JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Аннотация

Ход исследования пережил множество неудач в переводе нейропротекторные терапии в клинической практике. В отличие от реального мира терапия (тромболизис ТАП) редко производит преимущества в механических окклюзии на основе экспериментальных моделей, которые доминируют доклинические исследования хода. Этот раскол между скамейке и кровати предполагает необходимость использования ТАП отзывчивые модели в доклинических исследований инсульта. С этой целью, простой и ТРА-реактивного тромботической модели инсульта изобретен и описано здесь. Эта модель состоит из переходного окклюзии одностороннего общей сонной артерии и доставки 7,5% кислорода через лицевую маску у взрослых мышей в течение 30 мин, при поддержании температуры ректальное животных на 37,5 ± 0,5 ° C. Несмотря на то, обратимо лигирование сонной артерии одностороннего или гипоксии друг подавляется мозговое кровообращение лишь временно, сочетание обоих инсультов вызваны дефицитом прочного реперфузии фибрин и отложение тромбоцитов и большой infarКТ на территории средней мозговой артерии, в комплект поставки. Важно отметить, что в хвостовую вену рекомбинантного ТАП в 0,5, 1 или 4 ч после Тхи (10 мг / кг), при условии, зависящих от времени снижение уровня смертности и инфаркта размера. Эта новая модель хода проста и может быть стандартизированы по лабораториям сравнивать экспериментальные результаты. Кроме того, он вызывает тромбоз без удаление фрагментов костей черепа или введения предварительно сформированный эмболии. Учитывая эти уникальные достоинства, модель Тхи является полезным дополнением к репертуару доклинических исследований инсульта.

Введение

Тромболизис и реканализация наиболее эффективная терапия острого ишемического инсульта в клинической практике 1. Тем не менее, большинство доклинических исследований нейропротекции была выполнена в переходном механической модели обструкции (внутрипросветного шов окклюзии средней мозговой артерии), который производит быстрое восстановление мозгового кровотока после снятия окклюзии сосудов и показывает практически нет преимущества, ТАП тромболизиса. Было высказано предположение, что сомнительно выбор моделей инсульта способствовало, по крайней мере частично, с трудностью в переводе нейропротекторное терапии для пациентов 2,3. Следовательно, есть увеличение вызов для трудоустройства ТАП отзывчивые модели тромбоэмболических инсульта в доклинических исследований, но такие модели также есть технические проблемы (см Обсуждение) 4-7. Здесь мы опишем новую модель тромбо инсульта на основе одностороннего переходного гипоксически-ишемическая (Тхи) оскорбление и его ответов на внутривенное ТАП терапии 8.

Модель Тхи ход был разработан на основе процедуры Levine (постоянное лигирования одностороннего общей сонной артерии с последующим воздействием на переходном гипоксии в камере), который был изобретен для экспериментов со взрослыми крысами в 1960 году 9. Первоначальная процедура Левин канули в безвестность, потому что это производится только переменную повреждение головного мозга, но то же самое оскорбление вызвало последовательное невропатологии грызунов щенков, когда он был вновь введен Робертом Vannucci и его коллегами в модели новорожденных гипоксически-ишемической энцефалопатии (HIE) в 1981 году 10. В последние годы, некоторые Исследователи повторно адаптированы модели Левина-Vannucci взрослым мышам путем регулирования температуры в гипоксической камере 11. Вполне вероятно, что противоречивые поражения головного мозга в оригинальной методике Левина может возникнуть от колебаний температуры тела взрослых грызунов в гипоксической камере. Чтобы проверить эту гипотезу, мы изменили процедуру Левин путем введения гипоксического газачерез маску, при сохранении внутренней температуры грызунов при 37 ° С на операционном столе 12. Как и ожидалось, контроль температуры тела жесткими значительно увеличилось воспроизводимость HI-индуцированной патологии головного мозга. HI оскорбление также вызывает коагуляцию, аутофагии, и серо и белого вещества травмы 13. Другие исследователи также использовали модель HI, чтобы исследовать после инсульта воспалительные реакции 14.

