Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Резюме

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Аннотация

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Введение

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) генерирует изображение поверхности путем сканирования через область образца с помощью кантилевера с очень острым наконечником ^1. Движение кантилевера зондов топологии поверхности образца. АСМ широко применяется для биологических молекул - в том числе белков, ДНК и мембран, благодаря своей универсальности в анализе основных образцов в воздухе или вблизи родного государства в жидком ^2-5.

Помимо своей способности изображения с высоким разрешением в нанометровом диапазоне, консольные АСМ действует как пружина, чтобы исследовать силы взаимодействия (адгезионные и отталкивания) и механические свойства образца ^5,6. Это известно как силовой спектроскопии. В этом режиме датчик первая подходы образец и оказывает силовое воздействие на него, а затем втягивается, пока он не теряет контакт с образцом (фиг.1А). Сформированные кривые показывают силы как функции расстояния от кантилевера, как для приложенияплотва и отвод. Некоторые свойства, включая модуль упругости для измерения жесткости материала, и силы адгезии могут быть получены.

Поддерживаемые липидных бислоев биологические модели мембраны, лежащие на верхней части твердой подложке - обычно слюда, боросиликатное стекло, плавленый кварц, или окисленного кремния ^7. Они готовятся с использованием различных методов, как осаждения везикул, метод Ленгмюра-Блоджетт и спин-покрытия ^8,9. АСМ была использована, чтобы следовать за формирование этих поддерживаемых бислоев ^10, и зонд различные структуры, образованные мембранами различных композиций ^11-15.

Выполнение силовой спектроскопии на поддерживаемых Бислои результатов в пик на кривой подхода. Этот пик указывает на усилие, необходимое для прокалывания бислой, и называется прорывом силой. Толщина бислой можно также измерить с помощью силы кривая ^6. Типичный прорыв сила бислоямиДиапазон между 1-50 NN ^6. Эти свойства зависят от липидного упаковки (жидкостью или гелем фаза) и структуры (ацил длины цепи и степени ненасыщенности) и изменено мембранных-активных веществ ^16. Теория за разрыва было объяснено ¹⁷ и другие экспериментальные параметры, такие как консольной мягкости, радиус наконечника и скорости захода на посадку также влияют на прорыв силу ^15,16,18. Сила спектроскопии был использован для анализа свойств различных фаз липидов, состав ^{11,19-зависимой} изменений ^12,20, а также влияния других биомолекул, таких как пептиды, на стабильность мембраны ^21.

Плоская ориентация поддерживаемых бислоев выгодно для объединения АСМ с другими методами, такими как поверхностный плазмонный резонанс ²² и флуоресцентной микроскопии ^11,19, чтобы лучше охарактеризовать структуру и свойства мембран.

Это подробное видео протокол предназначен для подготовки поддерживаемые бислоев путем осаждения везикул и анализировать их с АСМ и силовой спектроскопии. В то время как пузырьки различных размеров могут быть использованы для получения двойных слоев, этот протокол фокусируется на малых и больших однослойных везикул. Поддерживаемые бислои, что разделение фаз в жидкость приказал (Л _О) и жидких (неупорядоченных L _D) фазы характеризуются ^11,15. Мембрана состоит из ди-олеоил-фосфатидилхолина (DOPC), сфингомиелина (SM), и холестерина (Хол) в 2: 2: 1 отношение. Эта композиция модели липидные рафты, которые предлагаются для себя в качестве платформ для торговли важных белков и сортировки, клеточной сигнализации и других клеточных процессов. ^23,24

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка поддерживаемых липидного бислоя (SLB) ^11,12,21

