Внутримышечных инъекций по плитам двигателя End: Минимально инвазивная подход к Shuttle TRACERS Непосредственно в моторные нейроны

Резюме

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Аннотация

Болезни, влияющие на целостность спинного мозга двигательных нейронов являются одними из самых изнурительных неврологических заболеваний. За последние десятилетия, разработка нескольких моделей животных этих расстройств нервно-мышечных предоставил научное сообщество с различных терапевтических сценариев, направленных на затягивание или обратить вспять прогрессирование этих условиях. Воспользовавшись ретроградной техники нейронов, один из этих подходов в том, чтобы предназначаться скелетные мышцы для того, чтобы челночных терапевтических генов в соответствующие спинного мозга двигательные нейроны. Хотя когда-то перспективным, успех таких генов подхода доставка была затруднена суб-оптимальным количеством преобразованных двигательных нейронов, что до сих пор, показанных на выход. Со стороны двигателя пластины (MEPS) являются узкоспециализированными области на скелетной мускулатуры, которые находятся в непосредственном контакте с синаптической спинного мозга α моторных нейронов. В связи с этим, важно отметить, что до сих пор усилия, чтобы ретроградноГены передачи в моторных нейронов были сделаны без ссылки на положения региона MEP в целевых мышцах. Здесь мы опишем простой протокол 1), чтобы показать точное местоположение Европарламента на поверхности скелетных мышц и 2) использовать эту информацию, чтобы направлять внутримышечной доставки и последующего оптимального ретроградного транспорта ретроградных индикаторов в моторных нейронов. Мы надеемся, что использовать результаты этих экспериментов розыска в дальнейших исследованиях в расследовании ретроградного транспорта терапевтических генов в нейронах спинного мозга двигательных через адресности Европарламента.

Введение

Потеря контроля добровольного движения, что приводит от неврологических заболеваний, таких как болезни двигательных нейронов и spinal-, а также мышечной атрофии Дюшенна является изнурительных условие, которое имеет высокую и длительную влияние на каждый день жизни пострадавших лиц. За последнее десятилетие, научно-исследовательские усилия, направленные, чтобы остановить или, по крайней мере задержать пагубные последствия этих нервно-мышечными заболеваниями была приоритетом для многих клиницистов и ученых по всему миру. В связи с этим, в последнее поколение животных моделях, которые имитируют эти нервно-мышечных заболеваний играет важную роль в получении фундаментальных понимание физиологических механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования этих условиях ^1-13. Лечение этих нервно-мышечных заболеваний требует прямого доступа к спинного мозга и может быть достигнуто путем инъекций спинного мозга ^14,15. Последние достижения в области генной терапии также направлены поперечно-полосатой мышцы верхней инижние конечности челночной терапевтических генов к соответствующим α двигательных нейронов, которые расположены в вентральном роге спинного мозга ^1,9-13. Тем не менее, в этот раз перспективной стратегией не удалось улучшить результат этих неврологических заболеваний. В то время как это справедливо заключить, что эти бедные результаты могут быть, по крайней мере, частично, быть связано с низкой эффективности этих защитных генов, нельзя исключать низкую эффективность этих методов доставки генов.

Со стороны двигателя пластины (MEPS) специализированные регионы скелетных миофибрилл, которые отступом от аксонов терминалов крупных периферических двигательных волокон, происходящих из α моторные нейроны. Вместе периферийные окончания нервных волокон и депутаты Европарламента образуют нервно-мышечного соединения, то есть место, где синаптические импульсы вызваны антероградной выпуска нейротрансмиттера ацетилхолина,. Важно отметить, что отношения между периферических нервных волокон и MEPs би-Direcных, хотя различные двигатели отвечают за переноса молекул и органелл к, а также от нейрона somata ^16-18. В свете этих соображений анатомических, депутаты Европарламента, кажется, быть целями выбора для доставки и последующего ретроградного транспорта генетического материала в соответствующих моторных нейронов. В этом контексте, это не удивительно, что успех двигательного нейрона трансдукции в значительной степени зависит от расстояния между внутримышечной инъекции вирусных векторов и Европарламента мышцы в ^19-20. Удивительно, однако, точное расположение инженерных зон на миофибрилл в лабораторной крысы и мыши, два вида выбора модели нервно-мышечных заболеваний, не были доступны до недавнего времени.

Мы подготовили подробные карты региона MEP в течение нескольких мышц передних конечностей у крыс и мышей ^21-22. Совсем недавно мы показали, детали организации MEP гEgion в течение нескольких мышц задней конечности мыши ^23, и мы в настоящее время анализа особенностей Европарламента на крыс задней конечности. В наших руках, внутримышечные инъекции ретроградных индикаторов, направленных на целых зон инженерных в этих мышц привело к более меченых мотонейронов, которые, охватывающих более сегментов спинного мозга, чем сообщалось ранее. Здесь мы представляем протокол, который был разработан в течение последних нескольких лет, чтобы выявить расположение Европарламента по внешней поверхности, а также по всей глубине задней конечности и передних конечностей мышцы как мыши и крысы.

протокол

Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, выполнил уход и комитет по этике животных в Австралии и UNSW были проведены в соответствии с Национальным здравоохранения и Совета по медицинским исследованиям Австралии правил экспериментов на животных. Все процедуры в этом протоколе должны быть выполнены в соответствии с требованиями соответствующего ухода за животными и комитет по этике.

1. Ацетилхолинэстераза Гистохимический Окрашивание

1. Подготовка ацетилхолинэстеразы реакционной смеси
   1. Добавить 290 мг иодида Acetylthiocholine к 200 мл 0,1 М фосфатном буфере (PB). Смешайте с помощью магнитной мешалки при 900 оборотах в минуту.
   2. Добавить 600 мг глицина при непрерывном перемешивании.
   3. Медленно добавляют 420 мг сульфата меди к реакционной смеси при непрерывном перемешивании, пока продукт не растворится полностью.
2. Снимите кожу туши животного (полученный путем обмена тканей), сделав надрезыв коже перфузии крысы или мыши, схватив кожу от области шеи и тянет его мимо его ног. Убедитесь, что панель, покрывающую каждый мускул либо удалены или значительно перфорированной, чтобы обеспечить достаточное воздействие мышечных волокон к реакционному раствору.
3. Погружают все тело или конечность интерес к реакционной смеси и инкубируют O / N при 4 ° С.
4. Промыть тушку в течение 2 мин в дистиллированной воде. Примечание: На этом этапе, мышцы обладают синее окрашивание и конечные двигателя пластины (MEPS) можно рассматривать как белые точки.
5. Expose тушу на 10% раствора сульфида аммония в течение 3-5 сек.
   Примечание: мышечные волокна будут быстро буреют и депутаты Европарламента будет наблюдаться как черные пестрыми точками. Если реакция происходит слишком быстро, и мышечные волокна окрашивают слишком темным, чтобы различать MEPs и мышечных волокон пытаются использовать более низкие концентрации раствора сульфида аммония (например, 5%). Время реакции, чтобы получитьоптимальный контраст между MEPs и мышечных волокон изменяется от одного образца к другому. Поэтому трудно определить точное время экспозиции реагента. Реакция должна быть тщательно контролируется и остановился, когда контраст считается адекватным.
6. Вымойте тушку два раза, при перемешивании на дистиллированной воде и осторожно промокните насухо каркаса.
7. Фотография оба боковые и медиальные аспекты конечности, гарантируя, что депутаты Европарламента для всех мышц интерес в плен.