Уникальной особенностью модели HI инсульта является то, что внимательно следит триаде Вирхова образования тромбов, в том числе застой кровотока, повреждения эндотелия (например, вследствие HI-индуцированного окислительного стресса), и гиперкоагуляции (активации тромбоцитов HI-индуцированной) ( 1А) 15. Таким образом, модель HI может захватить некоторые патофизиологические механизмы, имеющие отношение к реальной ишемического инсульта. С этой идеей в виду, мы далее уточнили модель HI с реверсивным перевязки ООНilateral общей сонной артерии (поэтому, чтобы создать переходный HI оскорбление), и проходят его ответов на ТАП тромболизиса с или без Edaravone. Edaravone является свободных радикалов уже одобрен в Японии для лечения ишемического инсульта в течение 24 часов в начале 9. Наши эксперименты показали, что, как краткое, как 30 мин переходный HI вызывает тромботические миокарда, и что комбинированное лечение ТАП Edaravone дает синергический эффект 8. Здесь мы описываем подробные хирургических процедур и методологические аспекты модели Thi, которые могут быть использованы для оптимизации реперфузии лечения острого ишемического инсульта.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этот протокол утвержден уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) из Университета Эмори в и следует Национальные институты здравоохранения руководящего по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Настройка

  1. Подготовка хирургического кровать на площадку потепления, связанного с тепловым насосом при температуре 37 ° С в течение не менее 15 мин до операции. Поместите рулон шеи, используя ствол 3 мл шприц на операционном кровати. Подготовка анестезии газа с 2% изофлуран в медицинской воздуха.
  2. Подготовка автоклавного щипцы, ножницы, микро иглодержатели, кровоостанавливающего, ватные тампоны и швов. Подготовка ткани клей и глазную мазь.
  3. Настройте систему гипоксия и температурные контроллеры с отопительной лампы и прямой кишки зондом. Подготовка гипоксия газ с 2% изофлуран в 7,5% O 2 уравновешивается 92,5% N 2.
  4. За один час до операции мышей analgesized путем подкожной инъекции с медленным высвобождением мелоксикам (4,0 мг / кг).
<р = класс "jove_title"> 2. Переходный гипоксии мозга, ишемия (1В)

  1. Обезболить 10-13 неделя старый мужской C57BL / 6 мышей весом от 22 до 30 г в анестезии индукции камеры с 3% изофлуран пока животное не реагирует на ноги сжать, а затем удалить волосы на правой шеи с помощью электронного бритву.
  2. Место мышей на хирургическом постели, связанной с 2% изофлуран в медицинской воздухе при скорости потока 2 л / мин. Безопасные передние растягивается вдоль шеи ролл по бокам, используя медицинскую ленту.
  3. Очистите место операции для разреза с бетадином последующим алкоголя и затем ватным тампоном.
  4. Под микроскопом рассекает, сделать 0,5 см справа шейки разрез с помощью прямых щипцов и микро ножницы около 0,2 см отвода от средней линии кожи.
  5. Используйте пару мелких зубчатых щипцов растащить фасции и ткани, чтобы выставить правильный общей сонной артерии (АРУК). Осторожно отделите АРУК от блуждающего нерва с помощью пары тонких гладких щипцов.
  6. Живая узел два нарезанные 5-0 шелковый шов (разъемную) на АРУК, а затем зашить кожу, используя 4-0 Нейлон мононити шов (рис 1в).
  7. Применить глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
  8. Быстро передавать мышей системы гипоксии и поставить нос и рот в лицевую маску с 2% изофлуран в 7,5% O 2 при скорости потока 0,5-1 л / мин в течение 30 мин.
    1. При гипоксии, использовать регуляторы температуры нагревательными лампами контролировать ректальную температуру в 37,5 ± 0,5 ° C. Монитор дыхания на 80-120 вдохов / мин. Поддержание температуры тела выше 37 ° С в течение гипоксии важно создать последовательную инфаркта головного мозга. Низкая частота дыхания, как правило, происходит после 20 мин гипоксии. Снимите лицевую маску и позволить нормальную подачу воздуха, если частота дыхания падает ниже 40. Это занимает 1-2 минут, а не рассчитывать на длительности 30 мин гипоксии.
  9. После гипоксии, трансфермышей хирургической кровати и освободить двух швов из АРУК. Закройте рану, используя ткани клей, а затем вернуться мышей в клетку. Исключить животных, если оба из двух живых сучков неожиданно освобожден после гипоксии.
  10. Монитор мышей в течение 5-10 мин, чтобы оправиться от гипоксии и анестезии. Поместите смоченную еду в клетку и вернуть его ухода за животными.
    Примечание: Животные, показывающие легкой до тяжелой поведения по кругу на 24 часов после того, как Тхи коррелируют с мозга нарушения. Большинство животных с симптомами приступов умирают до 24 ч после временной точки Тхи.