1. Подготовка смеси липидов и многослойные везикулы, суспензий
   1. Подготовьте следующие буферы заранее.
      1. Подготовка PBS буфера при концентрациях 2,7 мм KCl, 1,5 мМ KH ₂ PO _4, 8 мМ Na ₂ HPO _4, и 137 мм NaCl, рН 7,2.
      2. Подготовьте SLB (поддерживаются липидного бислоя) буфере при концентрации 150 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, рН 7,4.
      3. Приготовьте раствор 1 М CaCl _2.
   2. Растворите следующих липидов в хлороформе в желаемой концентрации, например, ди-олеоил-фосфатидилхолин (ДОФХ) при 25 мг / мл, сфингомиелина (SM) в дозе 25 мг / мл и холестерин (Чхором) в дозе 10 мг / мл.
   3. Возьмите 18,38 мкл ДОФХ 17,10 мкл SM и 11.30 мкл Чхоль, чтобы решение с 1 мг общих липидов в 2: 2: 1: ДОФХ молярном соотношении Чхоль: SM. Вары объемы соответственно на основе Concentrations липидов, полученных в 1.1.2. Тем не менее, поддерживать молярное соотношение в 2: 2: 1: SM DOPC: ХОЛ, так как изменение молярное соотношение будет меняться фазовые характеристики мембраны ^25.
   4. Смешайте раствор полностью встряхиванием. Добавить флуоресцентный краситель на липидный 0,05 мольных%, если мы хотим визуализировать бислой путем флуоресцентного микроскопа.
      Примечание: семейство длинноцепочечных dialkylcarbocyanines, как сделал, DiI и DiO охватывают широкий диапазон длин волн, и может быть идеально используется для обозначения липидные мембраны. В качестве альтернативы, флуоресцентно меченных липидов, такие как родамин-фосфатидилэтаноламин или BODIPY-холестерина может быть использован. В любом случае, концентрация красителя должен быть оптимизирован в соответствии с настройкой микроскопии, имея в виду, что высокие концентрации флуорофора, связанного с липидами могут изменить липидный поведение ^19.
   5. Вытрите хлороформ, используя N ₂ газа (или любой доступный инертный газ, такой как Ar и He).
   6. Кроме того сухой тон липидной смеси в вакууме в течение по крайней мере 1 часа.
      Примечание: При хранении этого липидной смеси, удаления воздуха инертным газом _(N2, Ar или He) и хранят при -20 ° С. Алиготе избыток липидов в хлороформе-в небольших коричневых флаконах. Сушат их в аналогичным образом, как липидной смеси, вытеснять воздух инертным газом _(N2, Ar или He) и хранят при -20 ° С.
   7. Растворите высушенных липидов в PBS буфере до концентрации 10 мг / мл.
   8. Вихревой смесь энергично в течение приблизительно 20 секунд до 1 минуты, чтобы получить мутной суспензии, содержащие многослойные везикулы. Убедитесь, что нет липидные пленки прилипать к бокам флакона.
   9. Распространение этой суспензии в 10 мкл аликвоты (1 мг липида составляет 10 аликвот).
   10. Хранить при -20 ° С до дальнейшего использования.
2. Подготовка однослойные везикулы
   Примечание: Различные размеры однослойные везикулы могут быть получены с использованием метода ультразвуковой обработки или методом экструзии. Озвучивание использует Sкруглый энергии перемешивание смеси и отделить слои многослойного суспензии. Об этом свидетельствуют прояснения туманной подвески. Экструзия заставляет многослойные везикулы пройти через мембранный фильтр с определенным размером пор.
   1. Метод Озвучивание
      1. Возьмите 10 мкл суспензии многослойных липидных и добавить 150 мкл буфера SLB.
      2. Передача смесь в небольших (2 мл) крышками стеклянных флаконах и печать с парафильмом.
      3. Разрушать ультразвуком смесь при комнатной температуре в ванне для обработки ультразвуком в течение 10 мин или пока не станет ясно, чтобы давать небольшие однослойные везикулы (SUV, ниже 50 нм в диаметре).
   2. Экструзионная Метод
      1. Возьмите 10 мкл суспензии многослойных липидных и добавить 150 мкл буфера SLB.
      2. Передача суспензии в криогенной трубе.
      3. Замораживание липидную суспензию путем погружения в криогенную трубу в течение нескольких секунд в жидкий азот.
      4. Оттепельлипидную суспензию путем погружения в криогенную трубу на водяной бане при комнатной температуре или 37 ° С в течение нескольких минут. Повторите шаги замораживания-оттаивания, по крайней мере в 10 раз.
