Упрощенная система для оценки клеточной Mechanosensing и Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

Резюме

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Аннотация

Состав и механические свойства внеклеточной матрицы сильно различаются между типами тканей. Это соединительной ткани стромы разнообразие значительно влияет поведение клеток регулировать нормальные и патологические процессы, включая пролиферацию клеток, их дифференциации, адгезии сигнализации и направленной миграции. В связи с этим, врожденная способность некоторых типов клеток мигрировать в направлении жесткой, или менее совместимый подложке матрицы обозначается как durotaxis. Это явление играет важную роль во время эмбрионального развития, заживления ран и инвазии раковых клеток. Здесь мы опишем простой анализ для изучения durotaxis, в пробирке, используя полидиметилсилоксановые (PDMS) субстратов. Подготовка описанный durotaxis камер создает жесткость интерфейс между относительно мягкой PDMS гель и жесткой покровного стекла. В приведенном примере мы использовали эти durotaxis камеры, чтобы продемонстрировать роль для Cdc42 / Rac1 ГТФ активации PROTEв, cdGAP, в mechanosensing и durotaxis регулирования в человека U2OS клеток остеосаркомы. Этот анализ легко адаптируется к другим типам клеток и / или нокдаун других белков интересов, чтобы исследовать их соответствующие роли в mechanosignaling и durotaxis.

Введение

Внеклеточный матрикс (ЕСМ) состоит из сложного набора структурных и сшивающих белков, включая коллаген, фибронектин и ламинин. Хотя это хорошо известно, что ЕСМ обеспечивает важную структурную поддержку для сотовых тканей, появляется все больше доказательств, чтобы указать, что клетки активно реагировать на изменения физических в их среде ECM регулировать различные клеточных процессов, включая выживаемости клеток, дифференциации и миграции клеток. Например, различия в жесткости ECM может управлять мезенхимальные стволовые клетки к различным линий, с мягкими подложками (~ 1 кПа), способствующих нейрогенные клоны, а жесткие (~ 25 кПа) субстраты способствовать остеогенной дифференцировки ^1. Аналогичным образом, увеличение жесткости матрицы стромальных было показано способствовать молочной эпителиальных клеток и образование опухолей вторжение в окружающие ткани ^2,3.

Особенно интересный аспект этого mechanosignРезультаты Алинг активности в процессе, известном как durotaxis, в которых клетки мигрируют преимущественно в сторону более жесткой подложке. ^4,5 Клетки постоянно ощущать физические характеристики их внеклеточной среде через рецептора интегрина связываться с ЕСМ. Это, в свою очередь, способствует накоплению многочисленных структурных и сигнальных белков в их цитоплазматических доменах для управления формирование липких структур, известных как фокальные адгезии или фокальных контактов ^6,7. Так интегрины нет присущей ферментативной активности, сигналы передаются от ECM с помощью этих вспомогательных белков координировать реакцию клетки на их изменяющейся среде ^8. Соответственно, идентификация и характеристика основных белков, участвующих в регуляции mechanosignaling и durotaxis является важной областью исследования.

Различные системы модели были разработаны для изучения durotaxis в пробирке, но большинство из нихиспользуемые коллаген-покрытием полиакриламидные субстраты ^4. Тем не менее, подготовка полиакриламидных подложек может быть технически сложной и коллаген используется в этих анализах должны быть химически сшитый с подложкой ^9. Полидиметилсилоксан (PDMS) подложки, как было показано, чтобы показать сопоставимые механические свойства в полиакриламидных ^{подложек} 10. Тем не менее, PDMS подложки получают путем простого смешивания отношение основания к сшивающего агента и эти субстраты могут быть покрыты белков ЕСМ без необходимости химической сшивки, тем самым ПДМС легче инструмент для изучения влияния жесткости на поведение клеток. Здесь мы опишем, как подготовить простую durotaxis камеру, в которой мягкий PDMS субстрат интегрированной с жесткой покровного стекла.

Анализ, как описано ниже, обеспечивает быстрый и простой способ для изучения durotaxis. Для этого исследования мы использовали U2OS клеток остеосаркомы человека в сочетании с миРНК опосредованногонокдаун cdGAP изучить роль этого белка фокальной адгезии в durotaxis ^11. Важно отметить, что этот протокол может быть легко адаптированы к индивидуальным требованиям. Другие типы клеток могут быть заменены U2OS клеток и любой белок может быть сбит или избыточно экспрессируется определить воздействие на поведение клеток при durotaxis. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для включения флуоресцентно меченных белков для анализа их динамики и поведения, используя FRAP или беспокоиться подходы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка Durotaxis палат

1. Для подготовки одного 6-луночного культурального планшета, тарирования с 50 мл коническую трубку. Взвесить примерно 10 г исходного раствора PDMS в 50-мл пробирку (решение довольно вязкая).
2. Для 90: 1 подложки (Compliance ~ 1 кПа), разделите измеренное вес базовой решения PDMS в трубке на 90, чтобы определить правильное количество сшивающего раствора необходимо. Добавить вычисленного количества сшивающего агента раствора PDMS с одной трубкой.
   Пример: 10 г / 90 = 0,11 г. Добавить 0,11 г PDMS сшивающего раствора к исходному раствору PDMS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Базовые и сшивающих решения и при условии, в комплект PDMS.
3. Энергично смешивают PDMS основание / сшивающего смесь в течение 5 мин при комнатной температуре с помощью небольшого шпателя. На этой стадии смесь будет содержать большое количество пузырьков воздуха.
4. Центрифуга PDMS подложки в настольной центрифуге в течение 5 мин при 50 мкг при комнатной температуре, чтобы удалить BUBBLES. Если есть еще пузыри после 5 мин, центрифугируют снова.
5. Пипеткой 1 мл 90: 1 PDMS субстрата в каждую лунку тканевой культуры обрабатывали 6-луночный планшет. Оставшиеся пузырьки воздуха, присутствующие в PDMS могут быть устранены на данном этапе, выталкивая их с помощью иглы 21 G. Позвольте PDMS распространяться в течение 30 мин в скважине.
6. Кипение 12 мм стекло # 1 покровные в дистиллированной воде в течение 5 мин. Повторите два раза и хранить покровные в дистиллированной воде.
7. Поместите один, сушили покровное в каждую лунку планшета для культуры ткани, осторожно касаясь одной стороны покровного стекла в раствор PDMS затем удалить покровное на PDMS. Как покровное оседает, то PDMS начнет посягать над края покровного стекла, но не будет полностью покрывать его. Это создаст интерфейс между PDMS и стекла после отверждения (рис 1а, б).
8. Инкубируйте планшет при 70 ° С в печи в течение 16 ч, чтобы вылечить (затвердевают) в PDMS. Поместите Platе в вытяжном шкафу для культивирования клеток и УФ стерилизации в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего, чтобы сделать пластины в течение пары дней использования. Тем не менее, пластины могут быть завернуты в парафильмом без буфера и хранили при 4 ° С в течение 2 недель без какого-либо заметного снижения качества.

2. Сотовый Покрытие

ПРИМЕЧАНИЕ: Если изучение влияния миРНК опосредованного нокдаун, выполните нокдаун, используя инструкции производителя или оптимизированное для протокола типа клеток выбора.

1. Шерсть друг durotaxis камеру 1 мл 10 мкг / мл фибронектина в PBS без кальция и магния в течение 1 ч при 37 ° С. В качестве альтернативы, фибронектин могут быть применены за день до анализа при инкубации с PDMS 10 мкг / мл фибронектина в PBS в течение 16 часов при 4 ° С. Убедитесь, что вся поверхность погружают в раствор фибронектина в PBS.
2. Подготовьте денатурированные нагреванием 1% BSA. Взвешивают 0,5 г BSA и растворить его в 50 мл PBS.Фильтр стерилизуют раствор через фильтр и тепла 0,22 мкм при 80 ° С в течение 12 мин.
   Примечание: Подготовка это решение за день до клеточной покрытие и магазин на 4 ° C.
3. Аспирируйте фибронектина решение и промыть 3 раза PBS. Добавить 1 мл тепла денатурированный BSA в PBS в каждую лунку и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
4. Trypsinize и рассчитывать клетки выбора в то время как durotaxis камеры блокирования теплового денатурированный BSA.
5. Пластина 1 х 10 ⁵ клеток в объеме 2 мл в каждую лунку durotaxis камеры, при использовании диска, необходимое для конкретного типа клеток выбора. Разрешить клетки придерживаться и выкладывают на подложке в течение 4 ч во влажном инкубаторе при 37 ° С с _5% СО 2.
   Примечание: U2OS клетки рутинно поддерживали в DMEM с 10% FBS, дополненной 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 10 МЕ / мл пенициллина, 10 мкг / мл стрептомицина.
   Примечание: Число клеток использовали в этом примере оптимизирован дляU2OS клетки. Оптимизация для других типов клеток может потребоваться. Эта плотность дает клеткам достаточно места, чтобы мигрировать без существенных взаимодействий с другими клетками.