3. Лазерная спекл Контрастность изображений

Примечание: Хотя это не является существенным процедура модели Thi, двумерная система 16 контраст изображения лазерного спекл может быть использован для характеристики изменений мозгового кровотока (CBF) во время или после транзиторной ишемии-гипоксии. Чтобы немедленно документировать изменения на CBF под Тхи, запись после улEP 2.6. Кроме того, для сравнения восстановление после CBF Thi инсульта, эти процедуры могут быть выполнены после стадии 2.10.

  1. Разместить наркозом мышь в положении лежа и выполнить 1 см длиной срединный разрез на коже головы с черепом открытой, но закрытой.
  2. Монитор МК в обоих полушариях головного мозга под кровотока тепловизора в соответствии с протоколом производителя и начать немедленно записи мозговой кровоток после операции CCAO (шаг 2.6). Продолжить в течение 50 мин.
  3. Показать CBF изображение с произвольных единицах в 16-цветной палитре и анализировать в режиме реального времени выбранные регионы с помощью программного обеспечения MoorFLPI следуя инструкциям изготовителя (рисунок 2).
  4. После записи изображения CBF, закрыть головы с тканевой клей и вернуть животное к клетке.

Администрация 4. ТАП

  1. Вводите животных в хвостовую вену с растворителем или 10 мг / кг рекомбинантного ТАП (220-300 &# 956; л 1 мг / м ТАП) при 0,5, 1 или 4 ч после tCCAo плюс гипоксии (фиг.4).

5. Повреждение мозга обнаружения с несколько различных вариантов

Примечание: Для того, чтобы собрать образцы мозга, усыпить мышей через 1, 4 или 24 ч после Тхи.

