Закапывания и фиксация методы полезны в мышь легких исследования рака

Резюме

Цель данной работы является описание простых методов, которые значительно помочь в настройке и анализа легких мышей с раком легких или других патологий. Мы представляем 3 протоколы просто и надежно выполнять инстилляций легких, фиксация и измерения объема легких.

Аннотация

Возможность привить живые агенты, клетки, или химических веществ непосредственно в легких без ранили и убивали мышей является важным инструментом в исследовании рака легких. Хотя существует несколько методов, которые были опубликованы, показывающий, как интубации мыши для измерения функции легких, ни одна из них не потенциальных проблем для быстрого трахеи инстилляции в больших когортах мышей. В настоящей работе, простой и быстрый способ описан, что позволяет следователю для проведения таких инстилляций в эффективной манере. Метод не требует каких-либо специальных инструментов или освещение и могут быть извлечены с очень небольшой практики. Она включает в себя обезболивающее мышь, делая небольшой разрез на шее, чтобы визуализировать трахею, а затем вставить внутривенный катетер непосредственно. Небольшой разрез быстро закрыл с клеем ткани, и мыши могут восстановить. Квалифицированный студент или специалист может сделать инстилляций в среднем 2 мин / мышь. После того, как тОн рак установлено, существует потребность часто для количественного анализа гистологического легких. Традиционно патологи обычно не беспокоить, чтобы стандартизировать инфляции легких во время фиксации, и анализы часто основывается на балльной системе, что может быть весьма субъективным. Хотя это может иногда быть достаточно адекватными для грубых оценок размера опухоли легких, любой собственный стереологического количественное структуры легких или клеток требует воспроизводимый процедуру фиксации и последующего измерения объема легких. Здесь мы опишем простые надежные процедуры и фиксации легкие под давлением, а затем точного измерения фиксированного объема легких. Единственное требование состоит в лабораторных весах с точностью, что это в диапазоне от 1 мг-300 г. Процедуры, представленные здесь, таким образом, может значительно улучшить способность создавать, рассматривать и анализировать рак легких у мышей.

Введение

Для ряда причин, рак легких не был широко изучен в мыши. Одной из причин этого является то, что доступ к легких очень трудно в естественных условиях, и количественный анализ основных легких обычно не делается. Методы, описанные в этой статье, предназначены для исправления этой ситуации. В данном Цели описать простые методы, которые значительно помочь в настройке и анализа легких мышей с раком легких или других патологий. В то время как ни один из этих подходов не совершенно новые, они не были представлены вместе в виде отдельных методов в упрощенном виде как описано здесь.

Там было несколько рукописей, которые, описанных методов для интубации легких мышей в первую очередь с целью ведения повтора функции легких или бронхоальвеолярного лаважа в отдельных мышей в продольных исследованиях. С этого оригинальной статье, было несколько других документов, которые описаны различные подходы к МОВе интубация ^{1 -9.} В то время как все эти методы могут быть с успехом использованы, они обычно требуют значительной подготовки, и часто не без нетривиального отказов. Кроме того, для того, чтобы проводить измерения функции легких, канюля должна соответствовать трахею достаточно плотно, так что нет утечки воздуха. Тем не менее, другой практическое применение интубации является предоставление конкретных агентов (раковые клетки или другие оскорбления) или терапевтических лекарственных средств непосредственно в легкие. Такая процедура не требует плотно прилегающую канюли ни какой-либо сложный функцию оборудование легких. Роман особенность этого способа, показанного здесь включает в себя незначительные хирургические процедуры, что позволяет интубации без возможности канюли, входящего в пищевод. Этот простой подход позволяет успешно интубации с относительно небольшим подготовки или опыта. Целых 30 мышей / час можно лечить с помощью этого подхода с отказов к нулю.