      5. Для того, чтобы экструдировать липидную суспензию, используют поликарбонатную мембрану с размером 200 нм пор (другие размеры пор доступны, как, 100 нм или 400 нм) и коммерческий экструзии устройство ^26.
         Примечание: В настоящее время существует два экструдера устройства коммерчески доступны: ручной экструдер для малых объемов (200 мкл до нескольких мл). В этом случае образец подвергают экструзии через мембрану вручную нажатием подвеску туда и обратно между двумя шприцами. В зависимости от производителя, липидов аликвоты должны быть объединены, чтобы достичь минимального объема настроить. Для больших объемов (до 50 мл) и более сложные устройства используются, в котором суспензию продавливают через поликарбонатную мембрану с помощью сжатого газа. Установка и экструзионные условия могут меняться в зависимости от модаэль. Перед использованием обратитесь к инструкции от производителя. Этот протокол относится к ручной экструдер для небольших объемах.
      6. Равновесие экструдера в воде при прохождении воды через экструдер. Погрузите мембрану в воду.
      7. Поместите мембрану между двумя поршнями, собрать устройство и уравновешивают в буфере, пропусканием буфера через экструдер, из одного шприца в другой. Этот шаг позволяет дополнительно тестирования неплотности системы. Если он попадает, разобрать и собрать его снова изменения мембраны.
      8. Возьмите липидную суспензию, используя один шприц экструдера ("грязная сторона").
      9. Прикрепите шприц, содержащий липидную суспензию на одной камере и пустой шприц на противоположной камере.
      10. Нажмите шприц на одном конце. Pass раствор через мембрану и в противоположной шприца. Это ^1-й проход.
      11. Передайте это через мембрану в общей сложности 31 раз такихчто решение заканчивается на противоположной шприца ("чистой стороне ').
          Примечание: Проверьте мембрану после экструзии. Если была нарушена, то процесс экструзии не был успешным, и должен быть повторен.
      12. Опорожнить шприц в трубочку. Большие однослойные везикулы (БУВ) стабильны в течение 1-2 дней при хранении при 4 ° С.
3. Подготовка Mica и покровные
   1. Промыть покровные сначала в воде, а затем в этаноле. Воздушная сушка.
   2. Возьмите слюды диски и шелушиться внешний слой с помощью клейкой ленты.
   3. Прикрепите слюды диск на покровное. Прозрачные оптические клеи являются оптимальными, так что можно проверить бислои с флуоресцентным микроскопом.
   4. Прикрепите пластиковые цилиндры (2,5 см Наружный диаметр 2 см внутренний диаметр, и 0,5 см высоты), используя оптический клей / смазку. Убедитесь, что все запечатаны, и что нет никаких утечек. Используйте смазку, когда требуется повторно использовать цилиндры, поскольку они могут быть легко отделены от йе покровное и промывают. Размеры пластиковых цилиндров зависит от размера держателя кантилевера АСМ и должны быть соответствующим образом скорректированы.
4. Нанесение однослойных везикул на твердом носителе
   1. Внесите вся липосомы решение непосредственно на слюду. Добавить еще SLB буфер для достижения объема 300 мкл.
   2. Добавить 0,9 мкл 1 М раствора хлорида кальция, чтобы достичь конечной концентрации 3 мМ Ca ^2+.
   3. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 мин, а затем при 65 ° С в течение не менее 10 мин. Всегда покрытия бислоев буфером. Связаться с воздуха и воздушных пузырьков будет уничтожить его. Во время инкубации, добавить больше буфера, если это необходимо, особенно если инкубации при более высоких температурах.
      Примечание: температура инкубации варьироваться в зависимости от липидных смесей и фаз требуется. Время инкубации, по крайней мере, 10 мин необходим, чтобы сформировать поддерживаемые бислоев, но это может быть больше, в зависимости от температуры и состава.
   4. Мытьдвухслойная с горячей (65 ° С) SLB буфера в 15-20 раз для удаления кальция и неслитых пузырьки. Будьте особенно осторожны во время этапов промывки, чтобы сохранить бислой под буфер и осторожно пипеткой моющий раствор, чтобы избежать уничтожения бислой.
   5. Классные поддерживаемые бислои до комнатной температуры перед АСМ. Это необходимо для формирования различных фаз мембраны, а также свести к минимуму тепловой дрейф в приборе.

2. Атомно-силовая микроскопия Измерения ^11,12

1. Изображений
   Примечание: Выполнение микроскопии изображений атомно-силовой контакт в режиме или режиме, нажав. Поддерживаемые графические бислои в растворе; не позволяют раствор испаряется полностью, как это будет уничтожить бислои. Как и следовало работать с буфером, пожалуйста, соблюдайте меры предосторожности при убедившись, что любая часть АСМ защищен от пролитой жидкости.
   1. Выберите мягкую консоль (ниже 0,2 Н / м пружины рекомендуется) и установите его на тон АСМ. Выбор жесткость кантилевера является более важным для силовой спектроскопии (и это будет обсуждаться позже).
   2. Установите образец на этапе АСМ и убедитесь, что все модули вибрации изоляции включены. Подождите, по крайней мере, 15 мин, чтобы уравновесить и уменьшить температурный дрейф системы. В зависимости от AFM установки, настройки и визуализации характеристики могут различаться. Проконсультируйтесь руководство производителя.
   3. Подход образца с иглы АСМ до контакта.
   4. Так липидных двойных слоев, как правило, 4 нм в высоту, используйте Z-диапазон инструмента, который даст наибольшее Z-разрешение (например 1,5 мкм).
   5. Выберите регион к изображению. Чтобы получить представление о липидного бислоя, 50 мкм х 50 мкм или 25 мкм х 25 мкм область будет хорошей отправной точкой для изображения. Если появляются мелкие особенности, одна CAN изображения в небольших районах (10 мкм х 10 мкм, или 2 мкм х 2 мкм). Выбор области изображения также зависит от рабочей тAnge пьезоэлектрического сканера. Пожалуйста, обратитесь к руководству инструмент для этого.
   6. Как бислои очень хрупкие, регулировать уставку наконечника AFM во время съемки, чтобы сохранить силы на минимум и правильно для теплового дрейфа, сохраняя контакт с образцом. В контактном режиме, минимизировать уставки. В режиме разговоров, максимально уставки.
   7. Изображения процесса по установке каждую строку сканирования для полиномиальных функций выравнивания. Выполнить удаление строки для сканирования, которые теряют контакт с мембраной, используя собственное программное обеспечение производственного АСМ компании.
2. Силовая спектроскопия
   1. Калибровка кантилевера, следуя инструкциям в соответствии с протоколом производителя. Калибровка позволяет преобразование электрического сигнала фотодиодов с силой (фиг.1В).
      1. Калибровка чувствительности кончика к измерению отклонения как движение г-пьезо (в единицах длины) вместо электрического сигнала в вольтах.
         Примечание: АСМ обнаруживает изменения в изгиба кантилевера с помощью лазера отражается от задней части консоли. Лазер достигает фотодиода, который может пространственно определения положения лазерного пятна. Изменение изгиба кантилевера, как она изгибается при контакте с образцом обнаруживается этом фотодиода как "вертикальным отклонением", и это в единицах напряжения. Поскольку консольные перемещается по оси Z пьезо, вертикальное отклонение связано с движением в Z-пьезо. Соотношение между вертикальным отклонением и г-движения называют чувствительность и преобразует напряжение на расстоянии.
      2. Вычислить консольные жесткости пружины методом теплового шумы, как правило, включены в программное обеспечение АСМ. В этом методе, участок амплитуду вибрации от шума по отношению к частоте колебаний, создавая плотность мощности участок спектра. Этот участок будет показывать пик около резонансной частоты. Частота, на которой амплитуда яS большой резонансная частота. Установите функцию лоренцевскую вокруг пика для автоматического расчета жесткость пружины с помощью программного обеспечения. Некоторые полезные ресурсы для теории метода теплового шума приведены в ссылках ^27-30.