  1. Метод Выполните количественного объема инфаркта по в естественных условиях 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТК) в 24 часов после того, как Тхи оскорбление как предыдущая описано. 17
    1. Внутрибрюшинно вводят животным с 1,4 М раствора маннита (~ 0,1 мл / г веса тела) за 30 минут до transcardial перфузии. Transcardial заливать мышей с PBS следуют 10 мл 2% ТТС.
    2. Удалить мозг животных с хирургическими инструментами через 10 мин и поместить в 4% параформальдегида для фиксации ночь и секции в толщиной 1 мм с vibratome.
    3. Привязать серию из четырех секционных слайдов головного мозга с помощью цифрового микроскопа и квантаримента объем инфаркта как отношение зоны инфаркта (белая область в правой части) в области неповрежденной, контралатерального полушария с помощью программного обеспечения ImageJ.
  2. Кроме того, выполнять формирование тромбоза с помощью иммунофлуоресценции на 1 ч после Тхи оскорбление.
    1. Замораживание фиксированный мозг в октябре соединения и секции мозги в 12 мкм толщиной, используя криостат.
    2. Инкубируйте мозга слайд с кроличьей анти-фибриногена антител (1: 100), следующих козьих антител против кроличьего Alexa Fluro 488 красителя (1: 200) для наблюдения флуоресценции под флуоресцентным микроскопом.
  3. Кроме того, выполнение закупорке сосуда путем инъекции в хвостовую вену 100 мкл 2% синего красителя Эванса в 4 ч после инсульта Thi.
    1. Усыпить мышей и быстро вырезать голову, чтобы удалить мозги в 4% параформальдегида после Эванса синего инъекции. Примечание: Это займет 5-10 минут для голубого Эванса обращения с синим цветом и передних и задних конечностей.
    2. Sectiна фиксированных мозги толщиной 100 мкм с использованием скользящего микротома и наблюдать флуоресценцию с помощью фильтра выбросов по 680 нм на флуоресцентного микроскопа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Двумерная лазерной спекл Контрастность изображения (LSCI) 16 был использован для сравнения изменений мозгового кровотока (CBF) на 30 мин переходного одностороннее сонной окклюзии (tCCAO), 30 мин воздействия гипоксии (7,5% кислорода), и 30 мин одностороннее сонных перевязка в условиях гипокси?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Инсульт является основной проблемой здоровья растет значение для любого общества с старение населения. В глобальном масштабе, инсульт является второй ведущей причиной смерти оценкам 5,9 млн роковых событий в 2010 году, что эквивалентно 11,1% всех случаев смерти 18. Инсульт также треть?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

None.

Благодарности

This study was supported by the NIH grant NS074559 (to C. K.). We thank all collaborators who contributed to our research articles that the present methodology report is based upon.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
adult male miceCharles RiverC57BL/6 10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia SystemVetEquip901807anesthesia
Medical air (Compressed) air tankAirgasUN1002anesthesia
IsofluranePiramal HealthcareNDC 66794-013-25anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystemSurgivetV703501hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tankAirgasUN1956hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp Cole Parmer EW-89000-10temperature controllers
Rectal probeCole Parmer NCI-00141PGtemperature controllers
Dissecting microscope Olympus SZ40surgical setup
Heat pump with warming padGaymar TP700surgical setup
Fine curved forceps (serrated)FST11370-31surgical instrument
Fine curved forceps (smooth)FST11373-12surgical instrument
micro scissorsFST15000-03surgical instrument
micro needle holdersFST12060-01surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostatsFST13008-12surgical instrument
5-0 silk suture Harvard Apparatus624143surgical supplies
4-0 Nylon monofilament sutureLOOK766Bsurgical supplies
Tissue glueAbbott LaboratoriesNC9855218surgical supplies
Puralube Vet ointmentFisherNC0138063 eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imagerMoor780-nm laser sourceLaser Speckle Contrast Imaging
MannitolSigmaM4125in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) SigmaT8877in vivo TTC
VibratomeStoelting51425brain section for in vivo TTC 
Digital microscopeDino-LiteAM2111whole-brain imaging
O.C.T compoundSakura Finetek4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488InvitrogenA11008Immunohistochemistry
CryostatVibratomeultrapro 5000brain section for IHC
Evans blueSigmaE2129Detecting vascular perfusion
MicrotomeElectron Microscopy Sciences5000brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)SigmaT48402euthanasia
Fluorescent microscopeOlympusDP73
Meloxicam SRZooPharmNSAID analgesia

Ссылки

  1. Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
  2. Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
  3. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
  4. Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
  5. Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
  6. Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
  7. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
  8. Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807(2014).
  9. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
  10. Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
  11. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
  12. Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
  13. Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
  14. Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
  15. Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
  16. Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
  17. Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
  18. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
  19. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
  20. Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
  21. Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
  22. Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
  23. Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
  24. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

102Edaravone

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены