 3 ч до тех пор, разработаны сигнала является удовлетворительным.
   8. Промыть слайды с деионизированной водой, чтобы остановить визуализацию и применить от 50 до 400 мкл 0,05% [вес / объем] метиловым зеленым как счетчик пятно при 37 ° С в течение 10 мин.
   9. Промыть слайды с деионизированной водой, обезвоживают в 100% этанола, и погрузиться в ксилоле.
   10. Применить 80 мкл решение для монтажа на каждом слайде и накрыть покровных стеклах.

Результаты

Рисунок 1 показывает блоттинг из DIG-меченых зондов по сравнению с положительным зонда контроля, предусмотренных в комплекте, чтобы определить их чувствительность. 343 б.п. П. gingivalis-специфических зонда в 25 раз более чувствителен, чем 70 пар оснований эубактерий зонда. На р?...

Обсуждение

Вот протокол локализовать бактерии внутри парафиновых срезах тканей с использованием DIG-меченой ДНК, был описан. Зонд цели ДНК или РНК молекулы бактериального гена 16S рРНК и 16S-рРНК-нацеленные зонды могут быть выполнены в виде либо конкретных видов или универсальное. Специфической гибр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride	Sigma	6404
50% Dextran sulfate solution	Millipore	S4030
50X Denhardt’s solution	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG DNA labeling and detection kit	Roche	11 093 657 910
Formamide	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisole	Vector	SP-5000
Magnesium chloride	Sigma	246964
Maleic acid	Sigma	M0375
Methyl green	Sigma	M6776
Paraformaldehyde	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Salmon sperm DNA solution	Invitrogen	#15632-011
Sodium chloride	Sigma	S9625
Sodium citrate	Duksan	D1420
Sodium dodecyl sulfate	Amresco	227
Triethanolamine-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T