   2. После визуализации площадь бислоя, выберите х 5 мкм область 5 мкм бислоя для выполнения силовой спектроскопии.
   3. Настройте АСМ так, что она занимает кривые силы в 16 х 16 сетке этом регионе. Это приводит к 256 кривых силы в регионе. Пространство между двумя соседними точками должно быть достаточно, чтобы избежать площадь мембраны зондируемой одной точки будет совпадать со следующей точки. Это зависит от радиуса вершины. 100 нм Расстояние между двумя точками будет идеальным. Разделите х 5 мкм 5 мкм регион в 16 х 16 сетке. В зависимости от размера фазе, можно выбрать меньшую или большую область, а затем отрегулировать размер сетки, соответственно.
   4. Установите г-пьезо смещение в400 нм. Это определяет максимальный диапазон движения г-пьезо. Он должен быть достаточно большим, чтобы убедиться, что консольные полностью отказался от образца между измерениями.
   5. Установите скорость захода на посадку до 800 нм / сек и скорость втягивания 200 нм / сек. Использование скорость захода на посадку между 400 до 6000 нм / с в зависимости от состава бислой и липидную фазу, чтобы быть изучены ^6,16.
   6. После настройки всех параметров, приобретать кривые силы, нажав на кнопку "Выполнить" программного обеспечения АСМ.
   7. Сохранить кривые силы, как силы против кривых высота (мера движения г-пьезо). Это не принимает во внимание изгиб кантилевера в контакте с образцом. На этапе обработки данных, программное обеспечение АСМ позволяет коррекцию изгиба кантилевера, чтобы получить силу против кривых расстояния зонд-образец (рис 1в), которые дадут правильные значения для толщины бислоя. Значения поправок, как правило, включены в Calibrвания, которая сохраняется с каждой кривой силы. Рассчитать расстояние зонд-образец путем вычитания вертикальное отклонение от движения пьезо в данной точке.
      Примечание: Пик на кривой подход силы (сила значение снижается, даже если движение кантилевера еще на цикле подход) является прорыв сила мембраны, в то время как разница между положением пика и положением точки где сила начинает расти снова обеспечивает толщину мембраны.
   8. Приобретать по крайней мере, 500 кривые силы для каждого состояния, чтобы получить хорошую статистику. Постройте гистограмму значений с помощью таких программ, как происхождения или MatLab, и подходят гистограммы для распределения Гаусса, чтобы получить пик и ширину распределения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Поддерживаемые липидных бислоев, состоящие из DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) были обследованы в АСМ (Фигура 2 переменного тока). Из-за липидной композиции, наблюдались СМ / Чхор богатых L _O и ДОФХ богатые L _D фазы. Высота профиля от АСМ может предоставить важную информацию о структуре м?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

SLBS состоящие из DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) были сформированы на слюде после везикул адсорбции и разрыва, индуцированного хлоридом кальция. Это липидный состав разделяется на _L D и L _O фаз. Л _О фаза обогащается сфингомиелин и холестерина и меньше жидкости / более вязким (1А), че...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
[header]
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200