2. Внутримышечные инъекции в пластинах двигателя End

1. Потяните стеклянных микропипетки с микропипетки съемник (использование градуированных микропипеток с плунжерами рекомендуется). С помощью вскрытии микроскопом, разбить кончики микропипетки с парой щипцов, так что внутренний диаметр просвета микропипетка примерно 0,5 мм.
2. Убедитесь, что все хирургические инструменты, используемые свеже в автоклаве и йв хирургическом области стерильна.
3. Заполните микропипетки с фтор-Gold (5% в дистиллированной воде).
4. Вызвать обезболить у животного в индукционной камере с изофлуораном (4% в O _2). Проверьте рефлекса и обеспечить его отсутствие перед удалением его из камеры индукции. Безопасный носовой конус над мордой крысы и доставить изофлуораном (2% в O ₂₎ для поддержания анестезии. Зажмите пальцы животного и аккуратно трогать глаз животного, чтобы убедиться, что оба педали изъятие и роговицы рефлексы отсутствуют. Примечание: Смесь кетамина и xylazil также может быть использован (80 и 10 мг / кг, соответственно, поставляться внутрибрюшинно). Кетамин Расписание 8 ("Контролируемые") наркотиков и необходимые протоколы, связанные с покупкой, использования, хранения и утилизации препарата должны быть соблюдены.
5. Применение смазки глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз в ходе процедуры.
6. Бритье тargeted конечностей и использование марли, чтобы протереть бритая площадь с трех чередующихся скрабы хлоргексидина и 70% спирта. Передача животное хирургической области.
7. Поместите животное на чистую лежащей снизу и расположить его должным образом, чтобы гарантировать хороший доступ к адресной мышцы (ов).
8. Используйте пару щипцов с захватами зубов, чтобы снять кожу за целевым мышцы от основной мускулатуры и сделать надрез в коже с хирургическими ножницами. Убедитесь, что разрез является достаточно большим, чтобы полностью раскрыть мышцы (ы), представляющий интерес. Убедитесь, что есть минимальным ущербом для фасции.
9. Используйте фотографии MEP мысленно перенести расположение и форму области MEP на мышцы (ов).
   Примечание: в порядке войлок маркер может помочь воспроизвести область MEP из фотографии на мышцы (ов), представляющие интерес.
10. Выполнение многократных инъекций по всей длине области MEP (для фтор-Gold, от 3 до 4 инъекции 1-2 мкл каждого Should быть достаточно). Аккуратно протрите мышцы (ы), чтобы удалить просачивание.
11. Принесите два концы надрезанные кожи близко друг к другу с тупыми щипцами и закрыть рану хирургических зажимов. Инфильтрат 0,1 мл бупивакаина (0,5% в воде) (или другие местные анестетики) вдоль всего периода раны.
12. Поверните обезболивающий машину и контролировать животное, пока оно не будет полностью оправился от наркоза.
13. Подождите в течение 14 дней между администрацией внутримышечных инъекций и перфузии животных.

3. перфузии

1. Администрирование смертельную дозу пентобарбитоном раствора натрия (например Lethabarb; 150 мг / кг) животному путем внутрибрюшинной инъекции.
   1. Тщательно контролировать животное, пока глубокий уровень анестезии не будет достигнуто, как это было подтверждено отсутствие педали вывода и роговицы рефлексы.
2. Расположите животное на спину на вскрытии борту помещенном над perfusioп раковина.
3. Используйте пару щипцов с помощью ручек зубных поднять кожу, покрывающую основание грудины. Сделайте небольшой разрез кожи с парой сильных хирургическими ножницами сразу ниже грудины, а затем использовать щипцы для захвата мечевидного хряща грудины. Удерживая мечевидного хряща, увеличить разрез на обеих сторонах грудной полости, от грудины к области подмышек.
4. Вырезать диафрагму выставить сердце.
   1. Вводят 0.ml гепарина непосредственно в верхушке сердца, чтобы предотвратить свертывание крови.
   2. Вырезать вершины, чтобы позволить вставку канюлю в левый желудочек, а затем быстро зажим канюлю на месте с помощью haemostat.
   3. Сделайте надрез в правом предсердии с парой тонких ножниц и немедленно начать перистальтического насоса. Заливать 0,1 М PB, пока жидкость течет из предсердия не является почти свободным от крови и цвет печени становится светло-коричневого цвета. Затем, заливать с Солуние параформальдегида (4% в 0,1 М PB) до всего тела животного становится жесткой.

4. шейного отдела спинного мозга Препарирование и подготовка к гистологии

1. Положите тушку животного на его животе.
2. Порезать кожу на средней линии тела скальпелем и отражают его от основания черепа до уровня подвздошной кости.
3. Разрезать и отражают паравертебральных мышц, чтобы разоблачить спинной части позвоночного столба.
4. Определить костный остистый отросток Атласа, второго шейного сегмента (т.е., C2), и снимите его с парой хирургических щипцов или кусачек, чтобы найти соответствующие лежащие в основе корень спинной.
   1. Определить правильный корень C2 по окраске его постоянного войлочной маркера.
   2. Удалить следующий позвонков по одному и отметьте правильные спинной корни с чередованием цвета (то есть, С2, С4, С6, С8 и могут быть окрашены в зеленый и С3, С5, С7, T1 может быть колонкаORed синим цветом).
5. С помощью небольшой хирургическую иглу (например, 30 G игла) осторожно прокалывают через твердой мозговой оболочки, покрывающей нижний конец спинного мозга. С скос иглы вверх, поднимите твердую мозговую оболочку от мозга во время перемещения иглы рострально сделать продольный разрез.
   1. Отражение твердую мозговую оболочку.
6. Вырезать спинного мозга трансверсально в одно- или двух-сегмента блоков с новым лезвием скальпеля.
   1. Оставьте сегментов спинного мозга в месте, и для каждого блока, тщательно сделать небольшой FIDUCIAL знак на левой стороне каждого блока с лезвием скальпеля полпути между двумя соседними корнями. Убедитесь, что доверительное знак достаточно глубоко через ткань, чтобы быть видимым от вентральной блоков. Сделать отметку нулевых точек под углом приблизительно 45 °, указывая либо спереди или сзади по отношению к анатомии животных, чтобы помочь в ориентации участка ткани следующим вскрытия.
7. Сбор отдельных блоков в маленькие, четко обозначенные как флаконы, содержащие раствор параформальдегида (4% в 0,1 М PB) и оставить при комнатной температуре O / N.
8. Передача блоков в чистые, четко обозначенные бутылок, содержащих раствор сахарозы (30% в 0,1 М PB) и держать при температуре 4 ° С в течение не менее двух дней.
9. Поместите сегменты в крио-форм и покрыл их среде замораживания тканей. Для продольной гистологического препарата, ориентировать блоки с дорсальной вверх и использовать в качестве координатной знак ориентироваться блок в крио-форм.
10. Замораживание крио-формы при температуре -20 ° С и сократить с помощью криостата в 50 мкм толстых секций. Примечание: секции могут устанавливаться непосредственно на адгезию микроскопа и оставляют сохнуть O / N. Кроме того, участки можно плавал в 48-луночных планшетах, заполненных 0,1М ПБ, а затем монтируется с помощью FIDUCIAL знак ориентироваться срезах тканей на слайдах.

5. поясничного отдела спинного Сой Вскрытие и подготовка к гистологии

1. Положите тушку животного на заднюю.
2. Выполните срединный разрез вдоль живота животного и удалить внутренности. Рассеките из мышцы задней брюшной стенки, чтобы разоблачить вентральной части позвоночного столба.
3. Найдите короткий хвостовой-самых ребро и прилегающих к нему T13 позвонка, где Т13 брюшной корень выходит из кости.
   1. Последовательно удалить по одному на два или три позвонка ростральнее Т13 (т.е. T12, T11 и, при необходимости, Т10) с мелкими хирургическими кусачек не следовать T13 вентральной корень до его точки входа в вентральной части брюшной мозг и пометить его с постоянным войлочной маркера.
   2. С этой точки зрения, повторите ту же процедуру, чтобы определить расположение точек вентральной корень входа для L1, L2, L3, L4, L5, L6 и S1, окраска их с разными цветами.
4. Выполните ту же процедуру, как описано в разделе 4.5-4.10 для люмбар спинного рассечение шнур.

Результаты

Ацетилхолинэстеразы гистохимические окрашивание показывает расположение конечных двигателя пластин по ширине мышц. Рисунок 1 иллюстрирует результаты такого окрашивания выполненной по целому крыс передней конечности. Предлагается оптимизировать концентрацию раствора сул...

Обсуждение

Внутримышечное таргетинг и последующее ретроградная передача терапевтических трансгенов в соответствующих α моторных нейронов для экспериментального лечения нервно-мышечной состоянии не новая стратегия. Например, этот способ доставки был использован для задержки нервно-мышечную ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%