3. Live-ячейки изображения

1. Выполните изображений живых клеток на инвертированный микроскоп, с помощью фазового контраста с целью 10X. Микроскоп должен быть оснащен закрытом окружающей среды, влажной камере, что позволяет контролировать температуру в 37 ° C и 5% CO ₂ в течение долгосрочного изображений.
2. После того как клетки распространились примерно 3,5 часа, собрать пластину в микроскоп камеры. Разрешить образец (ы), чтобы уравновесить в камере в течение 30 мин.
3. Настройка автоматического, мульти-точка посещения на микроскопе если таковые имеются. Фокус на границе раздела между 90: 1 и PDMS покровным стеклом и выбрать указывает на изображении вокруг интерфейса с в среднем 40 очков за durotaxis камеры. Image клетки каждые 10 мин до 16 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ReГион интерес будет выглядеть как две линии, с внешней линии, соответствующей краю покровного стекла и внутренней линии, соответствующей фактической границе между PDMS и покровное. Смотрите рисунок 1В.

Анализ данных 4.

1. Создать таблицу в таблице 1.
2. Подсчитайте количество пропускных событий из PDMS к поверхности стекла и наоборот, с каждого фильма, генерируемого. Запишите число пропускных событий в соответствующей колонке в электронной таблице Excel.
   Примечание: Событие пересечения определяется как ядро ​​клетки, проходящей по границе между PDMS и стекла в любом направлении.
3. Для количественной оценки нескольких переездов, подсчитать количество раз клетка пересекла интерфейс. Это число должны быть записаны в столбце первенствуйте соответствующей подложки, на которой был расположен сотовый в конце фильма. Повторите анализ для каждой ячейки, что пересекает интерфейс в тон фильм. Исключить клетки, которые мигрируют из поля зрения во время съемки.
   Примечание: Важно также, чтобы проверить, клеткой подсчета в начале эксперимента, что клетки могут придерживаться в равной степени к покрытой фибронектином PDMS и покровным стеклом поверхностей.
4. Рассчитывают процент клеток, которые мигрировали из PDMS с поверхности стекла (например, прошли durotaxis). Добавить номер пересечения события от мягкого до жесткого и многочисленных событий, которые закончились пропуска на жесткий и разделите на общее количество пропускных событий.
5. Рассчитывают процент многократных пересечений путем деления числа множественных пересечений на общее количество пересечений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Схема на durotaxis камере показано на фиг.1А. Мягкий ПДМС субстрат (90: 1 смесь PDMS основания к сшивающему решения) распространяется в чашке с 6 скважины и покровным стеклом помещают в верхней части PDMS, которые затем частично покрывает верхнюю поверхность покровного стекла, тем самым с?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом мы опишем простой анализ для изучения durotaxis в миграции клеток. Одним из основных преимуществ данного метода является простота подготовки durotaxis камеры, используя PDMS. Жесткость субстратов можно легко манипулировать, изменяя соотношение PDMS раствора основания, чтобы сшивающему что?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm	Fisher Scientific	12-545-82
6-well plate	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-Glutamine	Cellgro	25-005-CI
Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
Fibronectin	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
Falcon tubes	Celltreat	229456
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
U2OS cells	ATCC	HTB-96