После того, как тон мышей готовы принести в жертву, поврежденные или раковые легкие могут быть удалены для гистологического и патологического анализа. Тем не менее, для того, чтобы должным образом количественно любые гистологические переменные для сравнения с другими легких, важно, чтобы стандартизировать процедуры фиксации и правильно количественно фиксированный объем легких ^10. Эта статья подробно описывает простые процедуры, позволяющие стандартизированных процедур фиксации, а также способ измерения фиксированного объема легких. Объем является важным метрики в количественной оценке гистологии, так как без такого определения объемной, только относительные плотности может быть измерена ^10. После того, как объем легких Известно, однако, абсолютные измерения клеток и других структурных измерений в легких может быть количественно.

протокол

Следующий протокол описывает систему, которая хорошо работает в 20-35 г мышей. Метод может быть легко адаптирована к большим или меньшим мышей, просто изменив размер катетера. Все протоколы животных были утверждены университета Комитета по уходу и использованию животных Джона Хопкинса по.

1. Внушение легких

1. Выберите коммерческого один дюйм длиной 20 г внутривенно канюли, чтобы использовать для интубации.
2. Измените катетера вручную сгибая ее, чтобы создать небольшое искривление на кончике, как показано на рисунке 1.
3. Обезболить мышь смесью кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (15 мг / кг) вводили IP-и подтвердить анестезии отсутствие рефлекторной движения. Применить ветеринарной мазь на глазах сразу после анестезии. Сразу же после анестезии применяются ветеринарной мазь на глаз и дать карпрофена (5-10 мг / кг SQ) для послеоперационного обезболивания и закапывания.
4. Поместите муSE на спине на наклонной платформе. Как показано на рисунке 2, большой офис связующего с шовных петель выявляются на работах отлично.
5. Бритье вентральной части шеи и чистить и дезинфицировать область шеи с 70% алкоголя. С новыми latex- и порошковым свободных перчатки, использовать хирургические инструменты дезинфицируют 70% спиртом.
6. Использование острыми ножницами сделать небольшой надрез в хирургическое шеи примерно 12 мм ниже нижнего резца.
7. С пинцетом осторожно потяните кожу на шее каудально до брюшной стенки трахеи не может быть видно.
8. Аккуратно убрать язык и вставьте канюли с загнутым кончиком наклоненной в сторону брюшной поверхности мыши. Как и в 1.4, осторожно потяните на коже в области шеи и вставьте канюлю в трахею.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После небольшой практики, катетер будет видно перемещение вниз по трахее. Если он идет в пищевод, то не будет никаких визуальных прицельной движения катетера. Нет разрезывыполнены в трахею.
9. Как только катетер видел в трахее в шее, расширенный это около 5 мм, чтобы быть надежно передается голосовые связки, но все еще значительно выше киля.
10. Подготовьте привить до 50 мкл жидкости путем инъекции, через катетер с наконечником пипетки гель загрузки. Поместите кончик в Луер хаб, но прежде, чем тщательно инъекционных взгляд, чтобы наблюдать за движением жидкости в наконечник синхронного с дыханием мыши. Тогда вводить instillate.
11. С 1 мл шприца, немедленно делают относительно быстрое надувание 0,6 мл воздуха в легкие через катетер, чтобы помочь распределить жидкость глубоко в легкие. Удалить канюлю.
12. Удалить канюлю.
13. Используйте небольшое количество клея цианакрилатного, чтобы закрыть рану небольшой хирургической согласно инструкции, вложенной в упаковку для VetBond. Место мышей в отдельных клетках и визуально контролировать их, пока они не проснутся и ведут себя нормально без указания discomfорт.

2. Фиксация легких

Примечание: После того как все экспериментальные процедуры сделаны в мыши, легкие могут быть подготовлены для гистологического обработки фиксации с формальдегидом (или любой другой желаемой фиксатора).

1. Жертвоприношение мышь с IACUC приемлемой процедуры. Для представительства мыши, показанной на видео, шейки дислокации наркозом мыши используется.
2. Выполните трахеостомия (если это еще не сделано) хирургическим путем воздействия на брюшной стороне трахеи, делая небольшой разрез, и вставив кончик иглы заглушки 18 G в трахею, и связывая его с резьбой.
3. Осторожно откройте грудную клетку с срединный разрез, срежьте диафрагму и снимите боковые стенки грудной клетки, чтобы разоблачить легкие.
4. Подключите конец Люэра иглы в резервуар на кольцевой подставке, содержащей формальдегид. Смотрите рисунок 3.
5. Установите верхнюю поверхность формальдегида 25 см выше уровня муSE. Смотрите рисунок 3. Затем убедитесь, что там нет воздуха в трубке фиксации запустив жидкость из конца краном. Подключение конец Люэра трахеи канюли с трубкой резервуара. Откройте кран, чтобы раздуть легкие с формальдегидом. Оставьте легкие под давлением, по крайней мере 20 мин.
6. Откройте кран, чтобы раздуть легкие с формальдегидом. Оставьте легкие под давлением, по крайней мере 20 мин.
7. Далее, галстук трахеи за конец заглушки иглой. Это может помочь тянуть обратно медленно на иглу, чтобы выставить больше uncannulated трахеи. Когда он связан надежно, снять кран.
8. Осторожно рассекают из легких.
9. Поместите легкие в формальдегид ночь. Более длительное время являются штраф, и пятна или процедуры могут указать конкретные раз. Кроме того, любые другие жидкие фиксаторы, такие как г-исправление может быть использован для инстилляции и погружения.
10. Перед дальнейшим гистологическим обработки, измеренияфиксированной объем легких, как описано в следующем.

3. Измерение фиксированной легких Том

1. Измерьте объем легких, используя принцип Архимеда, как показано на рисунке 4. Снимите фиксированный легких от формальдегида и анализировать сердце и любой другой не-легочную ткань.
2. Используйте ранее построенный простой самодельный провод опорное устройство, которое используется, чтобы сохранить легкие полностью под водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это устройство должно быть совместимы с какой баланс используется. Типичным устройство, показанное на фиг.5, изготовлены из пластика и пипетки тонкой (20 г) провод. Эта система хорошо работает с балансом, используемого в видео, но может быть легко адаптирована для большинства лабораторных весов.
3. Поставьте стакан с ≈200 мл воды на балансе и тары с опорной клетки на месте в воде. Смотрите рисунок 6 Снимите металлическую клетку. разместить легких на поверхности воды и под водой нажмитес клеткой.
4. Запишите вес на баланс. Это число отражает объем вытесненной воды и, таким образом, прямое измерение объема легких. Будьте осторожны, чтобы убедиться, что легкие или шов или любую часть проволоки клетке не трогать стороны или дно стакана.
5. Для точности, повторять это измерение. Удалить легких от воды, и сухой на ткани. Тары стакан с клеткой в ​​месте и повторить измерение объема легких. Два измерения объема должны быть усреднены.
   Примечание: Если легкие остаются в формалине в течение более чем примерно за неделю, воздух в легких будет растворяться в жидкости. Когда это происходит, легких будет опускаться, так что больше не нужно использовать любое устройство, как на рисунке 5, чтобы сохранить легкое водой. В таком случае объем может быть измерена простым путем проведения легкие одной из строк шовных, пока не будет полностью погружен, как показано на рисунке 4.

Результаты

Процедура описания в протоколе первого само по себе не приведет к каким-либо обобщенных результатов. Это описывает только очень надежные средства, чтобы привить вещества непосредственно в трахею. Рисунок 7 показывает пример легкого, в котором трипанового синего вливали со сп?...

Обсуждение

Процедуры, описанные здесь, имеют несколько преимуществ. Во-первых необходимое оборудование является простым и недорогим. Во-вторых, интубации может быть быстро сделано с небольшим количеством ошибок. В-третьих, возможность устранить легкие при постоянном давлении, а затем измерить ф?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors